胡迎芬，丁皓玥，魏玉西，于 斐

(1.青島大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266071；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.青島市工商行政管理局，山東 青島 266071)

綜合利用

花生粕黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取及抗氧化活性研究

胡迎芬1，丁皓玥2，魏玉西1，于 斐3

(1.青島大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266071；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.青島市工商行政管理局，山東 青島 266071)

花生粕；黃酮類(lèi)物質(zhì)；提取工藝；響應(yīng)面法；抗氧化活性

Keywords：peanut meal; flavonoids; extraction process; response surface methodology; antioxidant activity

花生是我國(guó)的主要經(jīng)濟(jì)作物之一，我國(guó)花生年產(chǎn)量為1 500多萬(wàn)t，居世界首位。我國(guó)花生的主要用途是用來(lái)榨油，花生粕為花生榨油后的副產(chǎn)物，因其蛋白質(zhì)含量較高，容易被動(dòng)物的腸胃吸收，在我國(guó)目前主要應(yīng)用于動(dòng)物飼料[1-4]。為了提高花生粕的利用價(jià)值，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)花生肽、花生白藜蘆醇等進(jìn)行了一些相關(guān)研究，從花生粕中提取生物活性肽成為了研究熱點(diǎn)。梅娜[2]、Wang[3]等用化學(xué)分析法測(cè)定了花生粕的成分，發(fā)現(xiàn)花生粕內(nèi)含有蛋白質(zhì)、油脂類(lèi)、糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、鞣質(zhì)、三萜或甾體類(lèi)化合物。李建軍等[4]報(bào)道花生粕中總黃酮含量為1.12%。黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化、抗疲勞、抗炎、鎮(zhèn)痛和保肝等重要的生物活性[4-5]。研究花生粕中的黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)綜合利用花生粕副產(chǎn)品的功能成分具有重要的意義。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)花生粕中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取及活性研究報(bào)道較少[6-7]。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化花生粕黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取工藝，并測(cè)定了花生粕黃酮類(lèi)物質(zhì)的抗氧化活性，為開(kāi)發(fā)利用花生粕黃酮類(lèi)物質(zhì)、提高花生產(chǎn)品的附加值、減少資源浪費(fèi)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

花生粕：山東青島嘉里植物油廠；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH):優(yōu)級(jí)純，美國(guó)Sigma公司；蕓香葉苷(蘆丁)：生化試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑：分析純，市售。

721G可見(jiàn)光分光光度計(jì)，TDL-5離心機(jī)，SHA-C 水浴恒溫振蕩器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

花生粕→石油醚回流脫脂→干燥→粉碎、過(guò)20目篩→溶劑提取→離心(4 000 r/min，15 min)→取上清液→黃酮類(lèi)物質(zhì)。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

基礎(chǔ)提取條件：料液比1∶5，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取溫度70.℃，提取時(shí)間120 min。在該條件下適當(dāng)調(diào)整后進(jìn)行不同料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)、提取時(shí)間(30、60、90、120、150、180、210 min)、提取溫度(40、50、60、70、80.℃)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%、95%)、提取次數(shù)(1、2、3次)的單因素試驗(yàn)。提取結(jié)束后，離心(4 000 r/min，15 min)，取上清液適當(dāng)稀釋?zhuān)瑴y(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮得率，確定各因素的最優(yōu)取值范圍。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)[8-10]

以總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取影響花生粕總黃酮得率顯著的因素，采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，優(yōu)化花生粕黃酮類(lèi)物質(zhì)提取工藝條件。

1.2.4 花生粕中總黃酮得率的測(cè)定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法[8]。以蘆丁為標(biāo)樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算總黃酮得率。

Y=m1/m2×100%

式中：Y為花生粕總黃酮得率，%；m1為花生粕提取物中總黃酮的質(zhì)量，g；m2為花生粕的質(zhì)量，g。

1.2.5 花生粕黃酮類(lèi)物質(zhì)體外抗氧化活性測(cè)定

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

以總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)可能影響花生粕總黃酮得率的料液比、提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)進(jìn)行了篩選試驗(yàn)，結(jié)果如圖1～圖5所示。

圖1料液比對(duì)總黃酮得率的影響

圖2提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

圖3提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響

圖4乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響

圖5提取次數(shù)對(duì)總黃酮得率的影響

由圖1可見(jiàn)，花生粕總黃酮得率隨料液比的增大逐漸增加，當(dāng)料液比超過(guò)1∶15后，得率無(wú)明顯變化。且溶劑量越大，濃縮成本越高。因此，選擇料液比為1∶15較適宜。由圖2可見(jiàn)，總黃酮得率隨提取時(shí)間延長(zhǎng)呈先增加再減少的趨勢(shì)，120 min后再延長(zhǎng)提取時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致部分黃酮類(lèi)物質(zhì)分解。因此，提取時(shí)間選擇120 min為宜。由圖3可見(jiàn)，提取溫度超過(guò)70.℃，總黃酮得率開(kāi)始下降，可能與長(zhǎng)時(shí)間高溫提取，部分黃酮類(lèi)物質(zhì)被破壞有關(guān)。因此，提取溫度為70.℃較適宜。乙醇體積分?jǐn)?shù)不同，極性不同，而黃酮種類(lèi)不同，極性也不相同。由圖4可見(jiàn)，乙醇的體積分?jǐn)?shù)為60%較適宜。由圖5可見(jiàn)，隨提取次數(shù)的增加，花生粕總黃酮得率增加，但增幅不大?？紤]到實(shí)際操作的可行性及節(jié)約成本，選擇提取次數(shù)為1次。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在固定料液比為 1∶15、提取次數(shù)1次的試驗(yàn)條件下，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，考察提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)以及乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)這3個(gè)因素對(duì)花生粕總黃酮得率(Y)的影響，優(yōu)化花生粕黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1，響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

由統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.0對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到Y(jié)與A、B、C 3個(gè)因素的二次回歸方程：Y=-5.633 37+0.088 30A+0.718 35B+0.099 97C-0.003 47AB-0.000 29AC+ 0.001 71BC-0.000 45A2-0.163 42B2-0.000 68C2。

表3為花生粕總黃酮得率回歸模型的方差分析結(jié)果。由表3可見(jiàn)，模型P<0.000 1，說(shuō)明方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系顯著，該回歸模型顯著可靠。模型R2=98.33%，說(shuō)明該模型可以解釋98.33%的試驗(yàn)所得到花生粕總黃酮得率的變化。模型失擬項(xiàng)P=0.202 5，不顯著，說(shuō)明模型選擇合適，因此可以用該模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)花生粕總黃酮得率隨各參數(shù)的變化規(guī)律。由P值可知，提取溫度、提取時(shí)間對(duì)花生粕總黃酮得率的影響極顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)影響顯著。提取溫度與提取時(shí)間、提取溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)兩因素的交互作用顯著和極顯著。

表3 回歸方程方差分析結(jié)果

注：**差異極顯著(P<0.01); *差異顯著(P<0.05)。

2.2.3 最佳提取條件的確立與驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆治?，得到提取花生粕黃酮類(lèi)物質(zhì)的最佳條件為提取時(shí)間104.38 min、提取溫度72.68.℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)59.98%，總黃酮得率的預(yù)測(cè)值為1.199%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將提取條件調(diào)整為提取時(shí)間100 min、提取溫度70.℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，經(jīng)3次平行試驗(yàn)，測(cè)定總黃酮得率平均值為1.197%，與理論預(yù)測(cè)值相比相對(duì)誤差在1%以?xún)?nèi)。因此，本試驗(yàn)?zāi)Ｐ团c實(shí)際情況擬合較好，提取花生粕黃酮類(lèi)物質(zhì)的最佳工藝參數(shù)具有較高的可行性和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 花生粕黃酮類(lèi)物質(zhì)的抗氧化活性

2.3.1 對(duì)DPPH·的清除能力(見(jiàn)圖6)

圖6 對(duì)DPPH·的清除能力

由圖6可見(jiàn)，隨著花生粕黃酮類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量濃度的增大，對(duì)DPPH·的清除率逐漸增加，其IC50為25.0 μg/mL?；ㄉ牲S酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)DPPH·的清除能力與TBHQ相近，但低于VC。

2.3.2 對(duì)·OH的清除能力(見(jiàn)圖7)

圖7 對(duì)·OH的清除能力

·OH是活性氧中活性最強(qiáng)的一種自由基，可與細(xì)胞內(nèi)的一切有機(jī)化合物反應(yīng)，通過(guò)破壞脂肪、蛋白質(zhì)和核酸代謝來(lái)?yè)p傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致機(jī)體病變。由圖7可見(jiàn)，花生粕黃酮類(lèi)物質(zhì)在0～30 μg/mL范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增大，對(duì)·OH的清除率逐漸增加，其IC50為24.5 μg/mL。對(duì)·OH的清除效果為VC>花生粕黃酮類(lèi)物質(zhì)>TBHQ。

圖8 對(duì)的清除作用

3 結(jié) 論

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Extractionofflavonoidsfrompeanutmealanditsantioxidantactivity

HU Yingfen1,DING Haoyue2,WEI Yuxi1,YU Fei3

(1.College of Life Sciences,Qingdao University,Qingdao 266071，Shandong，China；2.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；3.Administration for Industry & Commerce of Qingdao,Qingdao 266071，Shandong，China)

TS229;TQ645.9

A

1003-7969(2017)09-0141-04

2016-08-21；

2017-02-06

山東省科技廳發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(2014GSF120011)

胡迎芬(1962)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用及功能性研究(E-mail)qingdahyf2006@163.com。