康曉冬高?；勖撜鬈娚蹜逊鍙埡推今R振明孫文華溫 萬(wàn)*

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002；2.寧夏畜牧工作站，寧夏銀川 750002；3.寧夏動(dòng)物疫病控制預(yù)防中心，寧夏銀川 750002；4.寧夏石嘴山市惠農(nóng)區(qū)畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心 寧夏石嘴山 753200；5.寧夏吳忠市利通區(qū)畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心，寧夏吳忠 751100）

寧夏地區(qū)奶牛新孢子蟲(chóng)病的流行病學(xué)調(diào)查

康曉冬1高?；?脫征軍2邵懷峰2張和平3馬振明4孫文華5溫 萬(wàn)2*

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002；2.寧夏畜牧工作站，寧夏銀川 750002；3.寧夏動(dòng)物疫病控制預(yù)防中心，寧夏銀川 750002；4.寧夏石嘴山市惠農(nóng)區(qū)畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心 寧夏石嘴山 753200；5.寧夏吳忠市利通區(qū)畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心，寧夏吳忠 751100）

為了解寧夏地區(qū)奶牛新孢子蟲(chóng)病的發(fā)生情況，于2016年6月～9月對(duì)寧夏奶牛核心養(yǎng)殖區(qū)具有代表性的9個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)按照5%的比例隨機(jī)采血1796份，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法檢測(cè)奶牛新孢子蟲(chóng)病血清抗體。結(jié)果顯示，9個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)均有新孢子蟲(chóng)血清陽(yáng)性牛存在，場(chǎng)血清陽(yáng)性率為100%；各場(chǎng)奶牛檢測(cè)陽(yáng)性率在7.58%～30.77%，平均血清陽(yáng)性率24.11%；表明該病在寧夏奶牛養(yǎng)殖牧場(chǎng)中存在，但感染處在一個(gè)中等略低的水平。

寧夏 奶牛 新孢子蟲(chóng) 流行病學(xué)調(diào)查

新孢子蟲(chóng)病是由犬新孢子蟲(chóng)寄生在犬、牛等多種動(dòng)物體內(nèi)的一種細(xì)胞內(nèi)寄生的原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)病[1]。可以引起牛、綿羊、山羊和馬流產(chǎn)或產(chǎn)死胎、木乃伊胎，以及新生幼畜發(fā)病和死亡。該病可通過(guò)胎盤(pán)垂直傳播，對(duì)牛養(yǎng)殖業(yè)的危害最為嚴(yán)重。新孢子蟲(chóng)宿主范圍較廣，促進(jìn)了該病的傳播感染。該病最早發(fā)現(xiàn)于1984年[2]，呈世界性分布。我國(guó)對(duì)該病研究起步比較晚，2003年，劉群教授等[3]首次報(bào)道了該病在我國(guó)奶牛中存在?，F(xiàn)在已有70多個(gè)國(guó)家報(bào)道了該病的存在發(fā)生，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的健康發(fā)展。為了明確該病在寧夏奶牛養(yǎng)殖中的存在和分布流行情況，寧夏回族自治區(qū)奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)服務(wù)團(tuán)隊(duì)于2016年6月～9月，對(duì)本區(qū)奶牛新孢子蟲(chóng)病開(kāi)展了流行病學(xué)調(diào)查，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 被檢血清 遴選寧夏地區(qū)奶牛核心養(yǎng)殖區(qū)具有代表性的9個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)（牧場(chǎng)、養(yǎng)殖園區(qū)等）按照5%的比例隨機(jī)采血1796份，室溫下靜置2～3h后，在4℃ 3000r/min離心5min，析出血清-20℃保存?zhèn)錂z。

1.1.2 檢測(cè)試劑 犬新孢子蟲(chóng)抗體檢測(cè)試劑盒：美國(guó)愛(ài)得士生物科技公司（IDEXX）生產(chǎn)。

1.1.3 主要檢測(cè)儀器設(shè)備

（1）臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（H-1850R 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司）；

（2）酶標(biāo)儀（iMark 美國(guó)BIO-RAD公司）；

（3）全自動(dòng)洗板機(jī)（RT-3000 深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；

（4）微量移液器（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2 方法

（1）樣品的準(zhǔn)備：用樣品稀釋液對(duì)檢測(cè)樣品做100倍（1：100）稀釋?zhuān)幌♂寣?duì)照樣，每個(gè)樣品更換吸頭。樣品在加入犬新孢子蟲(chóng)包被板之前混勻。所有試劑在使用之前恢復(fù)至18℃～26℃，試劑通過(guò)輕柔地顛倒或震蕩混勻。

（2）洗滌溶液的制備：濃縮洗滌液（10×）應(yīng)置于18℃～26℃并混勻以確保沉淀的鹽溶解。使用之前濃縮洗滌液（10×）用去離子水進(jìn)行10倍稀釋。

（3）取出抗原包被板，記錄每個(gè)樣品在反應(yīng)板上的位置。

（4）加入100μl未稀釋的陰性對(duì)照，每次檢測(cè)加兩個(gè)孔。

（5）加入100μl未稀釋的陽(yáng)性對(duì)照，每次檢測(cè)加兩個(gè)孔。

（6）在剩下的孔中加入100μl稀釋好的樣品。

（7）在18℃～26℃的條件下孵育30min（±2min）。

那天她回去后，就病了。心理的脆弱讓她的身體不堪一擊。她發(fā)燒，總是很冷。窩在床角發(fā)呆。她想他。她想如果這時(shí)他能來(lái)一個(gè)電話(huà)，或者一條短信，她就原諒他了。原諒他對(duì)自己的不認(rèn)真，也原諒自己在這場(chǎng)關(guān)系中的失敗。她會(huì)一直和他那樣下去，即使只是性伙伴。

（8）棄去所有孔中液體。

（9）每孔加入300μl洗滌溶液，洗滌4 次。每次洗完棄掉所有孔中液體成分。在兩次洗滌之間以及加入酶標(biāo)記抗體之前避免反應(yīng)板干燥。在最后一次洗滌之后吸掉液體，輕柔并徹底地在吸水材料上拍干每塊反應(yīng)板。

（10）每孔加入100μl酶標(biāo)抗體。

（11）在18℃～26℃的條件下孵育30min（±2min）。

（12）重復(fù)步驟（8）和（9）。

（13）每孔加入100μlTMB 底物溶液。

（14）在18℃～26℃的條件下孵育15min（±1min）。

（15）每孔加入100μl終止液來(lái)終止反應(yīng)。

（16）在620～650nm下讀數(shù)并記錄吸光值。

（17）計(jì)算結(jié)果 結(jié)果判定按照診斷試劑盒結(jié)果判定要求進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

9個(gè)奶牛場(chǎng)的1796份血清中共檢出犬新孢子蟲(chóng)抗體陽(yáng)性血樣433份，平均血清陽(yáng)性率為24.11%，在9個(gè)被檢牛場(chǎng)中均有犬新孢子蟲(chóng)血清陽(yáng)性牛存在，場(chǎng)感染陽(yáng)性率為100%，其中最高血清陽(yáng)性率為30.77%，最低為7.58%，結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 寧夏地區(qū)奶牛犬新孢子蟲(chóng)血清抗體檢測(cè)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

3.1 檢測(cè)方法

（1）ELISA法與病原學(xué)檢測(cè)方法相比較，具有檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便易行、靈敏度高、人為主觀因素影響小的特點(diǎn)，既可行又可靠，是目前新孢子蟲(chóng)病檢測(cè)最常用的方法之一，可用于大批量樣本的檢測(cè)。

（2）ELISA法是根據(jù)抗原抗體特異結(jié)合的原理建立的，新孢子蟲(chóng)每個(gè)時(shí)期所表達(dá)的抗原蛋白不一樣，所以，血清學(xué)方法不能檢測(cè)到新孢子蟲(chóng)的所有生活史階段，尤其是終末宿主階段[4]。

3.2 寧夏奶牛新孢子蟲(chóng)病血清學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)對(duì)寧夏奶牛進(jìn)行的新孢子蟲(chóng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，結(jié)果顯示9個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)均有犬新孢子蟲(chóng)血清陽(yáng)性牛存在，場(chǎng)血清陽(yáng)性率為100%；各場(chǎng)奶牛檢測(cè)陽(yáng)性率在7.58%～30.77%，平均血清陽(yáng)性率24.11%；表明該病在寧夏奶牛養(yǎng)殖牧場(chǎng)中存在，但感染率處在一個(gè)中等略低的水平。但因其對(duì)奶產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的巨大危害，還是應(yīng)引起主管部門(mén)及奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的高度重視，并要制定一系列防控措施，控制該病在奶牛中的傳播。

3.3 奶牛新孢子蟲(chóng)病防控

（1）加強(qiáng)飼養(yǎng)管理：規(guī)范奶牛場(chǎng)飼養(yǎng)管理，科學(xué)調(diào)配飼料，增強(qiáng)奶牛體質(zhì)，提高奶?？共⌒?，減少該病的感染。

（2）加強(qiáng)檢疫：引進(jìn)牛只一定要進(jìn)行檢疫，避免將患牛引入牛場(chǎng)。

（3）目前還沒(méi)有研制出治療新孢子蟲(chóng)病的特效藥物和疫苗，防治的有效辦法是通過(guò)檢測(cè)后確定陽(yáng)性感染的牛做淘汰處理，建立無(wú)新孢子蟲(chóng)感染牛群。

[1]Lindsay DS，Dubey JP. Confirmation that the dog is a definitive host for Neospora caninum [J].Vet Parasitol，1999，82（4）：327-333.

[2]Bjerkas I，Mohn SF，and Presthus J.Unidentified cyst-forming sporozoon causing encephalomyelitis and myositis in dogs[J].Z Parasitenkd，1984，（70）：271-274.

[3]劉群，李博，齊長(zhǎng)明，等.乳牛新孢子蟲(chóng)病檢測(cè)初報(bào)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2003，39（2）：8-9.

[4]杜玲.長(zhǎng)春地區(qū)新孢子蟲(chóng)病流行病學(xué)調(diào)查[D].吉林大學(xué)，2014.

寧夏回族自治區(qū)“2016年20項(xiàng)農(nóng)業(yè)重大實(shí)用推廣項(xiàng)目-奶牛繁殖障礙綜合防控技術(shù)的示范與推廣”。

康曉冬（1971-），男，寧夏中寧人，研究員，主要從事牛羊反芻家畜的疫病防治研究工作。

溫 萬(wàn)