覃海媚，王榮，王春芳，韋葉生，王茂水，王新鋒，王俊玲，王俊利

（1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 百色 533000；3. 山東省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，濟(jì)南 250013）

FCM-DNA分析和SOD檢測(cè)在惡性和結(jié)核性胸腔積液鑒別診斷中的作用

Differential Diagnosis Using FCM-DNA Analysis and SOD in Malignant and Tuberculous Pleural Effusion

覃海媚1，王榮2，王春芳2，韋葉生2，王茂水3，王新鋒3，王俊玲3，王俊利1

（1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 百色 533000；3. 山東省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，濟(jì)南 250013）

對(duì)150例胸腔積液標(biāo)本利用流式細(xì)胞術(shù)DNA（FCM-DNA）分析及酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）。結(jié)果顯示，細(xì)胞學(xué)、FCM-DNA分析及SOD檢測(cè)惡性和結(jié)核性胸腔積液的準(zhǔn)確度分別為80.7%、88.7%、62.0%，細(xì)胞學(xué)聯(lián)合FCM-DNA分析或SOD檢測(cè)的準(zhǔn)確度分別為97.3%和92.0%。 FCM-DNA分析和SOD檢測(cè)均可作為細(xì)胞學(xué)的重要輔助手段，細(xì)胞學(xué)聯(lián)合SOD檢查可降低費(fèi)用。

FCM-DNA分析； 超氧化物歧化酶； 胸腔積液，鑒別

惡性腫瘤和結(jié)核病是引起胸腔積液的主要原因，惡性和結(jié)核性胸腔積液鑒別診斷是臨床上一個(gè)棘手的問題。一直以來，細(xì)胞學(xué)檢查是鑒別惡性和結(jié)核性胸腔積液的重要手段之一，但其靈敏度很低。研究［1-2］發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞術(shù)DNA（flow cytometry，F(xiàn)CM-DNA）分析鑒別診斷胸腔積液性質(zhì)的靈敏度和特異度均較高，可作為診斷胸腔積液性質(zhì)的重要參考。但FCM-DNA分析費(fèi)用較昂貴，不利于臨床普及。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種抗氧化酶，催化超氧離子轉(zhuǎn)化成過氧化物和氧氣，SOD檢測(cè)主要應(yīng)用于缺血、出血性心腦等重要臟器損傷。已有研究［3］表明SOD是鑒別惡性和結(jié)核性胸腔積液的重要診斷指標(biāo)。本研究評(píng)價(jià)細(xì)胞學(xué)、FCMDNA分析及SOD檢測(cè)3種方法在惡性和結(jié)核性胸腔積液中鑒別診斷價(jià)值，旨在選出準(zhǔn)確度高且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的聯(lián)合診斷指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2015年9月至2016年10月右江民族醫(yī)學(xué)院細(xì)胞室檢查的150例胸腔積液標(biāo)本，其中女70例，男80例，年齡18～80歲，中位年齡56.5歲。150例標(biāo)本均經(jīng)過病理學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)或結(jié)合臨床確診，其中惡性胸腔積液70例：肺癌40例，肝癌10例，胃癌6例，胰腺癌5例，賁門癌3例，乳腺癌3例，卵巢癌2例，惡性胸膜間皮瘤1例；結(jié)核性胸腔積液80例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

收集入院24 h內(nèi)未經(jīng)治療患者的新鮮胸腔積液（約200 mL），50 mL胸腔積液離心后制成細(xì)胞片進(jìn)行常規(guī)巴氏染色用于細(xì)胞學(xué)檢查，50 mL胸腔積液備用于FCM-DNA分析，100 mL胸腔積液用于SOD檢測(cè)。

1.2.1 細(xì)胞學(xué)檢查：由3位細(xì)胞學(xué)診斷專家盲法閱片后判定結(jié)果。如存在疑惑，再由3位細(xì)胞病理學(xué)專家會(huì)診判定。診斷結(jié)果分為2種：（1）見到癌細(xì)胞為惡性胸腔積液；（2）未見癌細(xì)胞為惡性胸腔積液。

1.2.2 FCM-DNA分析標(biāo)本制備及檢測(cè)：（1）單細(xì)胞懸液制備。取50 mL胸腔積液標(biāo)本1 500 r/min離心5 min，用0.9%的NaCl 洗滌制備好的脫落細(xì)胞2次，再用70%乙醇固定4 h。（2）經(jīng)Flow-Check 校準(zhǔn)儀器的光路（HalfCV＜ 2%），再用淋巴細(xì)胞質(zhì)控品（CYTO-TROL）校正儀器，確保質(zhì)控的結(jié)果控制在參考范圍內(nèi)。（3）標(biāo)本上機(jī)前用PBS緩沖液洗滌3次，使細(xì)胞濃度約為1×106/mL，再300目篩網(wǎng)過濾，除去細(xì)胞懸液中成團(tuán)的細(xì)胞群，經(jīng)1 000 r/min 離心5 min，棄去上清液。最后加入碘化丙啶（PI）染液（1 mL/管） 4 ℃下避光30 min。（4）采用流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司，F(xiàn)ACSCantoⅡ）進(jìn)行細(xì)胞周期分析。用健康人群的外周血淋巴細(xì)胞作為DNA中正常二倍體的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，采用Multicycle軟件（Pheonix公司）分析細(xì)胞周期時(shí)相。以DNA指數(shù)（DNA index，DI）表示細(xì)胞核DNA含量，即DI=樣品細(xì)胞的G0/G1峰均道值/正常淋巴細(xì)胞的G0/G1峰均道值。

根據(jù)文獻(xiàn)［4］制定FCM診斷瘤細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)：（1） 除外正常二倍體 G0/G1峰出現(xiàn)的另一個(gè)G0/G1峰作為標(biāo)準(zhǔn)，DI值＞1.10 或＜0.90，且出現(xiàn)相應(yīng)的G2/M峰。（2） 若在直方圖中僅出現(xiàn)單一的G0/G1峰，則要求在細(xì)胞周期中的G2/M＞2.5%；G0/G1峰的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）比值超過正常CV比值的平均值2倍的標(biāo)準(zhǔn)差。（3） G0/G1峰出現(xiàn)明顯不對(duì)稱。（4） S期＞10%。符合以上任一項(xiàng)即為異倍體。

1.2.3 SOD檢測(cè)：將100 mL胸腔積液置于低速離心機(jī)1 200 r/min，離心15 min，收集500 μ L上清液于EP管中，立即入-80 ℃中凍存?zhèn)溆?，在酶?lián)免疫吸附試驗(yàn)設(shè)備（美國(guó)伯樂化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)）檢測(cè)SOD的水平。根據(jù)前期研究［5］測(cè)定SOD在胸腔積液中的診斷點(diǎn)，以SOD含量＞41 U/L為陽性計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2組率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞學(xué)和SOD檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞學(xué)檢查在惡性和結(jié)核性胸腔積液中的準(zhǔn)確度為80.7%。經(jīng)SOD檢測(cè)，70例惡性胸腔積液中發(fā)現(xiàn)43例陽性，80例結(jié)核性胸腔積液中50例為陰性，檢測(cè)準(zhǔn)確率為62.0%。見表1。

2.2 FCM-DNA分析結(jié)果

表1 惡性和結(jié)核性胸腔積液細(xì)胞學(xué)、FCM-DNA及SOD檢測(cè)結(jié)果

70例惡性胸腔積液細(xì)胞發(fā)現(xiàn)58例為異倍體，主要為超二倍體。80例結(jié)核性胸腔積液細(xì)胞發(fā)現(xiàn)75例為正常二倍體，其余5例為超二倍體。DNA倍體分析檢測(cè)惡性和結(jié)核性胸腔積液的準(zhǔn)確度為88.7%，見表1、圖1。

2.3 FCM-DNA分析、SOD 檢測(cè)聯(lián)合細(xì)胞學(xué)的結(jié)果

FCM-DNA分析、SOD檢測(cè)與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合分析，以2個(gè)方法中出現(xiàn)1個(gè)實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)陽性即診斷為陽性（+）；以2個(gè)方法中出現(xiàn)1個(gè)陰性即診斷為陰性（-）。細(xì)胞學(xué)聯(lián)合FCM-DNA分析的準(zhǔn)確率為97.3%；細(xì)胞學(xué)聯(lián)合SOD檢測(cè)的準(zhǔn)確率為92.0%；2者比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。見表2。

3 討論

圖1 胸腔積液脫落細(xì)胞 FCM-DNA分析

表2 FCM-DNA分析、SOD 檢測(cè)聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果

近年來，邢應(yīng)如等［6］研究表明，F(xiàn)CM-DNA分析對(duì)惡性胸腔積液的診斷具有良好的臨床價(jià)值；王應(yīng)霞等［7］通過研究液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)聯(lián)合DNA倍體分析在良惡性胸腹水鑒別診斷中的應(yīng)用價(jià)值，發(fā)現(xiàn)2者聯(lián)合診斷后可明顯提高惡性胸腹水的陽性診斷率。本實(shí)驗(yàn)通過評(píng)價(jià)細(xì)胞學(xué)、FCM-DNA和SOD 3種指標(biāo)在鑒別診斷惡性和結(jié)核性胸腔積液中的應(yīng)用價(jià)值，發(fā)現(xiàn)FCM-DNA分析的準(zhǔn)確度高，達(dá)到88.7%；細(xì)胞學(xué)聯(lián)合FCM-DNA分析的準(zhǔn)確度為97.3%，與上述學(xué)者的研究結(jié)果相符。在結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)物濾液蛋白中，SOD是最大的分泌蛋白之一，秦立龍［8］研究SOD聯(lián)合腺苷脫氨酶檢測(cè)在結(jié)核性胸腔積液中的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)SOD 聯(lián)合檢測(cè)對(duì)早期結(jié)核病有較高的診斷應(yīng)用價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)單純SOD檢測(cè)的準(zhǔn)確度為62.0%，與細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合的準(zhǔn)確度為92.0%，與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合FCM-DNA分析的準(zhǔn)確度相當(dāng)，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。

綜上所述，細(xì)胞學(xué)聯(lián)合FCM-DNA分析對(duì)惡性和結(jié)核性胸腔積液鑒別診斷的準(zhǔn)確性最好，但費(fèi)用昂貴，給患者增加負(fù)擔(dān)。因此，細(xì)胞學(xué)聯(lián)合SOD檢測(cè)作為惡性和結(jié)核性胸腔積液鑒別診斷方法，準(zhǔn)確率高、簡(jiǎn)便、費(fèi)用低、更適用于臨床。當(dāng)然，后期仍需要進(jìn)一步證實(shí)SOD在胸腔積液的診斷點(diǎn)，從而驗(yàn)證細(xì)胞學(xué)聯(lián)合SOD檢測(cè)指標(biāo)的準(zhǔn)確度。性腫瘤價(jià)值的Meta分析［J］. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，44（02）：136-142.

［1］ 胡艷芬，陳龍，荊超，等. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DNA倍體數(shù)對(duì)鑒別良惡

［2］ 王俊利. DNA倍體分析聯(lián)合多項(xiàng)腫瘤標(biāo)記物測(cè)定對(duì)良惡性胸腹水的鑒別診斷價(jià)值［D］. 廣西醫(yī)科大學(xué)，2008.

［3］ WANG M，ZHANG Z，WANG X. Superoxide dismutase 2 as a marker to differentiate tuberculous pleural effusions from malignant pleural effusions［J］. Clinics，2014，69（12）：799-803. DOI：10.6061/clinics/2014（12）02.

［4］ 王俊利，農(nóng)樂根，楊鳳蓮，等. DNA定量分析法聯(lián)合癌胚抗原測(cè)定在良惡性胸水鑒別診斷中的應(yīng)用［J］. 廣西醫(yī)學(xué)，2012，34（1）：29-32.

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［8］ 秦立龍. SOD聯(lián)合檢測(cè)在胸部結(jié)核病中的診斷價(jià)值［D］. 皖南醫(yī)學(xué)院，2015.

（編輯 武玉欣）

R52；R730.4

B

0258-4646（2017）10-0946-03

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170927.1457.042.html

10.12007/j.issn.0258‐4646.2017.10.021

百色市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃（20121603）

覃海媚（1991-），女，碩士研究生.

王俊利，E-mail：13907768146@163.com

2017-01-20

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-09-27 14:57