龐智寅，張云鶴，張濤，楊穎，付愛軍，李建民，楊群福

（1.華北理工大學附屬醫(yī)院 神經外科，河北 唐山 063000；2.河北醫(yī)科大學附屬邢臺市人民醫(yī)院 神經外科，河北 邢臺054000）

MicroRNA-25表達下調對神經膠質瘤U87細胞增殖與凋亡的影響

龐智寅1，張云鶴1，張濤2，楊穎2，付愛軍1，李建民1，楊群福2

（1.華北理工大學附屬醫(yī)院 神經外科，河北 唐山 063000；2.河北醫(yī)科大學附屬邢臺市人民醫(yī)院 神經外科，河北 邢臺054000）

目的探討microRNA-25（miR-25）表達下調對神經膠質瘤U87細胞增殖與凋亡的影響，以及miR-25與B細胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2）在膠質瘤細胞增殖與凋亡過程中的調節(jié)作用。方法通過慢病毒介導反義miR-25寡聚核苷酸轉染U87細胞；分為3組，實驗組（轉染anti-miR-25）、對照組（轉染negative control）和空白組（空白PBS）；實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測miR-25和Bcl-2的mRNA表達水平；CCK-8法檢測細胞增殖情況；流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡。結果實驗組miR-25和Bcl-2的mRNA表達量與空白組和對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），實驗組降低；實驗組相對于空白組和對照組，細胞增殖活性降低，細胞周期延緩，細胞凋亡率升高。結論在膠質瘤U87細胞，miR-25表達下調通過作用于Bcl-2靶基因，延緩細胞周期，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。

神經膠質瘤；microRNA-25；B細胞淋巴瘤/白血病-2基因；增殖；凋亡

Abstract:ObjectiveTo study the effect of down-regulation of miR-25 expression on the proliferation and apoptosis of glioma U87 cells,and the regulatory effect of miR-25 and its target geneBcl-2on the proliferation and apoptosis process of glioma cells.MethodsU87 cells were transfected by lentiviral-mediated antisense miR-25 oligonucleotides.In the experiment groups(transfected with anti-miR-25),control groups(transfected with negative control)and blank groups(blank PBS),RT-PCR was used to detect the mRNA expression levels of miR-25 andBcl-2,CCK method was used to detect cell proliferation,flow cytometry was used to detect the cell cycle and apoptosis.ResultsThe mRNA expression levels of miR-25 andBcl-2in the experiment groups were lower than those in the the blank groups and the control groups,the differences were statistically significant(P＜0.05).Compared with the blank groups and the control groups,the cell proliferation activity was decreased,the cell cycle was delayed and the apoptosis rate was increased in the experiment groups.ConclusionsIn glioma U87 cells,down-regulation of miR-25 expression delays cell cycle,inhibits cell proliferation,and promotes apoptosis by targetingBcl-2gene.

Keywords:glioma；miR-25；Bcl-2；proliferation；apoptosis

神經膠質瘤是最常見的顱內腫瘤，約占顱腦腫瘤的40%～50%以上。由于膠質瘤具有增殖快、易轉移復發(fā)、惡性程度高等特點，手術治療無法完全切除，并且由于血腦屏障的限制，抗腫瘤藥物無法有效進入中樞神經系統(tǒng)，即使放化療聯(lián)合使用，效果仍不理想[1]。所以探索新的治療方法迫在眉睫，基因治療成為目前腦膠質瘤研究的熱點[2]。微小RNA（microRNA，miR）是一類大小約為22nt的內源性、非編碼小RNA，其可通過不同信號通路參與多種腫瘤的形成與發(fā)展，通過表達的上調或下調，起到癌基因或抑癌基因的作用。microRNA-25（miR-25）是microRNA家族中的重要成員之一，是一種癌基因，已有文獻報道其在多種惡性腫瘤中呈高表達[3-7]。本研究旨在通過轉染反義miR-25寡聚核苷酸，以揭示下調miR-25的表達對膠質瘤U87細胞增殖與凋亡的影響，及進一步探討其對B細胞淋巴瘤/白血病-2基因（B-cell lymphoma/Leukemia-2，Bcl-2）的調控機制，從而尋找新的基因靶點，為腦膠質瘤的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人神經膠質瘤U87細胞系訂購于中國醫(yī)學科學院上海細胞庫，FBS、DMEM培養(yǎng)基、Trizol試劑和PCR試劑盒均購自美國Invitrogen公司，Annexin-VFITC/PI試劑盒購自（杭州聯(lián)科生物公司），CCK-8試劑盒購自北京天恩澤基因公司。從miRNAs目標靶基因數據庫獲得miR-25基因序列，委托上海吉瑪基因公司設計合成慢病毒介導載體，并攜帶RFP基因標記的紅色熒光，miR-25反向序列（anti-miR-21）：5'-UCAACAUCAGUCUGAUAAGC UA-3'及無義序列（negative control）：5'-UCUACUCUUUCUAGG AGGUUGUGA-3'。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)U87細胞 人神經膠質瘤U87細胞用含10%FBS、1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，約1～2 d即可長滿瓶底，當細胞生長匯合至80%時可進行消化傳代。

1.2.2 細胞分組和轉染 取生長良好的對數生長期細胞，常規(guī)消化制成單細胞懸液，以2×105～6×105個密度接種于6孔板中，實驗分為：實驗組（轉染anti-miR-25），對照組（轉染negative control）和空白組（空白PBS）。實驗組和對照組參照吉瑪慢病毒轉染說明書操作，加入轉染試劑和相應的慢病毒載體，空白組加入同等量的PBS，轉染后常規(guī)培養(yǎng)，48 h后置于激光共聚焦顯微鏡下根據紅色熒光率觀察轉染效率。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測mRNA表達 按本實驗分組和轉染操作，轉染48 h后，取對數生長期細胞，常規(guī)消化制成單細胞懸液，Trizol說明書提取各組細胞總RNA，分光光度計定量檢測RNA濃度及純度，RNA濃度調整為500 ng/μl，M-MLV逆轉錄酶逆轉錄反應合成cDNA后，SYBR試劑盒行PCR擴增反應。引物序列：miR-25正向：5'-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3'，反向：5'-TGC TCATTGCACTTGTCTC-3'，擴增長度為326 bp；Bcl-2正向：5'-GCATGACTTCTCCCGCCTGTACCGT-3'，反向：5'-ACCTTAGCTGGCGCCGTACTGTTCT-3'，擴增長度為320 bp；GAPDH為內參基因，正向：5'-GATG CTGCGACTGGTCCA-3'，反向：5'-CTGCAGCAGCTA TGAACCTC-3'，擴增長度為368 bp，進行PCR擴增反應，PCR反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性15 s，57℃退火25 s，72℃延伸30 s，總共40個循環(huán)后，再72℃終末延伸10 min，對實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）的結果采用相對定量Ct法分析。

1.2.4 CCK-8法檢測各組細胞增殖 轉染48 h后，各組均消化制成單細胞懸液，以每孔2×105個/ml的細胞密度接種于無菌24孔板中，并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h更換1次完全培養(yǎng)液；連續(xù)培養(yǎng)3 d，每隔1天每組各取12孔，每孔均更換500μl新的培養(yǎng)基，并加入50μl CCK-8溶液，將24孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h；在24孔板各孔中吸取100μl上清并依次加至96孔板各孔中；在波長490 nm處用酶標儀檢測96孔板各孔光密度（OD）值。

1.2.5 流式細胞術分析細胞周期 轉染48 h后，取對數生長期細胞，消化制成單細胞懸液，收集至1.5 ml EP管中，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌2次加入預冷70%乙醇1 ml懸浮細胞，4℃固定細胞20 h以上，離心去除乙醇，PBS洗滌2次，離心去除上清液，加入500μl PI染色液，4℃下避光40 min以上。離心PBS重懸細胞，400目濾網過濾細胞懸液，經FACS流式細胞儀系統(tǒng)檢測，Modifit軟件計算DNA指數和各期細胞的百分數。

1.2.6 流式細胞術分析細胞凋亡 轉染48 h后，各組細胞消化成單細胞懸液，收集至1.5 ml EP管中，4℃，1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS重懸細胞并計數，調節(jié)細胞懸液濃度為1×105個/ml，取195μl細胞懸液。加入500μl Buffer懸浮細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入5μl AnnexinV-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入10μl PI，避光預冷4℃孵育10 min后，1 h內行流式細胞儀檢測，Modifit軟件分析結果。

1.3 統(tǒng)計學方法

運用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，結果以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析和重復測量設計的方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞轉染率

根據慢病毒載體攜帶RFP標記的紅色熒光，發(fā)射光波長520 nm，激發(fā)光波長48 nm，利用奧林巴斯FV-1000軟件進行圖像觀察，判斷轉染效率，激光共聚焦顯微鏡可見熒光率可達90%以上（見圖1），說明轉染率高。

圖1 慢病毒介導轉染效率 （激光共聚焦顯微鏡×400）

2.2 各組細胞miR-25和Bcl-2的mRNA表達水平

各組miR-25和Bcl-2的mRNA相對表達量見表1，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），各組miR-25和Bcl-2的表達量有差別；空白組miR-25和Bcl-2的mRNA表達量較高，進一步兩兩比較顯示，與空白組相比，對照組miR-25和Bcl-2的mRNA表達量數值間差異無統(tǒng)計學意義（t=25.320和20.314，P=0.065和0.083），與空白組相比，實驗組miR-25和Bcl-2的mRNA表達量均降低（t=26.328和30.502，均P=0.000）。

表1 各組miR-25和Bcl-2 mRNA的表達量比較（n=6，±s）

表1 各組miR-25和Bcl-2 mRNA的表達量比較（n=6，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與空白組比較，P＜0.05

2.3 各組細胞增殖活性

各組細胞在24、48、72 h的OD值見表2。采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點間細胞增殖能力有差別（F=43.035，P=0.000），隨培養(yǎng)時間延長，其OD值逐漸增大，細胞增殖能力逐漸增強。②各組間細胞增殖能力有差別（F=30.330，P= 0.000），實驗組相較于對照組和空白組細胞增殖能力逐漸降低；對照組和空白組之間細胞增殖能力差別不大。③實驗組與對照組和空白組細胞增殖能力變化趨勢有差別（F=17.024，P=0.001）。

表2 不同時間點各組細胞OD值比較（n=6，±s）

表2 不同時間點各組細胞OD值比較（n=6，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與空白組比較，P＜0.05

組別48 h 0.14±0.521）2）0.36±0.231）2）0.13±0.45 0.40±0.35空白組72 h實驗組 0.52±0.121）2）對照組 0.82±0.5324 h0.15±0.06 0.46±0.25F值 1.426 2.568 1.118P值 0.022 0.013 0.002 0.90±0.60

2.4 各組細胞周期分布情況

各組細胞周期的分布情況見圖2。空白組、對照組和實驗組的各組細胞分布：G0/G1期分別為（54.38±1.96）、（53.06±2.55）和（70.12±1.83）；S期分別為（33.82±4.15）、（36.06±1.45）和（23.62±1.10）；G2/M期分別為（11.82±2.65）、（10.96±1.95）和（6.35±0.83）。實驗組細胞周期主要分布于G0/G1期，少部分處于S期和G2/M期。實驗組G0/G1期的細胞比例與對照組和空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=29.550，P=0.015），實驗組高；S期和G2/M期的細胞比例與對照組及空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=23.290，P=0.001；F=26.459，P=0.000），實驗組低；空白組和對照組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（F=32.116，P=0.085）。說明下調miR-25的表達可降低U87細胞S期、G2/M期細胞的比例，延緩細胞周期的進展，抑制U87細胞增殖。

2.5 各組細胞凋亡情況

流式細胞術檢測細胞凋亡的結果顯示，空白組、對照組和實驗組的細胞凋亡率分別為（2.78±0.32）%、（3.12±0.25）%和（10.56±0.06）%（見圖3）。實驗組細胞凋亡率大于空白組和對照組。實驗組細胞的凋亡率與空白組和對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=11.065，P=0.005）；而空白組和對照組之間差異無統(tǒng)計學意義（F=15.131，P=0.064）。說明通過慢病毒介導miRNA-25表達的下調，可提高腦膠質瘤U87細胞的凋亡率，促進細胞凋亡。

圖2 各組細胞周期分布情況

圖3 各組細胞凋亡情況

3 討論

神經膠質瘤是最常見的顱內惡性腫瘤，起源于神經間質細胞和神經實質細胞。發(fā)病年齡為30～40歲之間，惡性程度高，具有高度侵襲和浸潤性，手術難以切除干凈，由于血腦屏障的限制，放化療對膠質瘤治療效果不佳，使得神經膠質瘤成為最難治愈的腫瘤之一[8]。雖然近年來手術和放療等技術有很大的進步，但腦膠質瘤病人的平均生存時間只有1.0～ 1.5年，患者幾乎均死于腫瘤復發(fā)、局部擴散和轉移[9]?？傮w上說，神經膠質瘤具有發(fā)病率、復發(fā)率、死亡率高和治愈率低的“三高一低”特點[10]。研究認為腦膠質瘤形成主要是通過不同機制對多基因表達及其信號通路的異常調控來完成。因此，膠質瘤的基因治療成為目前研究的熱點。本研究試圖尋找針對神經膠質瘤形成和發(fā)展的作用調控靶點，為神經膠質瘤的靶向治療提供新思路。

miR是一類長度為21～25 nt的非編碼RNA，通過降解靶mRNA或翻譯抑制起到基因表達調控作用。研究表明miR在細胞的分化、增殖、遷移、凋亡等生物學行為過程中發(fā)揮重要作用，并參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移。近年來miR在腦膠質瘤中的作用機制也逐漸被人們所了解。有研究利用基因芯片分析腦膠質瘤組織及其細胞系的相關miR表達，發(fā)現在膠質瘤細胞中miR表達上調的癌基因有23種（如miR-21、miR-221/222、miR-25），另有 34種 miR表達下調的抑癌基因 （如miR-125b、miR-251）[11]。miR-25屬于miR-106b-25家族，目前，有研究報道m(xù)iR-25在惡性腫瘤中表達普遍上調，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增殖和轉移密切相關[12]。有研究運用實時定量PCR方法檢測不同腦膠質母細胞瘤細胞系及不同病理級別膠質瘤中miR-25基因的表達水平，結果發(fā)現miR-25在膠質瘤中表達呈不同程度增高，并與膠質瘤的WHO病理分級呈正相關[13]。有研究發(fā)現miR-25在肝癌中異常高表達，而下調miR-25可以抑制肝癌細胞的周期進展，G1期細胞比例增加[14]，上調miR-25的表達則可以促進BE食管細胞和肺成纖維細胞的增殖速率[15]。本實驗通過慢病毒介導反義miR-25寡聚核苷酸轉染腦膠質瘤U87細胞。結果發(fā)現，轉染反義miR-25寡聚核苷酸的實驗組miR-25 mRNA表達量相較于空白組和對照組下調，實驗組細胞增殖活性降低，細胞周期延緩，細胞凋亡率增加。說明下調miR-25的表達可抑制神經膠質瘤U87細胞增殖，延緩細胞周期，促進細胞凋亡。

Bcl-2是抗調亡蛋白，屬于調節(jié)調亡的蛋白質家族。它在細胞凋亡進程中發(fā)揮關鍵作用。Bcl-2的過表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。UCHIDA等[16]研究發(fā)現使用Bcl-2反義核甘酸序列抑制Bcl-2表達后可以抑制腎癌細胞的增殖并誘導調亡，提示Bcl-2的反義序列可以用于腎癌的治療。目前研究發(fā)現多種miR可通過調節(jié)Bcl-2的表達而起到抑制腫瘤細胞增殖并誘導調亡的作用。CHEN[17]等通過瞬時轉染技術研究發(fā)現miR-181a可通過對Bcl-2的靶向調節(jié)作用而增加U87MG惡性膠質瘤對放療的敏感性。NAN等[18]發(fā)現用miR-451寡核苷酸模擬物轉染U251、A172和LN229等膠質瘤細胞后，Bcl-2表達均下調。本實驗通過轉染反義miR-25寡聚核苷酸轉染入腦膠質瘤U87細胞。結果發(fā)現，轉染反義miR-25寡聚核苷酸的實驗組Bcl-2 mRNA表達量相較于空白組和對照組下調，并且實驗組細胞增殖活性降低，細胞周期延緩，細胞凋亡率增加。說明Bcl-2是miR-25的作用靶點，下調miR-25表達可作用于Bcl-2靶基因抑制U87細胞增殖，延緩細胞周期，促進細胞凋亡。

綜上所述，通過下調miR-25的表達，可抑制神經膠質瘤U87細胞增殖和促進細胞凋亡，miR-25對神經膠質瘤細胞有著重要的調控作用，miR-25有望成為神經膠質瘤診斷和治療的新目標靶點。但目前miR與神經膠質瘤的相關研究仍處于初級階段，目前miR在細胞分子水平對神經系統(tǒng)的致瘤作用有一定的研究，但其在動物實驗研究較少，臨床實驗研究更是空白，此外，由于神經系統(tǒng)存在血腦屏障，如何保證藥物的有效運輸、靶向定位及安全效應都需要進一步科學研究。不過隨著首個miR靶向治療藥物（LNA-AntimiRTM-122）進入2期臨床試驗，miR在人類疾病的治療中邁出了重要的一步，隨著不斷深入的研究，其在神經系統(tǒng)腫瘤的診斷方法、治療手段和檢測預后等也必將發(fā)揮更為重要的作用，表現出更加廣闊的應用前景。

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（張蕾 編輯）

Effect of down-regulation of miR-25 expression on proliferation and apoptosis of glioma U87 cells

Zhi-yin Pang1,Yun-he Zhang1,Tao Zhang2,Ying Yang2, Ai-jun Fu1,Jian-min Li1,Qun-fu Yang2
(1.Department of Neurosurgery,the Affiliated Hospital,North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China；2.Department of Neurosurgery,the Affiliated Xingtai People's Hospital,Hebei Medical University,Xingtai,Hebei 054000,China)

R739

A

2016-11-09

張云鶴，E-mail：578423966@qq.com

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.22.007

1005-8982（2017）22-0036-06