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(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所,寧夏銀川 750002;2.寧夏畜牧工作站,寧夏銀川 750002;3.寧夏動(dòng)物疫病控制預(yù)防中心,寧夏銀川 750002;4.寧夏石嘴山市惠農(nóng)區(qū)畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心 寧夏石嘴山 753200;5.寧夏吳忠市利通區(qū)畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心,寧夏吳忠 751100)
寧夏地區(qū)奶牛新孢子蟲(chóng)病的流行病學(xué)調(diào)查
康曉冬1高?;?脫征軍2邵懷峰2張和平3馬振明4孫文華5溫 萬(wàn)2*
(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所,寧夏銀川 750002;2.寧夏畜牧工作站,寧夏銀川 750002;3.寧夏動(dòng)物疫病控制預(yù)防中心,寧夏銀川 750002;4.寧夏石嘴山市惠農(nóng)區(qū)畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心 寧夏石嘴山 753200;5.寧夏吳忠市利通區(qū)畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心,寧夏吳忠 751100)
為了解寧夏地區(qū)奶牛新孢子蟲(chóng)病的發(fā)生情況,于2016年6月~9月對(duì)寧夏奶牛核心養(yǎng)殖區(qū)具有代表性的9個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)按照5%的比例隨機(jī)采血1796份,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測(cè)奶牛新孢子蟲(chóng)病血清抗體。結(jié)果顯示,9個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)均有新孢子蟲(chóng)血清陽(yáng)性牛存在,場(chǎng)血清陽(yáng)性率為100%;各場(chǎng)奶牛檢測(cè)陽(yáng)性率在7.58%~30.77%,平均血清陽(yáng)性率24.11%;表明該病在寧夏奶牛養(yǎng)殖牧場(chǎng)中存在,但感染處在一個(gè)中等略低的水平。
寧夏 奶牛 新孢子蟲(chóng) 流行病學(xué)調(diào)查
新孢子蟲(chóng)病是由犬新孢子蟲(chóng)寄生在犬、牛等多種動(dòng)物體內(nèi)的一種細(xì)胞內(nèi)寄生的原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)病[1]。可以引起牛、綿羊、山羊和馬流產(chǎn)或產(chǎn)死胎、木乃伊胎,以及新生幼畜發(fā)病和死亡。該病可通過(guò)胎盤垂直傳播,對(duì)牛養(yǎng)殖業(yè)的危害最為嚴(yán)重。新孢子蟲(chóng)宿主范圍較廣,促進(jìn)了該病的傳播感染。該病最早發(fā)現(xiàn)于1984年[2],呈世界性分布。我國(guó)對(duì)該病研究起步比較晚,2003年,劉群教授等[3]首次報(bào)道了該病在我國(guó)奶牛中存在?,F(xiàn)在已有70多個(gè)國(guó)家報(bào)道了該病的存在發(fā)生,給畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的健康發(fā)展。為了明確該病在寧夏奶牛養(yǎng)殖中的存在和分布流行情況,寧夏回族自治區(qū)奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)服務(wù)團(tuán)隊(duì)于2016年6月~9月,對(duì)本區(qū)奶牛新孢子蟲(chóng)病開(kāi)展了流行病學(xué)調(diào)查,現(xiàn)報(bào)道如下。
1.1.1 被檢血清 遴選寧夏地區(qū)奶牛核心養(yǎng)殖區(qū)具有代表性的9個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)(牧場(chǎng)、養(yǎng)殖園區(qū)等)按照5%的比例隨機(jī)采血1796份,室溫下靜置2~3h后,在4℃ 3000r/min離心5min,析出血清-20℃保存?zhèn)錂z。
1.1.2 檢測(cè)試劑 犬新孢子蟲(chóng)抗體檢測(cè)試劑盒:美國(guó)愛(ài)得士生物科技公司(IDEXX)生產(chǎn)。
1.1.3 主要檢測(cè)儀器設(shè)備
(1)臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(H-1850R 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司);
(2)酶標(biāo)儀(iMark 美國(guó)BIO-RAD公司);
(3)全自動(dòng)洗板機(jī)(RT-3000 深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司);
(4)微量移液器(德國(guó)Eppendorf公司)。
(1)樣品的準(zhǔn)備:用樣品稀釋液對(duì)檢測(cè)樣品做100倍(1:100)稀釋,不稀釋對(duì)照樣,每個(gè)樣品更換吸頭。樣品在加入犬新孢子蟲(chóng)包被板之前混勻。所有試劑在使用之前恢復(fù)至18℃~26℃,試劑通過(guò)輕柔地顛倒或震蕩混勻。
(2)洗滌溶液的制備:濃縮洗滌液(10×)應(yīng)置于18℃~26℃并混勻以確保沉淀的鹽溶解。使用之前濃縮洗滌液(10×)用去離子水進(jìn)行10倍稀釋。
(3)取出抗原包被板,記錄每個(gè)樣品在反應(yīng)板上的位置。
(4)加入100μl未稀釋的陰性對(duì)照,每次檢測(cè)加兩個(gè)孔。
(5)加入100μl未稀釋的陽(yáng)性對(duì)照,每次檢測(cè)加兩個(gè)孔。
(6)在剩下的孔中加入100μl稀釋好的樣品。
(7)在18℃~26℃的條件下孵育30min(±2min)。
那天她回去后,就病了。心理的脆弱讓她的身體不堪一擊。她發(fā)燒,總是很冷。窩在床角發(fā)呆。她想他。她想如果這時(shí)他能來(lái)一個(gè)電話,或者一條短信,她就原諒他了。原諒他對(duì)自己的不認(rèn)真,也原諒自己在這場(chǎng)關(guān)系中的失敗。她會(huì)一直和他那樣下去,即使只是性伙伴。
(8)棄去所有孔中液體。
(9)每孔加入300μl洗滌溶液,洗滌4 次。每次洗完棄掉所有孔中液體成分。在兩次洗滌之間以及加入酶標(biāo)記抗體之前避免反應(yīng)板干燥。在最后一次洗滌之后吸掉液體,輕柔并徹底地在吸水材料上拍干每塊反應(yīng)板。
(10)每孔加入100μl酶標(biāo)抗體。
(11)在18℃~26℃的條件下孵育30min(±2min)。
(12)重復(fù)步驟(8)和(9)。
(13)每孔加入100μlTMB 底物溶液。
(14)在18℃~26℃的條件下孵育15min(±1min)。
(15)每孔加入100μl終止液來(lái)終止反應(yīng)。
(16)在620~650nm下讀數(shù)并記錄吸光值。
(17)計(jì)算結(jié)果 結(jié)果判定按照診斷試劑盒結(jié)果判定要求進(jìn)行。
9個(gè)奶牛場(chǎng)的1796份血清中共檢出犬新孢子蟲(chóng)抗體陽(yáng)性血樣433份,平均血清陽(yáng)性率為24.11%,在9個(gè)被檢牛場(chǎng)中均有犬新孢子蟲(chóng)血清陽(yáng)性牛存在,場(chǎng)感染陽(yáng)性率為100%,其中最高血清陽(yáng)性率為30.77%,最低為7.58%,結(jié)果詳見(jiàn)表1。
表1 寧夏地區(qū)奶牛犬新孢子蟲(chóng)血清抗體檢測(cè)結(jié)果
(1)ELISA法與病原學(xué)檢測(cè)方法相比較,具有檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便易行、靈敏度高、人為主觀因素影響小的特點(diǎn),既可行又可靠,是目前新孢子蟲(chóng)病檢測(cè)最常用的方法之一,可用于大批量樣本的檢測(cè)。
(2)ELISA法是根據(jù)抗原抗體特異結(jié)合的原理建立的,新孢子蟲(chóng)每個(gè)時(shí)期所表達(dá)的抗原蛋白不一樣,所以,血清學(xué)方法不能檢測(cè)到新孢子蟲(chóng)的所有生活史階段,尤其是終末宿主階段[4]。
通過(guò)對(duì)寧夏奶牛進(jìn)行的新孢子蟲(chóng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,結(jié)果顯示9個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)均有犬新孢子蟲(chóng)血清陽(yáng)性牛存在,場(chǎng)血清陽(yáng)性率為100%;各場(chǎng)奶牛檢測(cè)陽(yáng)性率在7.58%~30.77%,平均血清陽(yáng)性率24.11%;表明該病在寧夏奶牛養(yǎng)殖牧場(chǎng)中存在,但感染率處在一個(gè)中等略低的水平。但因其對(duì)奶產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的巨大危害,還是應(yīng)引起主管部門及奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的高度重視,并要制定一系列防控措施,控制該病在奶牛中的傳播。
(1)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理:規(guī)范奶牛場(chǎng)飼養(yǎng)管理,科學(xué)調(diào)配飼料,增強(qiáng)奶牛體質(zhì),提高奶牛抗病性,減少該病的感染。
(2)加強(qiáng)檢疫:引進(jìn)牛只一定要進(jìn)行檢疫,避免將患牛引入牛場(chǎng)。
(3)目前還沒(méi)有研制出治療新孢子蟲(chóng)病的特效藥物和疫苗,防治的有效辦法是通過(guò)檢測(cè)后確定陽(yáng)性感染的牛做淘汰處理,建立無(wú)新孢子蟲(chóng)感染牛群。
[1]Lindsay DS,Dubey JP. Confirmation that the dog is a definitive host for Neospora caninum [J].Vet Parasitol,1999,82(4):327-333.
[2]Bjerkas I,Mohn SF,and Presthus J.Unidentified cyst-forming sporozoon causing encephalomyelitis and myositis in dogs[J].Z Parasitenkd,1984,(70):271-274.
[3]劉群,李博,齊長(zhǎng)明,等.乳牛新孢子蟲(chóng)病檢測(cè)初報(bào)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2003,39(2):8-9.
[4]杜玲.長(zhǎng)春地區(qū)新孢子蟲(chóng)病流行病學(xué)調(diào)查[D].吉林大學(xué),2014.
寧夏回族自治區(qū)“2016年20項(xiàng)農(nóng)業(yè)重大實(shí)用推廣項(xiàng)目-奶牛繁殖障礙綜合防控技術(shù)的示范與推廣”。
康曉冬(1971-),男,寧夏中寧人,研究員,主要從事牛羊反芻家畜的疫病防治研究工作。
溫 萬(wàn)