徐永波，李宏，貝媛媛，李源，唐金元，李坤，褚海波

（1.解放軍第八十九醫(yī)院 普外中心，山東 濰坊 261021；濰坊醫(yī)學院 2.醫(yī)學研究中心，3.研究生部，山東 濰坊 261053）

門靜脈高壓癥脾大部切除后殘脾基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的變化*

徐永波1，李宏2，貝媛媛3，李源3，唐金元1，李坤1，褚海波1

（1.解放軍第八十九醫(yī)院 普外中心，山東 濰坊 261021；濰坊醫(yī)學院 2.醫(yī)學研究中心，3.研究生部，山東 濰坊 261053）

目的檢測門靜脈高壓癥脾大部切除后殘脾組織和血清基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的表達和水平，探討脾纖維化的分子機制及保脾術(shù)的臨床價值。方法選取門靜脈高壓脾腫大患者13例。術(shù)中切取脾組織為巨脾組，術(shù)后8年穿刺獲取脾組織為殘脾組，設外傷性脾破裂患者13例為對照組。采用免疫組織化學法、實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）及酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測脾臟組織和血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9、組織金屬蛋白酶抑制物TIMP-1、TIMP-2的表達和水平。結(jié)果3組脾組織中，MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白陽性表達主要分布在巨噬細胞內(nèi)。殘脾組和巨脾組脾組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2蛋白陽性表達率和基因表達與對照組比較，均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），殘脾組和巨脾組升高；殘脾組和巨脾組之間比較則差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。殘脾組和巨脾組血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2水平與對照組比較，均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），殘脾組和巨脾組升高；殘脾組和巨脾組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論門靜脈高壓癥脾腫大患者脾大部切除術(shù)后殘脾組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2蛋白和基因表達增加，血清蛋白水平升高，提示殘脾組織基質(zhì)金屬蛋白酶和組織金屬蛋白酶抑制物代謝失調(diào)。

殘脾；門靜脈高壓；脾腫大；基質(zhì)金屬蛋白酶；組織金屬蛋白酶抑制物

Abstract:ObjectiveTo measure the mRNA and protein levels of matrix metalloproteinases(MMPs)and tissue inhibitors of metalloproteinase(TIMPs)in residual splenic tissue and serum after subtotal splenectomy due to portal hypertension,and to investigate splenic fibrosis in molecular detail and the value of reserving splenic tissue during surgery.MethodsThirteen patients of splenomegaly due to portal hypertension who had subtotal splenectomy were enrolled in splenomegaly group.Those with spleen tissue puncture biopsy 8 years after splenectomy were selected into residual spleen group.Additionally,13 traumatic spleen samples were collected for control group. Immunohistochemistry,PCR and ELISA were used to detect mRNA and protein levels of MMPs and TIMPs in the residual spleen samples and serum.ResultsIn the residual spleen,splenomegaly and control groups,the positive expressions of MMP-2,MMP-9,TIMP-1 and TIMP-2 were densely distributed in macrophages.The positiveexpression rates of MMP-2,MMP-9,TIMP-1 and TIMP-2 proteins and mRNAs of the spleen tissues were significantly higher in the residual spleen and the splenomegaly groups compared with the control group(P＜0.05); however,there were no significant differences between the residual spleen group and the splenomegaly group(P＞0.05).Significantly higher levels of serum MMP-2,MMP-9,TIMP-1 and TIMP-2 were observed in the residual spleen and the splenomegaly groups compared with the control group(P＜0.05);but there were no significant differences between the residual spleen and the splenomegaly groups(P＞0.05).ConclusionsAfter subtotal splenectomy,MMP-2,MMP-9,TIMP-1 and TIMP-2 expressions are increased in the residual splenic tissue and serum of patients with portal hypertension.The results suggested that dysregulated MMPs and TIMPs expressions occur in the residual spleen after subtotal splenectomy due to portal hypertension.

Keywords:residual spleen;portal hypertension;splenomegaly;matrix metalloproteinases;tissue inhibitor of metalloproteinase

脾臟是機體重要的免疫器官。脾腫大是門靜脈高壓癥并發(fā)癥之一，其持續(xù)的高血流動力學狀態(tài)，逐漸導致脾臟組織的重塑改變（血管和淋巴組織增生及纖維化）[1-2]。對門靜脈高壓脾腫大如何處理，外科醫(yī)生面臨著困惑與抉擇。“保脾”與“切脾”的爭議焦點歸納為門靜脈血栓發(fā)生率、脾免疫功能、脾功能亢進能否糾正、門靜脈壓力能否降低等，學術(shù)上的分歧至今難以定論[3-4]。研究表明[5-6]，脾腫大時，脾組織細胞外基質(zhì)的異常代謝，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）及組織金屬蛋白酶抑制物（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）的平衡起著重要作用。門靜脈高壓癥脾大部切除后殘脾組織和血清MMP和TIMP的變化如何，文獻未見報道。本文通過免疫組織化學、實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR），酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 檢測脾組織和血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2的變化，探討脾纖維化的分子機制及保脾術(shù)的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有病例獲解放第八十九醫(yī)院人類研究倫理委員會批準（No：1678）和患者的知情同意。選取本院1999～2015年286例行脾大部切除大網(wǎng)膜胸骨后和殘脾腹膜后固定術(shù)中的患者13例。其中男性7例，女性6例；平均31歲（26～36歲）。入選標準：乙型肝炎肝硬化，乙肝DNA定量＜5×102個/ml，肝功能Child分級A、B級，脾腫大伴脾功能亢進，食管下段有輕、中度靜脈曲張，脾纖維化Ⅲ級。彩色B超測量脾臟大小：術(shù)前長徑（48±5）cm、橫徑（30±4）cm、厚徑（10±2）cm；術(shù)后8年長徑（11±1）cm、橫徑（7±1）cm、厚徑（4±1）cm。術(shù)中切取脾組織為巨脾組；術(shù)后8年穿刺獲取脾組織為殘脾組。彩色B超引導下腹膜后空心針穿刺活檢獲取殘脾組織樣本。設外傷性脾破裂患者13例為對照組，男性7例，女性6例；年齡30歲（28～37歲）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本收集和處理 收集標本共39份，用10%中性甲醛固定標本24 h，常規(guī)脫水、包埋、切片。每1份標本切取5張薄片進行免疫組織化學染色。另取新鮮標本，立即放置EP管中，然后置液氮罐中保存待做qRT-PCR分析。

1.2.2 試劑與儀器 MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2免疫組織化學試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，SYBR PrimeScript RT-PCR KitⅡ及相關(guān)引物設計合成由大連寶生物工程有限公司提供，MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2血清檢測試劑盒由深圳晶美生物工程有限公司提供，Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）。Versa Max酶標儀（美國 Molecular Devices公司），qRT-PCR儀（美國Bio-RadIQ5）。

1.2.3 免疫組織化學法檢測脾組織 MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白表達 石蠟切片厚4μm，貼于多聚賴氨酸處理過的載玻片上，60℃烤片6 h，常規(guī)脫蠟。免疫組織化學采用UltraSensitiveTMSP kit的SP法，其中TIMP-1抗體切片進行微波修復處理。用已知陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照，AEC顯色。

1.2.4 ELISA檢測血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白水平 空腹抽取外周靜脈血3 ml，4℃離心（2 000 r/min,離心10 min），上清液肝素抗凝，取血清-80℃冰箱保存待測。采用ELISA方法檢測，嚴格按說明書進行操作。

1.2.5 qRT-PCR檢測MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA表達 取各組脾組織，按照Trizol試劑盒說明書提取組織總RNA，溶于DEPC處理的去離子水中，-70℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR采用SYBR Green法。相關(guān)基因引物序列見表1，實驗中以管家基因GAPDH作為內(nèi)參，以超純水（PCR級，無RNase）作為陰性對照。結(jié)果分析按2-ΔΔCt來計算出各組擴增效率。

1.2.6 顯微圖像分析 采用Image-Pro Plus 6.0病理細胞圖像分析系統(tǒng)，將各組MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2免疫組織化學染色切片進行圖像分析，選取測量參數(shù)，測定陽性率，每間隔1個高倍視野（×400）選取1個視野進行觀察，每張切片至少觀察5個高倍視野，計算其陽性細胞表達率=（5個高倍視野的陽性細胞數(shù)／細胞總數(shù)×100%）并計算其平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，用均數(shù)±標準差（±s）表示，3組間比較采用單因素方差分析，在方差分析有意義的基礎(chǔ)上，再采用SNK-q檢驗進行兩兩比較，兩組間比較采用配對和獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 相關(guān)基因的引物序列及擴增產(chǎn)物大小

2 結(jié)果

2.1 脾臟MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2蛋白表達分布與含量

MMP-2和MMP-9蛋白陽性表達密集分布在邊緣區(qū)巨噬細胞內(nèi)，散在分布于紅髓脾竇內(nèi)皮細胞、脾索和脾小梁成纖維細胞和網(wǎng)狀細胞內(nèi)；白髓罕見蛋白陽性表達。TIMP-1和TIMP-2蛋白陽性表達密集分布于邊緣區(qū)巨噬細胞內(nèi)，散在分布于紅髓脾竇內(nèi)皮細胞和血管周圍的成纖維細胞內(nèi)。3組的分布部位大致相同，其中殘脾組和巨脾組分布密度明顯增高（見附圖）。

3組脾臟MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。殘脾組MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2蛋白陽性表達率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.650、2.142、3.538和2.402，P=0.014、0.043、0.002和0.024），殘脾組增加；巨脾組MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白陽性表達率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.462、2.523、4.254和2.317，P=0.002、0.019、0.000和0.029）；殘脾組和巨脾組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-0.789、-0.397、-0.857和-0.187，P=0.438、0.695、0.400和0.853）。見表2。

2.2 血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2水平

3組血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。殘脾組血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.248、7.692、19.707和6.322，均P=0.000），殘脾組升高；巨脾組血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=10.561、9.735、19.904和7.175，均P=0.000），巨脾組升高；殘脾組和巨脾組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-0.862、-0.990、-1.606和 -1.901，P=0.397、0.332、0.121和0.069）。見表3。

2.3 脾臟MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2 mRNA表達

3組脾臟MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2 mRNA比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。殘脾組MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2 mRNA表達與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.105、3.518、3.196和2.828，P=0.046、0.002、0.004和0.009），殘脾組增加；巨脾組MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2 mRNA表達與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.646、3.630、2.449和2.353，P=0.014、0.001、0.022和0.027），巨脾組增加；殘脾組和巨脾組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（t= -0.519、-0.929、-0.060和 -0.329，P=0.609、0.362、0.953和0.745）。見表4。

附圖 脾臟MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2蛋白表達 （×400）

表2 3組脾臟MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2蛋白陽性表達率比較 （n=13，%，±s）

表2 3組脾臟MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2蛋白陽性表達率比較 （n=13，%，±s）

注：?與對照組比較，P＜0.05

組別MMP-2MMP-9TIMP-1TIMP-2殘脾組 7.00±1.41?8.85±1.57?5.23±1.09?4.46±0.88?巨脾組 7.38±1.04?9.08±1.38?5.62±1.19?4.54±1.20?對照組 5.15±2.08 7.15±2.38 3.77±1.01 3.31±1.49F值 7.497 4.289 4.239 4.179P值 0.002 0.021 0.022 0.023

表3 3組血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2水平比較 （n=13，ng/ml，±s）

表3 3組血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2水平比較 （n=13，ng/ml，±s）

注：?與對照組比較，P＜0.05

組別MMP-2MMP-9TIMP-1TIMP-2殘脾組 1.05±0.12?312.65±98.10?502.38±70.28?211.66±25.71?巨脾組 1.09±0.15?349.30±90.60?549.29±78.45?234.32±34.43?對照組 0.62±0.07 99.83±18.13 95.64±24.47 160.59±13.68F值 66.063 38.967 207.602 27.350P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 3組脾臟MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2 mRNA陽性表達率比較 （n=13，%，±s）

表4 3組脾臟MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2 mRNA陽性表達率比較 （n=13，%，±s）

注：?與對照組比較，P＜0.05

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3 討論

MMPs是1種酶類家族，可通過共同的底物作用于所有的細胞外基質(zhì)[7]。TIMPs則是1種多功能蛋白酶，能調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞凋亡、MMPs活性、血管增生[8]。在正常組織中，MMPs和TIMPs處于低表達狀態(tài)。當某種因素激活組織重塑時，能迅速誘導這些酶呈高表達和活性增加[9]。研究表明[10]，低濃度TIMP-2可增強和促進 MMP-2活性，高濃度TIMP-2則抑制MMP-2活性。MMP-2和MMP-9具有降解膠原Ⅳ和膠原Ⅴ及阻止纖維化的作用，而TIMPs則下調(diào)MMPs活性，促進纖維化進程。由此可見，在病理情況下，MMPs能促進細胞外基質(zhì)降解，但受內(nèi)源性TIMPs調(diào)控，TIMPs與MMPs之間調(diào)節(jié)失衡有利于疾病的發(fā)展[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，3組的MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白陽性表達主要分布于巨噬細胞內(nèi)。殘脾組和巨脾組MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白陽性表達率和基因表達均高于對照組；殘脾組和巨脾組血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白水平均高于對照組。在脾臟組織中，MMPs和TIMPs蛋白的陽性表達，本研究結(jié)果與曾仲等[12]的動物實驗結(jié)果一致。在血清中，MMPs和TIMPs蛋白水平與LUO等[13]和BUSK等[14]結(jié)果相似。MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2 mRNA表達與免疫組織化學蛋白陽性表達率變化趨勢相同。本研究提示，殘脾和巨脾組織纖維化明顯，如同肝纖維化一樣，可刺激多種細胞（巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞）加速分泌MMP和TIMP，以降解細胞外基質(zhì)的過剩和沉積。脾腫大，脾髓內(nèi)高壓與慢性炎癥共存，可能是MMP-9 mRNA和TIMP-1mRNA表達增加的誘導因素[15]?，F(xiàn)已證實，MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2與炎癥細胞和炎癥因子密切相關(guān)[16]。正常情況下，組織內(nèi)MMP活性低下或甚微。當炎癥因子表達、生長激素和氧應激增加時，可誘發(fā)MMP激活，發(fā)揮其降解細胞外基質(zhì)代謝的功能。文獻報道[17]，在MMP和TIMP的失調(diào)過程中，同時影響著細胞凋亡。前期研究發(fā)現(xiàn)[18]，巨脾組織內(nèi)凋亡細胞陽性表達率降低，而殘脾組織內(nèi)凋亡細胞陽性表達率則增加。這一結(jié)果則提示，脾組織MMP和TIMP的代謝異常與細胞更新無關(guān)聯(lián)性。GULINO等[19]提出，缺氧可導致MMP-9分泌減少，TIMP-1釋放增加，出現(xiàn)嚴重的MMP-9/TIMP-1比例失調(diào)。GUNIA等[20]發(fā)現(xiàn)，膿毒血癥脾MMP-1和 TIMP-1平衡失調(diào)，MMP-1的增加可能與巨噬細胞被激活有關(guān)。組織纖維化的結(jié)局反映細胞外基質(zhì)合成和降解的失調(diào)，其調(diào)節(jié)與相關(guān)因子和蛋白有關(guān)，如IL-1β、TNF-α、血小板源性生長因子、MMP、TIMP[21]。MMP和TIMP平衡的分子機制涉及p38/ NF-κB、NF-κB、MAKP、PA-1、FAK等多種信號通路。MMP誘導或抑制信號來自細胞外基質(zhì)通過細胞內(nèi)信號傳導激活或抑制MMP基因[22-25]。此外，有學者認為，MMP和TIMP的動態(tài)生理平衡還可能與免疫反應相關(guān)[26]。

本研究結(jié)果與筆者前期的脾臟組織學研究結(jié)果相符合，即脾大部切除后殘脾纖維化未再發(fā)展[27]。本研究顯示，殘脾組織MMP-2、MMP-9蛋白和基因表達增加，僅反映在分子和基因水平脾纖維化存在的可能性。TIMP-1、TIMP-2蛋白和基因表達增加，則提示機體仍存在1種生理補償調(diào)節(jié)功能。由此可以推測殘脾MMP和TIMP代謝沒有出現(xiàn)比例失調(diào)，或許是殘脾纖維化不再加重的原因之一。本研究還提示，實時檢測血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2水平可作為間接評估脾纖維化的一項敏感的生物指標。另外，筆者前期對殘脾免疫細胞指標的檢測、形態(tài)和功能的觀察，均證實殘脾無脾大脾亢復發(fā)，同時可發(fā)揮分流降低門靜脈壓力作用[4，28]。所獲取的這些資料表明，門靜脈高壓癥患者實施保脾術(shù)對保留脾免疫功能具有可行性和必要性，同時改變?nèi)藗儗﹂T靜脈高壓癥巨脾的一些模糊認識。

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（張蕾 編輯）

Changes of MMPs and tissue inhibitors of metalloproteinase in residual spleen after subtotal splenectomy for portal hypertension*

Yong-bo Xu1,Hong Li2,Yuan-yuan Bei3,Yuan Li3,Jin-yuan Tang1,Kun Li1,Hai-bo Chu1
(1.Department of General Surgery,the 89th Hospital of Chinese PLA,Weifang,Shandong 261021, China;2.Medical Research Center,3.Graduate Division,Weifang Medical College,Weifang, Shandong 261053,China)

R657.6

A

2017-01-02

山東省濰坊市科技發(fā)展計劃資助項目（No：2014zj1058）

褚海波，Email：haibochuwf@163.com

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.22.006

1005-8982（2017）22-0030-06