朱雅寧石瑜袁雪濤蘇欣

（1，天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 300402；2，天津市靜海區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 301600）

藥物阻斷孵化雞胚禽衣原體垂直傳播作用

朱雅寧1石瑜1袁雪濤1蘇欣2

（1，天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 300402；2，天津市靜海區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 301600）

禽衣原體病 （Avian Chlamydiosis,AC）是一種能夠通過(guò)接觸在禽類(lèi)個(gè)體中傳播的疾病，甚至可以通過(guò)禽類(lèi)動(dòng)物傳染給人類(lèi)，它的發(fā)生和鸚鵡熱衣原體直接相關(guān)。最初由衣原體導(dǎo)致的發(fā)生在人類(lèi)和鳥(niǎo)身上的疾病被叫做鸚鵡熱，而將非因鸚鵡類(lèi)禽鳥(niǎo)導(dǎo)致的衣原體疾病叫做鳥(niǎo)疫，事實(shí)上這兩種疾病在癥狀方面沒(méi)有任何區(qū)別。在傳播途徑上，國(guó)內(nèi)外普遍認(rèn)為鸚鵡熱衣原體的傳播途徑為接觸傳播、空氣氣溶膠傳播和生殖道傳播或人工授精途徑。雖然懷疑有垂直傳播，但一直缺乏足夠證據(jù)，最近新發(fā)現(xiàn)，鸚鵡熱衣原體傳播3個(gè)途徑:種蛋卵黃囊膜垂直傳播、雞弱毒疫苗傳播和SPF雞種蛋傳播。這3種途徑傳播范圍廣，造成的危害更廣。如果能有效阻斷垂直傳播途徑，可以有效減少鸚鵡熱衣原體的傳播和發(fā)病，為禽衣原體的防治提供新的技術(shù)途徑。

面對(duì)家禽衣原體病具有垂直傳播的風(fēng)險(xiǎn)。因此，選擇敏感性高的抗菌素對(duì)7～8日齡雞胚進(jìn)行注射，實(shí)施藥物阻斷，從而從傳染源頭上阻斷傳染源，阻斷對(duì)商品代家禽的危害。本次選擇天津市某種禽場(chǎng)為藥物阻斷試驗(yàn)基地，蛋種雞品種為尼克紅，存欄規(guī)模為50000套。前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)種禽產(chǎn)蛋高峰期血清抗體陽(yáng)性率達(dá)100%，卵黃膜衣原體檢出率達(dá)到65%。衣原體感染已經(jīng)嚴(yán)重危害種禽場(chǎng)的生存問(wèn)題。

1 材料

1.1 種蛋來(lái)源

選擇孵化至7～8日齡的種蛋 （種蛋由天津龍威禽業(yè)有限公司提供），首先進(jìn)行1000枚的小批量阻斷試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行10000枚藥物阻斷試驗(yàn)，對(duì)照組未采用任何藥物處理，處理后觀察其出殼體重、出雛率和卵黃蒂衣原體殘留。

1.2 藥物

鹽酸強(qiáng)力霉素和鹽酸環(huán)丙沙星原料藥:購(gòu)自天津恒基利得科技發(fā)展有限公司，批次為20130502和20120820。

2 方法

2.1 藥物的配制

2.1.1 鹽酸強(qiáng)力霉素

稱取2mg強(qiáng)力霉素，加入2ml滅菌蒸餾水，配成1mg/ml的原液 (即 1000μg/ml)。

2.1.2 鹽酸環(huán)丙沙星

稱取2.5mg，加入2.5ml蒸餾水，配成lmg/ml的原液 (即1000μg/ml)。以上藥物均用0.22μm的針頭濾器過(guò)濾除菌，置于-20℃冰箱保存。

2.2 吉姆薩染色方法

2.2.1 固定

無(wú)菌取卵黃膜，無(wú)菌生理鹽水洗滌卵黃膜，在玻片上展開(kāi)，后采用甲醇或丙酮固定10～15min。

2.2.2 染色

先用pH為6.8的PBS將吉姆薩母液做10倍稀釋，取稀釋后液體覆蓋細(xì)胞標(biāo)本，置于濕盒中，置于37℃溫箱中孵育30min后用蒸餾水沖洗，自然晾干。

2.2.3 觀察

在顯微鏡下觀察結(jié)果，陽(yáng)性結(jié)果表現(xiàn)為:Vero細(xì)胞胞質(zhì)呈天藍(lán)色，衣原體包涵體呈紫紅色的均勻顆粒，分布于Vero細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。

2.3 小批量衣原體阻斷試驗(yàn)

2.3.1 安全性觀察

接種劑量分別為:鹽酸強(qiáng)力霉素:100.0μg/枚，鹽酸環(huán)丙沙星:100.0μg/枚，接種7～8d雞胚的卵黃囊腔，0.2ml胚（50ml卵黃液/枚），石蠟封口，在37～38℃孵育。對(duì)照組接種等劑量的滅菌生理鹽水，每組各接種SPF雞胚20枚，每天照蛋，直到雞胚孵化，檢查雞胚的存活特點(diǎn)和雛雞成活特點(diǎn)。排出藥物污染問(wèn)題和藥物毒性。

2.3.2 小批量阻斷衣原體觀察

燈檢:篩選7～8日齡的污染衣原體的種蛋1300枚，進(jìn)行燈檢，標(biāo)識(shí)出種蛋的氣室和胚胎所在的位置。

阻斷前種蛋衣原體的檢測(cè):隨機(jī)從發(fā)育雞胚抽出20枚雞胚，無(wú)菌操作，取出卵黃囊膜。在滅菌生理鹽水中進(jìn)行漂洗3次以上，用眼科鉗取1×1cm大小的膜片，在載玻片上進(jìn)行黏貼，甲醇固定10min。

吉姆薩染色和測(cè)定:先用pH為6.8的PBS將吉姆薩母液做10倍稀釋，取稀釋后液體覆蓋細(xì)胞標(biāo)本，置于濕盒中，置于37℃溫箱中孵育30min后用蒸餾水沖洗，自然晾干。在顯微鏡下觀察結(jié)果，陽(yáng)性結(jié)果表現(xiàn)為:卵黃膜細(xì)胞呈天藍(lán)色，衣原體包涵體呈紫紅色的均勻顆粒，分布于膜細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。計(jì)算種蛋卵黃膜上衣原體包涵體數(shù)量 （衣原體形成單位IFU）以及陽(yáng)性率。

藥物注射:分別以鹽酸強(qiáng)力霉素 （100.0μg/枚）和鹽酸環(huán)丙沙星 （100.0μg/枚），接種8日齡。接種后每天進(jìn)行燈檢（第8～12天），觀察雞胚發(fā)育特點(diǎn)和每1000枚種蛋的孵化率以及健康雛雞的數(shù)量。

阻斷后衣原體的檢測(cè):取藥物阻斷后6～8d存活的胚胎，無(wú)菌取出卵黃組織，在玻片上進(jìn)行壓片 （1×1cm大?。?，甲醇固定10min。以稀釋的吉姆薩染色液進(jìn)行染色，檢查卵黃膜組織的衣原體包涵體。

評(píng)價(jià)指標(biāo):衣原體包涵體單位；出雛率；健康雛雞率和1日齡體重。

2.4 大批量衣原體阻斷試驗(yàn)

2.4.1 藥物劑量選擇

鹽酸強(qiáng)力霉素和鹽酸環(huán)丙沙星，注射劑量同上。

2.4.2 設(shè)備

采用荷蘭Intervet連續(xù)雞胚注射設(shè)備，測(cè)試連續(xù)注射給藥方式。

2.4.3 接種方式

接種前8d照蛋，標(biāo)記接種位置，0.2 ml/胚，卵黃囊腔接種。石蠟封口，在37～38℃孵育。鹽酸強(qiáng)力霉素和鹽酸環(huán)丙沙星分別接種10000和12000枚，對(duì)照組15000枚，每天照蛋，檢查雞胚的存活特點(diǎn)。

2.4.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

出雛率、健康雛雞率和1日齡體重；臍帶吸收特點(diǎn)。

3 結(jié)果

3.1 藥物阻斷安全性評(píng)價(jià)

分別接種鹽酸強(qiáng)力霉素和鹽酸環(huán)丙沙星后，出雛率分別為90%和95%，對(duì)照組為90.0%。健雛率分別為94.4%、94.7%和94.1%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異不顯著。這提示兩種藥物處理后，對(duì)雞胚發(fā)育和出殼雛雞的健康無(wú)影響。結(jié)果見(jiàn)表1所示。

3.2 小批量藥物阻斷前后種蛋衣原體試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)疑似感染衣原體種蛋卵黃膜進(jìn)行檢測(cè)，處理前高峰期種蛋和高峰后期種蛋衣原體單位 （IFU）分別為158和120，顯示高峰期種蛋衣原體含量比較高。結(jié)果見(jiàn)表2所示。

分別接種鹽酸強(qiáng)力霉素和鹽酸環(huán)丙沙星后，14日齡測(cè)定雞胚卵黃囊中衣原體單位分別為0.5和1.1，對(duì)照組 （藥物未處理組）為180個(gè)衣原體單位。對(duì)處理后的雞胚繼續(xù)觀察，強(qiáng)力霉素和環(huán)丙沙星組出雛率分別為95%和92.4%，顯著高于空白對(duì)照組 （86.4%）。此外，出殼后雛雞的平均體重分別為48.7g，49.2g和41.0g，這提示藥物處理后雛雞的生產(chǎn)性能顯著提高，優(yōu)于對(duì)照組。

同時(shí)，對(duì)出殼后雛雞的卵黃囊殘留進(jìn)行隨機(jī)檢測(cè)，強(qiáng)力霉素和環(huán)丙沙星衣原體單位分別為0.6和1.8單位，顯著低于空白對(duì)照組 （62衣原體單位）。結(jié)果見(jiàn)表3、表4和表5所示。

表1 藥物處理后雛雞的生產(chǎn)性能測(cè)定

表2 藥物處理前種蛋衣原體平均含量測(cè)定

表3 藥物處理后高峰期種蛋衣原體平均含量測(cè)定 （14日齡）

3.3 大批量藥物阻斷后雛雞生產(chǎn)性能指標(biāo)測(cè)定

大批量分別接種鹽酸強(qiáng)力霉素和鹽酸環(huán)丙沙星后，雞胚的出雛率分別為93.6%和95.5%，對(duì)照組為82.3%。雛雞出殼體重分別為49.2g，47.8g和42.5g。結(jié)果見(jiàn)表6。

此外，持續(xù)觀察產(chǎn)蛋高峰期的生產(chǎn)性能，發(fā)現(xiàn)鹽酸強(qiáng)力霉素和鹽酸環(huán)丙沙星組的產(chǎn)蛋率分別為94.5%和92.3%，且產(chǎn)蛋高峰持續(xù)維持達(dá)到160d之久，對(duì)照組平均產(chǎn)蛋性能為77.5%，高峰期上升30d后，產(chǎn)蛋高峰開(kāi)始下降到70%左右?？疾飚a(chǎn)畸形蛋率指標(biāo)，鹽酸強(qiáng)力霉素和鹽酸環(huán)丙沙星組分別為0.24%和0.27%，對(duì)照組為0.61%，差異顯著。

表4 藥物處理后雛雞的生產(chǎn)性能測(cè)定

表5 小批量藥物處理后雛雞卵黃囊衣原體平均含量測(cè)定

表6 藥物批量處理后雛雞的生產(chǎn)性能測(cè)定

表7 藥物批量處理后產(chǎn)蛋性能測(cè)定結(jié)果

再次從平均死亡率和淘汰率指標(biāo)來(lái)看，對(duì)照組因?yàn)楫a(chǎn)蛋性能不佳，被迫提前淘汰，達(dá)到14.5%，相關(guān)強(qiáng)力霉素和環(huán)丙沙星處理組淘汰率分別為1.7%和1.5%，顯著性低于對(duì)照組。結(jié)果見(jiàn)表7所示。

4 分析與討論

4.1 藥物阻斷前后對(duì)種蛋衣原體和雛雞攜帶衣原體的影響

禽衣原體能夠寄生在很多動(dòng)物體內(nèi)，常見(jiàn)的有鳥(niǎo)類(lèi)、哺乳動(dòng)物、人等，并導(dǎo)致一系列的疾病。尤其在鸚鵡和鴿子體內(nèi)，這種衣原體更為普遍。其傳播途徑主要有飛沫、分泌物、排泄物等。有學(xué)者在研究中指出，雞胚感染也是衣原體的傳播途徑之一。

本次試驗(yàn)顯示，鹽酸強(qiáng)力霉素和鹽酸環(huán)丙沙星接種處理雞胚后，雞胚卵黃囊中衣原體單位與對(duì)照組 （藥物未處理組）呈現(xiàn)顯著性降低。出殼的雛雞出雛率、健雛率和出生體重顯著性高于空白對(duì)照組，這提示藥物處理后通過(guò)殺死雞胚中的衣原體發(fā)育，導(dǎo)致雛雞的生產(chǎn)性能顯著性提高，這說(shuō)明藥物阻斷衣原體在雞胚中傳播是安全的，而且也是非常有效，適合在基層種禽場(chǎng)進(jìn)行技術(shù)推廣。

4.2 藥物阻斷后對(duì)產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能的影響

將近40%患有輸卵管囊腫疾病的蛋雞體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)鸚鵡熱衣原體的存在，揭示出輸卵管積水嚴(yán)重程度以及雞產(chǎn)蛋能力受到衣原體的直接影響。家禽免疫系統(tǒng)對(duì)這種衣原體具有較高的抗性，很多家禽即便感染了這種病菌，也沒(méi)有出現(xiàn)任何疾病癥狀。但若感染衣原體的家禽體內(nèi)存在家禽感染禽偏肺病毒 （aMPV）、鼻氣管鳥(niǎo)疫桿菌 （ORT）、大腸桿菌 （E.coli）的話，衣原體就會(huì)開(kāi)始威脅到家禽健康，甚至引發(fā)嚴(yán)重的流行性疾病。衣原體一旦感染蛋雞群，造成30～50%高峰期產(chǎn)蛋雞因?yàn)樯a(chǎn)性能不良而被被迫淘汰。

通過(guò)強(qiáng)力霉素和環(huán)丙沙星藥物處理后，高峰期產(chǎn)蛋率均超過(guò)90%，且產(chǎn)蛋高峰持續(xù)維持達(dá)到4個(gè)月之久，同時(shí)產(chǎn)畸形蛋數(shù)量顯著性降低，死淘率也隨著降低，這說(shuō)明藥物阻斷方法對(duì)于家禽衣原體的控制是切實(shí)可行的，需要大力進(jìn)行技術(shù)推廣。但如果連續(xù)鹽酸強(qiáng)力霉素和鹽酸環(huán)丙沙星組進(jìn)行藥物阻斷，衣原體產(chǎn)生的耐藥性以及多重耐藥性可能影響藥物阻斷的效果，今后試驗(yàn)中需要考慮其風(fēng)險(xiǎn)因素。

5 結(jié)論

本次小試和大批量試驗(yàn)顯示，對(duì)種蛋確診感染衣原體的雞胚利用鹽酸強(qiáng)力霉素和鹽酸環(huán)丙沙星處理，劑量為100.0μg/枚，對(duì)雞胚發(fā)育無(wú)不良反應(yīng)。處理后出殼雛雞的成活率、出生體重顯著性升高。同時(shí)，高峰期產(chǎn)蛋性能顯著性增加。利用該項(xiàng)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)阻斷衣原體的垂直傳播。