朱雅寧 石瑜 （天津市動物疫病預防控制中心 300402）

天津地區(qū)牛衣原體流行病學調(diào)查

朱雅寧 石瑜 （天津市動物疫病預防控制中心 300402）

鑒于天津地區(qū)牛衣原體病已廣泛存在，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，為摸清天津地區(qū)牛衣原體流行情況，采集了天津市4個區(qū)縣10個養(yǎng)殖場 （戶）的樣品進行血清學和分子生物學檢測，初步了解天津地區(qū)牛衣原體病的流行現(xiàn)狀，調(diào)查表明：天津各地區(qū)均存在不同程度的牛衣原體感染，而且衣原體陽性率高低與家畜飼養(yǎng)量有密切相關(guān)性；公牛的血清樣品檢測出陽性，應(yīng)該重視種公畜精液污染衣原體問題。這些可為天津市研究制定牛衣原體病的預防提供技術(shù)依據(jù)。

牛衣原體?。谎鍖W方法；分子生物學方法；流行病學；調(diào)查；天津地區(qū)

牛衣原體病是由鸚鵡熱衣原體感染牛引起的一種具有廣泛癥候群的接觸性傳染病，可以引起妊娠母牛流產(chǎn)、公牛精囊炎綜合征、犢牛支氣管肺炎、腸炎等癥狀。由于本病給奶牛場造成的不僅是胎兒死亡，而且更嚴重的是產(chǎn)奶量大大降低，造成飼料、人力、醫(yī)藥等巨大浪費，給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，所以牛衣原體病的危害應(yīng)引起足夠重視。

為了掌握天津地區(qū)牛衣原體流行特點，2012～2014年期間，我們通過對天津地區(qū)4個區(qū)縣的不同養(yǎng)殖環(huán)境的奶牛采集樣品進行檢測，初步了解天津地區(qū)牛奶衣原體病的流行現(xiàn)狀，為順利開展牛衣原體病綜合防控技術(shù)示范工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品

共采集牛血清樣品1887份，精液和棉拭子樣品270份。分別采自天津?qū)氎?、武清、北辰、薊縣4個區(qū)縣的10個養(yǎng)殖場 （戶）。見表1和表2。

1.2 診斷試劑

（1）衣原體間接凝集診斷試劑盒 （IHA）：購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，抗原批號130524、140524，稀釋液130524、140524，陽性血清 130403、140403，陰性血清130524、 140524。

（2）鸚鵡熱衣原體 （ACP）核酸檢測試劑盒：購自北京索奧生物醫(yī)藥科技有限公司，批號為20130615、20140615。

1.3 方法

表1 牛血清樣品

表2 牛精液和棉拭子樣品

1.3.1 間接血凝試驗

（1）衣原體IHA抗原，使用前搖勻。

（2）每孔加入75μL稀釋液。

（3）在第一孔加入25μL被檢血清，呈4倍遞增稀釋3孔 （1∶4～1∶16）， 第 3 孔棄去 25μL。 同一板上同時設(shè)陽性、陰性和空白對照各2孔 （2個陽性、2個陰性，空白2孔）。

（4）每孔加入稀釋的抗原25μL，置微型振蕩器上震蕩2min，封口，在37℃作用2h后判定結(jié)果。

判定標準：在對照孔成立的條件下，觀察各待檢血清孔，被檢血清1∶16孔為++及以上凝集者為陽性，1∶4孔為++及以下者為陰性。

1.3.2 熒光PCR法

用鸚鵡熱衣原體 （ACP）核酸檢測試劑盒 （PCR-熒光探針法）。

（1） DNA提取

標本預處理

①精液樣品：將精液充分混勻，取0.5mL轉(zhuǎn)至1.5mL干凈離心管，加入等體積4%NaOH，充分混勻，室溫放置10min，13000rpm離心5min，棄上清，保留沉淀。

②棉拭子樣品：取1mL生理鹽水加入5mL離心管，充分洗滌棉拭子，將洗滌液轉(zhuǎn)至1.5mL干凈離心管中，13000rpm離心5min，棄上清，保留沉淀。

DNA提?。合蛏鲜鰳吮局屑尤?0μL核酸提取液月充分混勻，100℃裂解10min。13000rpm離心 3min，取上清液4μL做PCR反應(yīng)。

陰性質(zhì)控品：取50μL陰性質(zhì)控品加入50μL核酸提取液月，充分震蕩。然后100℃裂解10min，然后13000rpm離心3min，取上清液4μL做PCR反應(yīng)。

ACP-陽性質(zhì)控品：直接取4μL進行PCR擴增。或按照PCR擴增介紹方法進行定量分析。

（2） PCR擴增

從試劑盒中取出ACP-PCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。

設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N（N=樣本數(shù)+1管陰性對照+4管陽性對照），每個測試反應(yīng)體系配制為：ACP-PCR MIX 24 μL， Taq 酶系 2μL。

（3）結(jié)果判定

如果Ct值＜38，判定為陽性。

如果38＜Ct值＜40，為可疑，建議重新檢測，重新檢測若38＜Ct值＜40判為陽性，否則為陰性。

如果Ct值≥40，判定為陰性。

2 結(jié)果

2.1 不同區(qū)縣牛流產(chǎn)衣原體檢測結(jié)果

利用IHA方法對采集的1887份牛血清樣品進行檢測。共檢測出93份陽性樣品，平均抗體陽性率為4.93%。其中寶坻、武清、北辰、薊縣的抗體陽性率分別5.66%、4.15%、5.18%、6.00% （結(jié)果見表3）。

表3 不同區(qū)縣牛血清抗體檢測結(jié)果

2.2 不同生長階段牛血清抗體檢測結(jié)果

利用IHA方法對采集的奶牛、犢牛、公牛的1887份血清樣品進行檢測，共檢測出93份陽性樣品，平均抗體陽性率為4.93%。其中奶牛、犢牛、公牛的抗體陽性率分別為5.74%、3.64%、4.00% （結(jié)果見表4）。

表4 牛血清抗體檢測結(jié)果

2.3 牛病原學樣品檢測結(jié)果

利用熒光PCR方法對采集的270份樣品進行檢測，共檢測出12份陽性樣品，平均陽性率為4.44%，其中奶牛陰道拭子樣品的陽性率較高，為4.55%，公牛精液樣品的陽性率較低，為4.00% （結(jié)果見表5）。

表5 牛精液病原學檢測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

（1）本次利用IHA方法對天津4個區(qū)縣的部分牛場進行衣原體血清學和病原學監(jiān)測，抗體平均陽性檢出率為4.93%，病原學陽性率為4.44%。結(jié)果表明，天津各地區(qū)均存在不同程度的牛衣原體感染，而且衣原體陽性率高低與家畜飼養(yǎng)量有密切相關(guān)性，飼養(yǎng)密度大陽性率高。

（2）本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，抗體陽性率較高的是奶牛和公牛的血清樣品，分別為5.74%、4.00%。對應(yīng)的抗原陽性率較高的是母牛陰道拭子樣品，為4.55%。病原學檢測中，公牛精液的陽性率稍低于奶牛陰道拭子的陽性率。因此，公牛精液和母牛在本病傳播中起關(guān)鍵作用，尤其是公牛的精液污染衣原體在傳播中起主要作用，母牛感染后又通過陰道向體外排菌，感染犢牛群和飼養(yǎng)人員，這提示除了重視對母畜的防控外，還應(yīng)該重視種公畜精液污染衣原體問題。及時阻斷衣原體通過精液垂直傳播衣原體，造成懷孕母畜群流產(chǎn)和死胎的危險。

（3）分析原因，衣原體病的流行主要有以下幾方面：第一，對衣原體的危害性認識不足，沒有采取相應(yīng)的綜合防治措施，導致衣原體病在家畜中大面積蔓延；第二，天津地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，市場交易、運輸頻繁，從而加速衣原體病的擴散。通過實地調(diào)查，更進一步表明，養(yǎng)殖場應(yīng)對衣原體病引起足夠的重視。具體建議措施如下：第一，建立封閉的飼養(yǎng)系統(tǒng)，建立嚴格的衛(wèi)生消毒制度。嚴格把好工作區(qū)大門通道消毒、圈舍消毒、場區(qū)環(huán)境消毒的質(zhì)量，以有效控制發(fā)生衣原體接觸傳染的機會。對病死畜要集中無害化處理，同時用火堿等消毒劑進行嚴格消毒；第二，建立科學合理的免疫程序，加強衣原體病的日常監(jiān)測。對確診感染衣原體的種畜予以淘汰，未感染的應(yīng)及時接種衣原體滅活疫苗；第三，選擇藥物預防和治療。

朱雅寧 （1982.3-），女，大學本科，獸醫(yī)師，主要從事實驗室檢測工作。