張燕，陸萍，楊淑玲，劉璇，張琳，王一

（上海市普陀區(qū)婦嬰保健院1.病理科，2.婦科，上海 200062）

滋養(yǎng)葉細胞增殖基因及間質細胞凋亡檢測在水泡狀胎塊診斷中的價值*

張燕1，陸萍1，楊淑玲1，劉璇1，張琳2，王一1

（上海市普陀區(qū)婦嬰保健院1.病理科，2.婦科，上海 200062）

目的探討滋養(yǎng)葉細胞增殖相關基因及間質細胞凋亡檢測在水泡狀胎塊（HM）病理診斷中的價值。方法應用免疫組織化學標記技術，檢測100例HM（其中完全性HM 61例，部分性HM 39例）及40例絨毛水腫的病理組織標本滋養(yǎng)葉細胞的Ki67、Livin與Bcl-2的表達，并應用TUNEL法對絨毛間質凋亡細胞進行原位觀察。結果Ki67陽性表達在絨毛水腫組、部分性HM組、完全性HM組趨勢呈逐漸增強，各組間比較均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；絨毛水腫組及HM組絨毛間質內AI指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Livin及Bcl-2表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Ki67表達與AI指數(shù)呈正相關（P＜0.05）。結論間質細胞凋亡聯(lián)合滋養(yǎng)葉細胞中Ki67表達檢測可用于HM的診斷與分型，也可用于鑒別HM與絨毛水腫。

HM；Ki67；Livin；Bcl-2

Abstract:ObjectiveTo investigate the value of trophoblastic cell proliferation-related gene and interstitial cell apoptosis in the diagnosis of hydatidiform moles.MethodsImmunohistochemical technique was used to detect the expressions of Ki67,Livin and Bcl-2 in trophoblast cells.TUNEL was used to detect apoptosis of villous stroma cells of 100 cases of hydatidiform moles(including 61 cases of complete hydatidiform moles and 39 cases of partial hydatidiform moles)and 40 cases of villous edema.ResultsThe expression of Ki67 in the trophoblastic cells of the villous edema group,partial hydatidiform mole group and complete hydatidiform mole group gradually increased,the differences among the 3 groups were statistically significant(P＜0.05).There were no significant differences in the expression of Livin or Bcl-2 among the 3 groups(P＞0.05).There was a positive correlation between Ki67 expression and AI index(P＜0.05).ConclusionsThe detection of Ki67 expression in trophoblastic cells and apoptosis in villous stroma cells can be used for the diagnosis and classification of villous edema,partial hydatidiform mole and complete hydatidiform mole.

Keywords:hydatidiform mole;Ki67;Livin;Bcl-2

水泡狀胎塊（hydatidiform mole，HM），又稱為葡萄胎，是我國最常見的妊娠并發(fā)癥之一，病變主要在于滋養(yǎng)葉細胞增生及胎盤絨毛過度生長，依據(jù)預后程度，可將HM分為完全性HM與部分性HM 2類，大多數(shù)為良性妊娠滋養(yǎng)葉細胞病變，但仍有部分患者清除病變組織后轉化為惡性HM，嚴重者可惡化為絨毛膜癌。但更為嚴峻的問題是，截止目前，HM病理學特征不典型，難以與流產的水腫絨毛區(qū)別，因此如何診斷并分型HM仍是婦產科病理診斷的難題，即使有經驗的病理醫(yī)師也面臨診斷困難，并且診斷的可重復性差，造成HM漏診或誤診，引發(fā)分歧并造成醫(yī)療糾紛[1-3]。文獻顯示HM的流產病例中細胞滋養(yǎng)層細胞增殖速度較低，增殖活性下降[4]，本院早期針對HM的形態(tài)學進行了細致的回顧性研究，發(fā)現(xiàn)絨毛間質的核碎片/凋亡小體的出現(xiàn)對于區(qū)分HM及絨毛水腫差異有統(tǒng)計學意義，部分病理還顯示了滋養(yǎng)層向間質內折疊呈凹字形，可見HM的增殖/凋亡平衡可能被打破，Ki67是細胞增殖標記物，主要用于鑒別腫瘤增生，近年來越來越多的學者著眼于探索Ki67表達與反應性增生病變的關聯(lián)[5]。Livin與Bcl-2基因屬于凋亡抑制基因，可通過多種途徑抑制細胞凋亡作用，過度表達可抑制細胞凋亡，有利于細胞的異常增殖和惡性轉化，但兩者在正常組織中幾乎不表達[6-7]。基于以上論述，本研究挑選HM及絨毛水腫病例應用TUNEL法原位檢測間質層細胞凋亡，免疫組織化學染色方法檢測滋養(yǎng)葉細胞增殖標記物Ki67及凋亡相關蛋白Livin、Bcl-2表達，初步探討2種細胞的增殖及凋亡狀況與HM的關系，為診斷并分型HM提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

經院內倫理委員會同意，收集2006～2013年上海市普陀區(qū)婦嬰保健院經常規(guī)病理診斷為HM的病例100例，另隨機挑選自然流產常規(guī)病理診斷為絨毛水腫的病例40例為對照組。所有病例經p57kip2及CD34免疫組織化學檢驗，結果由2名經驗豐富的婦科病理醫(yī)師共同確定診斷并進一步對100例HM進行分型，完全性HM 61例，部分性HM 39例。

1.2 試劑

兔抗人Ki67單克隆抗體（英國Abcam公司，克隆號：SP6）、Bcl-2單克隆抗體（美國Abnova公司，克隆號：SP66）和兔抗人Livin多克隆抗體（英國Abcam公司，克隆號：ab97350）均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；凋亡檢測試劑盒（英國abcam公司，克隆號：QIA33-1EA）購自艾博抗上海貿易有限公司。

1.3 指標檢測

全部標本均為常規(guī)外檢組織，經多聚甲醛液固定、脫水、石蠟包埋和切片，分別行HE和免疫組織化學法染色。

1.3.1 免疫組織化學法檢測 EnVision法檢測胎塊滋養(yǎng)葉細胞中Ki67、Livin與Bcl-2的表達操作按試劑盒說明書步驟進行，一抗：兔抗人Ki67單克隆抗體、兔抗人Livin多克隆抗體和Bcl-2單克隆抗體，用PBS代替一抗為陰性對照，在光鏡下觀察。Ki67、Livin和Bcl-2的陽性表達均為棕黃色或黃色顆粒，其中Ki67定位于細胞核，Livin定位于細胞質，Bcl-2定位于細胞膜和細胞質，選取200個滋養(yǎng)葉細胞觀察，Ki67、Livin和Bcl-2的表達為陽性細胞數(shù)/計數(shù)細胞總數(shù)×100%。

1.3.2 TUNEL法檢測 操作按試劑盒說明書步驟進行，脫水、封片和干燥，在光學顯微鏡下觀察。結果判定標準：以絨毛間質細胞著棕色為陽性細胞，計數(shù)10個連續(xù)高倍鏡（×400）視野的絨毛間質細胞的陽性細胞數(shù)，計算出凋亡指數(shù)（apoptosis Index，AI）=絨毛間質凋亡細胞數(shù)/mm2。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用方差分析，有統(tǒng)計學意義后，采用q檢驗作兩兩比較。Ki67、Livin與Bcl-2表達與AI指數(shù)的相關性分析采用Pearson積差相關分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料比較

絨毛水腫組、部分性HM組和完全性HM組3個組別的年齡、體重指數(shù)、妊娠時間和是否初產婦等一般情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

2.2 3組胎塊的Ki67、Livin與Bcl-2表達比較

3組胎塊Livin、Bcl-2表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與絨毛水腫組比，部分性HM組和完全性HM組的Ki67表達增高（P＜0.05），與部分性HM組比，完全性HM組的Ki67表達增高（P＜0.05）。見表2、圖1。

表1 3個組別的臨床資料比較

表2 3組胎塊的Ki67、Livin與Bcl-2表達比較 （±s，%）

表2 3組胎塊的Ki67、Livin與Bcl-2表達比較 （±s，%）

注：1）與絨毛水腫組比較，P＜0.05，2）與部分性HM組比較，P＜0.05

組別Bcl-2絨毛水腫組（n=40） 7.31±1.53 42.08±6.48 38.67±5.47部分性HM組（n=39） 18.84±4.271）44.87±5.97 39.12±5.39完全性HM組（n=61） 31.64±8.171）2）43.27±7.04 40.26±5.12F值 208.58 1.78 1.22P值 0.000 0.17 0.30Ki67Livin

圖1 3組胎塊的Ki67、Livin與Bcl-2表達比較 （×200）

2.3 3組胎塊的間質細胞凋亡比較

絨毛水腫組絨毛間質中幾乎無凋亡細胞，部分性HM組與完全性HM組均可見凋亡細胞，散在分布，與絨毛水腫組比較，部分性HM組和完全性HM組的AI增高（P＜0.05），部分性HM組和完全性HM組的AI比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3和圖2。

2.4 Ki67、Livin與Bcl-2與AI的相關性比較

Ki67、Livin與Bcl-2與AI的相關系數(shù)分別為0.54（P＜0.05）、0.27（P＞0.05）與0.31（P＞0.05），Ki67與AI呈正相關（P＜0.05）。

表3 3組胎塊的AI比較

圖2 3組胎塊間質細胞凋亡比較 （×400）

3 討論

HM屬于印跡基因比例嚴重異常的疾病，發(fā)生與異常受精有關。根據(jù)病理和預后分型為部分性HM與完全性HM，前者來源于父系和母系基因組的三倍體，后者為來源于父系的二倍體。

目前臨床鑒別完全性HM、部分性HM與流產伴絨毛水腫仍然主要依賴于組織學特征。與完全性HM比，部分性HM的病理變化較少，這點容易鑒別完全性HM與部分性HM，但部分性HM的病理變化非常細微，臨床醫(yī)師或病理醫(yī)師容易將部分性HM誤認為自然流產，從而容易造成部分性HM漏診或誤診，耽誤了治療。

結合筆者早期的研究，本研究對HM及早期正常妊娠絨毛的形態(tài)學特征進行了深入觀察，發(fā)現(xiàn)絨毛水腫、絨毛水池形成、滋養(yǎng)葉細胞增生（包括增生模式、增生程度及增生不典型性）和間質細胞凋亡在HM分型和鑒別HM與絨毛水腫胎塊鑒別有重要價值。

對于滋養(yǎng)葉細胞增生，本檢測了凋亡/增殖相關蛋白Ki67、Livin與Bcl-2，3者均明顯增高。Ki67是細胞增殖標記物，可用于鑒別腫瘤與反應性增生病變，Ki67表達在除G0期以外其他細胞周期的細胞，甄別細胞增殖活性和良惡性組織生長狀態(tài)[11]。本次實驗中，Ki67在各組絨毛的細胞滋養(yǎng)葉細胞均有不同程度的陽性表達，在絨毛水腫組、部分性HM組和完全性HM組呈逐漸增多，各組間均差異有統(tǒng)計學意義，與ALIREZA等[12]的研究一致，說明HM的絨毛滋養(yǎng)細胞增殖活性要高于普通的絨毛組織。Livin基因（又稱KIAP、ML-1AP），是凋亡抑制基因家族中的成員，可以通過多種途徑發(fā)揮抑制細胞凋亡作用，Livin在正常組織中低表達或未見表達，而在許多腫瘤細胞中都呈高表達[13]。Bcl-2基因是最早被發(fā)現(xiàn)的抗凋亡基因，可通過阻止細胞凋亡促進癌細胞的增殖以及存活，導致腫瘤的發(fā)生。CANDELIER等[14]研究發(fā)現(xiàn)其在HM惡性發(fā)展的診斷價值。但在本研究中未發(fā)現(xiàn)Livin及Bcl-2蛋白在HM與絨毛水腫的滋養(yǎng)葉細胞中的表達僅有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，有可能與納入病例較少有關，需要進一步擴大樣本驗證，因此Livin及Bcl-2蛋白在滋養(yǎng)葉細胞的表達是否有助于提高鑒別絨毛水腫、部分性HM和完全性水泡狀的準確性還需試驗驗證。

HM的絨毛間質可見雜亂分布的核碎片與凋亡小體，但在正常早期絨毛間質中難以見到，核碎片與凋亡小體的數(shù)量與病變程度密切相關，因此這類形態(tài)指標可用于鑒別完全性、部分性HM與早期正常絨毛組織。有研究證實，HM間質細胞核碎裂與凋亡比率明顯高于正常早期胎盤[8-9]，而且HM惡變與滋養(yǎng)細胞的凋亡活性相關，可見多種凋亡相關因子參與了絨毛組織的病變過程[6]。本研究采用TUNEL法原位檢測間質細胞凋亡情況，結果顯示絨毛間質細胞中的凋亡細胞數(shù)在HM組和絨毛水腫組表達差異有統(tǒng)計學意義，前者的凋亡細胞高于后者，與早前研究中光鏡下觀察到的絨毛間質凋亡小體/核碎片的情況相一致，但在完全性與部分性HM之間細胞凋亡差異有統(tǒng)計學意義。另外滋養(yǎng)葉細胞的Ki67的表達與AI指數(shù)呈正相關，提示HM病例并存絨毛滋養(yǎng)葉細胞的高增殖活性及絨毛間質細胞的高度凋亡。

綜上所述，難以依賴于病理形態(tài)學的改變進行HM的診斷與分型是婦產科病理診斷的難點。本次研究結果提示，檢測間質細胞的凋亡聯(lián)合滋養(yǎng)葉細胞Ki67表達可用于HM的診斷與分型，也可用于鑒別HM與絨毛水腫。

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（張西倩 編輯）

Value of trophoblastic cell proliferation-related gene and interstitial cell apoptosis in diagnosis of hydatidiform moles*

Yan Zhang1,Ping Lu1,Shu-ling Yang1,Xuan Liu1,Lin Zhang2,Yi Wang1
(1.Department of Pathology,2.Department of Gynecology,Maternity and Infant Health Care Hospital of Putuo District,Shanghai 200062,China)

R737.33

A

2016-12-08

上海市普陀區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)自主創(chuàng)新科研資助項目（No：普KW2012308）；上海市普陀區(qū)臨床重點專科建設項目（No：PW-2-14-02）

王一，E-mail：wangyi6151@126.com；Tel：13681713686

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.22.004

1005-8982（2017）22-0020-05