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(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所,寧夏銀川 750002;2.寧夏畜牧工作站,寧夏銀川 750002;3.寧夏動物疫病控制預(yù)防中心,寧夏銀川 750002;4.寧夏石嘴山市惠農(nóng)區(qū)畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心 寧夏石嘴山 753200;5.寧夏吳忠市利通區(qū)畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心,寧夏吳忠 751100)
寧夏地區(qū)奶牛新孢子蟲病的流行病學(xué)調(diào)查
康曉冬1高海慧1脫征軍2邵懷峰2張和平3馬振明4孫文華5溫 萬2*
(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所,寧夏銀川 750002;2.寧夏畜牧工作站,寧夏銀川 750002;3.寧夏動物疫病控制預(yù)防中心,寧夏銀川 750002;4.寧夏石嘴山市惠農(nóng)區(qū)畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心 寧夏石嘴山 753200;5.寧夏吳忠市利通區(qū)畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心,寧夏吳忠 751100)
為了解寧夏地區(qū)奶牛新孢子蟲病的發(fā)生情況,于2016年6月~9月對寧夏奶牛核心養(yǎng)殖區(qū)具有代表性的9個奶牛養(yǎng)殖場按照5%的比例隨機采血1796份,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測奶牛新孢子蟲病血清抗體。結(jié)果顯示,9個養(yǎng)殖場均有新孢子蟲血清陽性牛存在,場血清陽性率為100%;各場奶牛檢測陽性率在7.58%~30.77%,平均血清陽性率24.11%;表明該病在寧夏奶牛養(yǎng)殖牧場中存在,但感染處在一個中等略低的水平。
寧夏 奶牛 新孢子蟲 流行病學(xué)調(diào)查
新孢子蟲病是由犬新孢子蟲寄生在犬、牛等多種動物體內(nèi)的一種細(xì)胞內(nèi)寄生的原生動物寄生蟲病[1]??梢砸鹋?、綿羊、山羊和馬流產(chǎn)或產(chǎn)死胎、木乃伊胎,以及新生幼畜發(fā)病和死亡。該病可通過胎盤垂直傳播,對牛養(yǎng)殖業(yè)的危害最為嚴(yán)重。新孢子蟲宿主范圍較廣,促進(jìn)了該病的傳播感染。該病最早發(fā)現(xiàn)于1984年[2],呈世界性分布。我國對該病研究起步比較晚,2003年,劉群教授等[3]首次報道了該病在我國奶牛中存在?,F(xiàn)在已有70多個國家報道了該病的存在發(fā)生,給畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失,嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的健康發(fā)展。為了明確該病在寧夏奶牛養(yǎng)殖中的存在和分布流行情況,寧夏回族自治區(qū)奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)服務(wù)團(tuán)隊于2016年6月~9月,對本區(qū)奶牛新孢子蟲病開展了流行病學(xué)調(diào)查,現(xiàn)報道如下。
1.1.1 被檢血清 遴選寧夏地區(qū)奶牛核心養(yǎng)殖區(qū)具有代表性的9個奶牛養(yǎng)殖場(牧場、養(yǎng)殖園區(qū)等)按照5%的比例隨機采血1796份,室溫下靜置2~3h后,在4℃ 3000r/min離心5min,析出血清-20℃保存?zhèn)錂z。
1.1.2 檢測試劑 犬新孢子蟲抗體檢測試劑盒:美國愛得士生物科技公司(IDEXX)生產(chǎn)。
1.1.3 主要檢測儀器設(shè)備
(1)臺式高速冷凍離心機(H-1850R 長沙湘儀離心機有限公司);
(2)酶標(biāo)儀(iMark 美國BIO-RAD公司);
(3)全自動洗板機(RT-3000 深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司);
(4)微量移液器(德國Eppendorf公司)。
(1)樣品的準(zhǔn)備:用樣品稀釋液對檢測樣品做100倍(1:100)稀釋,不稀釋對照樣,每個樣品更換吸頭。樣品在加入犬新孢子蟲包被板之前混勻。所有試劑在使用之前恢復(fù)至18℃~26℃,試劑通過輕柔地顛倒或震蕩混勻。
(2)洗滌溶液的制備:濃縮洗滌液(10×)應(yīng)置于18℃~26℃并混勻以確保沉淀的鹽溶解。使用之前濃縮洗滌液(10×)用去離子水進(jìn)行10倍稀釋。
(3)取出抗原包被板,記錄每個樣品在反應(yīng)板上的位置。
(4)加入100μl未稀釋的陰性對照,每次檢測加兩個孔。
(5)加入100μl未稀釋的陽性對照,每次檢測加兩個孔。
(6)在剩下的孔中加入100μl稀釋好的樣品。
(7)在18℃~26℃的條件下孵育30min(±2min)。
那天她回去后,就病了。心理的脆弱讓她的身體不堪一擊。她發(fā)燒,總是很冷。窩在床角發(fā)呆。她想他。她想如果這時他能來一個電話,或者一條短信,她就原諒他了。原諒他對自己的不認(rèn)真,也原諒自己在這場關(guān)系中的失敗。她會一直和他那樣下去,即使只是性伙伴。
(8)棄去所有孔中液體。
(9)每孔加入300μl洗滌溶液,洗滌4 次。每次洗完棄掉所有孔中液體成分。在兩次洗滌之間以及加入酶標(biāo)記抗體之前避免反應(yīng)板干燥。在最后一次洗滌之后吸掉液體,輕柔并徹底地在吸水材料上拍干每塊反應(yīng)板。
(10)每孔加入100μl酶標(biāo)抗體。
(11)在18℃~26℃的條件下孵育30min(±2min)。
(12)重復(fù)步驟(8)和(9)。
(13)每孔加入100μlTMB 底物溶液。
(14)在18℃~26℃的條件下孵育15min(±1min)。
(15)每孔加入100μl終止液來終止反應(yīng)。
(16)在620~650nm下讀數(shù)并記錄吸光值。
(17)計算結(jié)果 結(jié)果判定按照診斷試劑盒結(jié)果判定要求進(jìn)行。
9個奶牛場的1796份血清中共檢出犬新孢子蟲抗體陽性血樣433份,平均血清陽性率為24.11%,在9個被檢牛場中均有犬新孢子蟲血清陽性牛存在,場感染陽性率為100%,其中最高血清陽性率為30.77%,最低為7.58%,結(jié)果詳見表1。
表1 寧夏地區(qū)奶牛犬新孢子蟲血清抗體檢測結(jié)果
(1)ELISA法與病原學(xué)檢測方法相比較,具有檢測快速、簡便易行、靈敏度高、人為主觀因素影響小的特點,既可行又可靠,是目前新孢子蟲病檢測最常用的方法之一,可用于大批量樣本的檢測。
(2)ELISA法是根據(jù)抗原抗體特異結(jié)合的原理建立的,新孢子蟲每個時期所表達(dá)的抗原蛋白不一樣,所以,血清學(xué)方法不能檢測到新孢子蟲的所有生活史階段,尤其是終末宿主階段[4]。
通過對寧夏奶牛進(jìn)行的新孢子蟲流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,結(jié)果顯示9個養(yǎng)殖場均有犬新孢子蟲血清陽性牛存在,場血清陽性率為100%;各場奶牛檢測陽性率在7.58%~30.77%,平均血清陽性率24.11%;表明該病在寧夏奶牛養(yǎng)殖牧場中存在,但感染率處在一個中等略低的水平。但因其對奶產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的巨大危害,還是應(yīng)引起主管部門及奶牛養(yǎng)殖場的高度重視,并要制定一系列防控措施,控制該病在奶牛中的傳播。
(1)加強飼養(yǎng)管理:規(guī)范奶牛場飼養(yǎng)管理,科學(xué)調(diào)配飼料,增強奶牛體質(zhì),提高奶牛抗病性,減少該病的感染。
(2)加強檢疫:引進(jìn)牛只一定要進(jìn)行檢疫,避免將患牛引入牛場。
(3)目前還沒有研制出治療新孢子蟲病的特效藥物和疫苗,防治的有效辦法是通過檢測后確定陽性感染的牛做淘汰處理,建立無新孢子蟲感染牛群。
[1]Lindsay DS,Dubey JP. Confirmation that the dog is a definitive host for Neospora caninum [J].Vet Parasitol,1999,82(4):327-333.
[2]Bjerkas I,Mohn SF,and Presthus J.Unidentified cyst-forming sporozoon causing encephalomyelitis and myositis in dogs[J].Z Parasitenkd,1984,(70):271-274.
[3]劉群,李博,齊長明,等.乳牛新孢子蟲病檢測初報[J].中國獸醫(yī)雜志,2003,39(2):8-9.
[4]杜玲.長春地區(qū)新孢子蟲病流行病學(xué)調(diào)查[D].吉林大學(xué),2014.
寧夏回族自治區(qū)“2016年20項農(nóng)業(yè)重大實用推廣項目-奶牛繁殖障礙綜合防控技術(shù)的示范與推廣”。
康曉冬(1971-),男,寧夏中寧人,研究員,主要從事牛羊反芻家畜的疫病防治研究工作。
溫 萬