李小芳， 馮小強， 朱元成

(天水師范學(xué)院 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院， 甘肅 天水 741001)

糠醛縮殼寡糖席夫堿及Cu(Ⅱ)配合物與DNA之間的作用機制

李小芳， 馮小強*， 朱元成

(天水師范學(xué)院 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院， 甘肅 天水 741001)

以糠醛和殼寡糖反應(yīng)生成的席夫堿，與不同摩爾比的Cu2+配位合成配合物FCOS-Cu11、FCOS-Cu13和FCOS-Cu31，并研究配合物與DNA之間的作用機制。采用循環(huán)伏安、紫外-可見吸收光譜、粘度和DNA熔點測定的方法，分別研究了席夫堿及配合物與DNA之間的作用機制。合成的3種配合物具有電化學(xué)活性。加入DNA后，配合物的氧化峰電流減小，峰電位微弱移動。配合物的吸收峰強度減色顯著，同時伴有峰位紅移現(xiàn)象。配合物加入后，DNA的相對粘度和熔點呈增大趨勢。結(jié)果表明，席夫堿及配合物與DNA之間存在嵌插結(jié)合，且3種配合物中的Cu2+含量與DNA的嵌插作用強度有關(guān)，結(jié)合強度依次為FCOS-Cu11>FCOS-Cu13> FCOS-Cu31。

席夫堿； 配合物； 結(jié)合DNA

Abstract: Schiff base was synthesized by the reaction of oligochitosan with furfuraldehyde, and acted it as ligand to prepare different molar Schiff base copper complexes which possessed electrochemical activity. The action mechanism of the complex and DNA was studied by spectrometry, viscosity measurement, cyclic voltammeiry and melting point experiment. The results indicate that the reaction of central Cu2+at glassy carbon electrodes is controlled by diffusion process mechanism. The intensity of the maximal absorption peaks of the complexes is weakened with the increasing of DNA concentration, and the oxidation peak current is decreased but no new redox peak appeared. At the same time, the viscosity and melting point of DNA are increased. There are intercalation action between the complex and DNA, and DNA-binding ability order is FCOS-Cu11>FCOS-Cu13>FCOS-Cu31.

Keywords: Schiff base; complex; DNA binding

1 引 言

席夫堿是一類具有良好的配位能力和優(yōu)良生物活性的化合物，近年來對席夫堿銅配合物的殺菌、抗菌、抗癌活性研究頗多，如李桂芝等[1]發(fā)現(xiàn)含硫席夫堿及其銅配合物對大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的殺菌活性優(yōu)于配體；畢思瑋等[2]發(fā)現(xiàn)氨基酸系列水楊醛席夫堿與銅配合物的抗菌活性隨配體中氨基酸殘基非配位基因R的增大而減小，這說明隨穩(wěn)定性的提高，抗菌活性減??；唐婷等[3]發(fā)現(xiàn)縮胺、縮胺基脲、縮胺基酸3類席夫堿的銅配合物對大腸桿菌的抑制能力較配體強。但是，某些席夫堿的毒副作用極大程度上限制了其應(yīng)用，在提高活性的同時必須有效降低毒副作用是研究者關(guān)注的問題。

抗腫瘤藥物發(fā)揮藥效與脫氧核糖核酸(DNA)的嵌插鍵合方式及作用程度有關(guān)。一些抗腫瘤藥物能夠嵌插到DNA堿基對中而起藥理作用。研究藥物與DNA之間的作用機制，對通過分子設(shè)計篩選有效治療藥物具有十分重要的意義。殼寡糖(簡稱COS)是由殼聚糖解聚而成的低分子殼聚糖,天然無毒、水溶性好, 具有廣譜及高抑菌活性、消炎抗病毒、止血、降酯和膽固醇的作用，而且可通過活化免疫系統(tǒng)抑制腫瘤細(xì)胞顯示抗癌活性[4]。有關(guān)殼聚糖及衍生物與DNA相互作用的研究頗多，如齊炎等采用光譜法研究了殼聚糖季銨鹽與小牛胸腺DNA的作用，發(fā)現(xiàn)兩者主要以嵌插方式結(jié)合，使得DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)更緊密[5]；張海容等采用光譜法和堿變性曲線等方法研究了不同取代度硫酸酯化殼聚糖與DNA的相互作用機理，發(fā)現(xiàn)硫酸酯化殼聚糖與熒光探針DNA/EB的作用存在嵌插和靜電作用兩種模式，硫酸酯化殼聚糖是一種有希望的基因治療靶向分子[6]。

我們前期研究了羧甲基殼聚糖金屬配合物(Cu,Cr,Ag,Co)[7-10]以及丁二?；瘹す烟窍⊥僚浜衔颷11]與鯡魚精DNA的作用機制。基于以上所述，我們以糠醛和殼寡糖反應(yīng)生成的席夫堿為配體，和不同摩爾比的Cu2+配位得到系列配合物，并研究了席夫堿及配合物與DNA之間的結(jié)合方式。該研究工作可以對診斷治療與DNA有關(guān)疾病的藥物設(shè)計提供理論依據(jù)。

2 實 驗

2.1 試劑與儀器

糠醛(分析純，天津市化學(xué)試劑二廠)，氯化銅(分析純，西安化學(xué)試劑廠)，殼寡糖(相對分子質(zhì)量<5 000，濟南海得貝海洋生物工程有限公司)，鯡魚精DNA(Sigma公司產(chǎn)品)。

UV-2450型紫外-可見分光光度計(日本島津)，CHI660B型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)，Sp-752紫外可見分光光度計(上海光譜)。

2.2 席夫堿及Cu(Ⅱ)配合物的制備

2.3 配合物與DNA之間的作用

采用循環(huán)伏安法、紫外-可見吸收光譜、粘度和DNA熔點測定的方法，研究了配合物與DNA之間的作用機制，具體實驗方法參見文獻(xiàn)[12-13]。

3 結(jié)果與討論

3.1 循環(huán)伏安法

設(shè)定掃描速率為0.6 V/s， 在-0.6～1.2 V電位范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)FCOS沒有任何氧化還原峰，而3種配合物都在玻碳電極表面的氧化反應(yīng)速率較大，但出現(xiàn)的還原峰都很弱，其中FCOS-Cu11在0.074 V和0.448 V處有兩個氧化峰，F(xiàn)COS-Cu13在0.268 V處有一個氧化峰，F(xiàn)COS-Cu31在0.121 V和0.271 V處有兩個氧化峰，表明FCOS與Cu2+參與了配位反應(yīng)，生成的配合物都具有電化學(xué)活性。當(dāng)掃描速度增加時，F(xiàn)COS-Cu11、FCOS-Cu13和FCOS-Cu31的氧化峰電位Ep都發(fā)生了正移，并且氧化峰電流Ip呈現(xiàn)增強趨勢，如圖1所示。通過作圖發(fā)現(xiàn)FCOS-Cu11、FCOS-Cu13和FCOS-Cu31的氧化峰電流與掃描速度之間存在線性關(guān)系，線性方程依次為：Ipa(10-5A)=-1.01-7.58v(R=0.999)、Ipa(10-5A)=-2.25-11.72v(R=.992)和Ipa(10-5A)=-3.14-9.84v(R=0.994)，如圖2所示，表明配合在玻碳電極上的反應(yīng)由吸附過程控制 。

圖1 掃速速率對不同配比FCOS-Cu循環(huán)伏安曲線的影響

Fig.1 Effect of scan speed rate on CV curves of FCOS-Cu

加入DNA后，F(xiàn)COS-Cu11在0.074 V的氧化電位負(fù)移了56 mV，峰電流下降2.336×10-5A，而在0.448 V處的氧化峰并沒有發(fā)生位移，峰電流下降3.172×10-5A；FCOS-Cu31在0.121 V和0.271 V處的氧化電位，分別正移了3 mV和58.7 mV，電流分別降低了6.05×10-5A和1.14×10-5A；FCOS-Cu13在0.268 V的氧化電位負(fù)移了0.120 7 V，電流降低了4.215×10-5A，如圖3所示。峰電流的降低可能是由于配合物分子與DNA分子發(fā)生了鍵合作用，使得溶液中自由配合物分子數(shù)減少，導(dǎo)致氧化還原峰電流減小[14-15]。3種配合物在加入DNA后都有電流減小的趨勢，同時峰電位有微弱的移動，這就說明配合物與DNA之間發(fā)生了作用。

圖2 Ip～v的關(guān)系式

圖3 配合物與DNA相互作用的循環(huán)伏安圖

3.2 紫外光譜法

在配合物中分別滴加300 μL DNA后，配合物的紫外可見吸收光譜發(fā)生了顯著的改變，其中FCOS原位于275.2，224，200.2 nm的吸收峰，峰位分別發(fā)生紅移(紅移了11.4 nm，強度減色34.5%)、不變和消失，并在261.8 nm出現(xiàn)新吸收峰；FCOS-Cu31原位于271.6 nm和200.4 nm的吸收峰，峰位分別紅移了5 nm和19 nm，對應(yīng)的吸收強度分別增色93.46%和減色23.91%；FCOS-Cu11原位于273.8 nm和202.6 nm的吸收峰，峰位分別紅移4.6 nm和17 nm，對應(yīng)的吸收強度分別增色37.4%和減色39.8%；FCOS-Cu13原位于271.6 nm和204.6 nm的吸收峰，峰位分別紅移5.6 nm和17.2 nm，對應(yīng)的吸收強度分別增色114.7%和減色32.7%，如圖4所示。已有文獻(xiàn)報道，如果小分子與DNA之間存在嵌插作用，DNA加入后使小分子的吸收光譜發(fā)生紅移現(xiàn)象和減色效應(yīng)[16]。紫外可見吸收光譜圖的變化說明了席夫堿及3種配合物都以嵌入方式和DNA作用。此外，吸收強度降低的程度與藥物分子插入DNA的程度呈正相關(guān)，吸收強度降低的越明顯，說明插入程度越強。從圖4可以看出，在同濃度配合物中滴加同濃度的DNA時，F(xiàn)COS-Cu11配合物的強度降低程度最大，F(xiàn)COS-Cu13次之，表明配合物與DNA之間的結(jié)合強度依次為FCOS-Cu11>FCOS-Cu13>FCOS-Cu31。

c(DNA)=0.1 g/L (100 μL per scan, 1～4： 0～300 μL)

3.3 粘度法

不同濃度的糠醛席夫堿及配合物對DNA粘度的影響如圖5所示。隨著糠醛席夫堿及配合物濃度的逐漸增大，DNA的相對粘度隨之增大。已有文獻(xiàn)報道，如果小分子與DNA之間存在嵌插作用，DNA的相對粘度會增大[17]。粘度測定實驗結(jié)果表明，席夫堿及3種配合物與DNA之間都存在嵌插作用。

圖5 配合物加入前后的DNA粘度

Fig.5 DNA viscosity before and after the addition of the compounds

3.4 DNA熔點的測定

糠醛縮殼寡糖席夫堿及配合物對DNA的熔點產(chǎn)生了明顯的影響，如圖6所示，F(xiàn)COS、FCOS-Cu11、FCOS-Cu13和FCOS-Cu31的加入，分別使DNA的熔點從70 ℃升高到75，74.5，72，75.5 ℃。藥物小分子與DNA之間主要存在嵌插作用、溝槽作用和靜電作用這3種方式。已有文獻(xiàn)報道，如果藥物小分子與DNA之間存在嵌插作用，藥物小分子與DNA的堿基對之間能發(fā)生π-π堆積，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)變得穩(wěn)定，從而使DNA的熔點明顯升高[18]。如果藥物小分子與DNA之間僅僅是簡單的溝槽作用、靜電或氫鍵作用弱結(jié)合，DNA熔點的變化相對小很多。圖6說明了席夫堿及配合物與DNA之間主要以嵌插作用結(jié)合。

圖6 配合物對DNA熔點的影響

4 結(jié) 論

本文以糠醛和殼寡糖反應(yīng)生成的席夫堿，與不同摩爾比的Cu2+配位得到具有電化學(xué)活性的配合物FCOS-Cu11、FCOS-Cu13和FCOS-Cu31，且配合物在玻碳電極上的反應(yīng)主要由吸附過程控制。在DNA的作用下，配合物的氧化峰電流明顯減小，峰電位發(fā)生位移。配合物的吸收峰峰位有紅移趨勢，吸收強度減色明顯。配合物使DNA的相對比粘度和熔點增大。結(jié)果表明，席夫堿及配合物以嵌入方式和DNA作用。合成的席夫堿和銅配合物是一類潛在的抗腫瘤藥物，其體外抑菌、抗腫瘤活性有待進一步研究。

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李小芳(1983-)，女，甘肅甘谷人，碩士，高級實驗師，2009年于蘭州大學(xué)獲得碩士學(xué)位，主要從事功能高分子及有機稀土配位的研究。

E-mail: tslxffxq@163.com馮小強(1979-)，男，甘肅華亭人，碩士，副教授，2007年于蘭州大學(xué)獲得碩士學(xué)位，主要從事功能高分子的研究。

E-mail: fengxiaoqiang1979@163.com

DNABindingActivityofCopperComplexwithSchiffBaseDerivedfromOligochitosanandFurfuraldehyde

LI Xiao-fang, FENG Xiao-qiang*, ZHU Yuan-cheng

(SchoolofChemicalEngineeringandTechnology,TianshuiNormalUniversity,Tianshui741001,China)

*CorrespondingAuthor,E-mail:fengxiaoqiang1979@163.com

O611.4

A

10.3788/fgxb20173810.1359

1000-7032(2017)10-1359-07

2017-03-18；

2017-08-18

甘肅省青年科技基金計劃(1606RJYE247)； 天水市科技支撐項目(2016年)； 甘肅省高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目(2016B-071)； 天水師范學(xué)院中青年教師科研項目(TSA1508)資助 Supported by Youth Science and Technology Fund Program of Gansu Province(1606RJYE247); Science and Technology Support Project of Tianshui City(2016); Scientific Research Project Higher Education Institutions of Gansu Province (2016B-071); Research Project for Young and Middle-aged Teachers of Tianshui Normal University(TSA1508)