敖已倩云，申光茂，王夢瑤，劉家路，潘宇，何林

（1西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/農(nóng)藥毒理與科學(xué)應(yīng)用實驗室，重慶 400716；2西南大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，重慶 400716；3西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400716）

朱砂葉螨β-COP和Sro基因鑒定及其沉默致死效果

敖已倩云1,2，申光茂1,2，王夢瑤1,2，劉家路1,2，潘宇3，何林1,2

（1西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/農(nóng)藥毒理與科學(xué)應(yīng)用實驗室，重慶 400716；2西南大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，重慶 400716；3西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400716）

【目的】明確朱砂葉螨（Tetranychus cinnabarinus）β-COP和Sro兩條基因分子生物學(xué)信息，并基于優(yōu)化的RNAi體系評價它們的致死效應(yīng)，為篩選適用于RNAi防控的靶基因打下基礎(chǔ)?！痉椒ā渴紫瓤寺∧康幕虻娜L，并通過序列的同源比對、保守區(qū)域及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測以及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建明確其分子生物學(xué)信息；其次通過減少dsRNA降解因素、并適時補充dsRNA等方法改進(jìn)朱砂葉螨的RNAi體系，從而延長干擾時間。利用定量PCR技術(shù)檢測特定時間點的沉默效率，評價優(yōu)化RNAi體系后的沉默效果；最后在沉默目的基因β-COP和Sro后，檢測朱砂葉螨在各特定時間點的死亡率，評價目的基因在RNAi下的致死效果，并觀察相應(yīng)的致死表型?！窘Y(jié)果】β-COP開放閱讀框長度為2 688 bp，編碼895 aa，屬于“WD40 superfamily”及“Coatomer_ WDAD superfamily”，包含了“WD 40”和“Coatomar_WDAD”的保守區(qū)域。Sro的開放閱讀框長度為1 119 bp，編碼372 aa，具有典型的短鏈脫氫酶所特有的兩個特征，即與NADP+biding 結(jié)合位點基序“TGxxxGx”和“YxxxK”及其上游的天冬氨酸（Asn）、絲氨酸（Ser）活性位點。優(yōu)化后的RNAi體系可在96 h內(nèi)能穩(wěn)定保持50%左右的沉默效率，使用該方法干擾朱砂葉螨β-COP和Sro兩條致死基因48 h后試驗組與對照組的死亡率均有顯著性差異，用β-COP的dsRNA片段干擾雌成螨108 h后，死亡率達(dá)57.4%；用Sro的dsRNA片段干擾若螨96 h后，死亡率達(dá)28.8%。死亡個體均具有明顯的表型，β-COP試驗組死亡表型為4對足蜷縮在體側(cè)；Sro試驗組則在靜伏期死亡或在蛻皮過程中無法蛻皮而死亡?！窘Y(jié)論】優(yōu)化的朱砂葉螨RNAi技術(shù)有穩(wěn)定持續(xù)的沉默效果。β-COP和Sro與RNAi技術(shù)相結(jié)合，驗證了這兩條目的基因的沉默可對朱砂葉螨產(chǎn)生一定的致死效應(yīng)，表明此類基因與技術(shù)加成的模式極具開發(fā)和利用的潛力，為今后基因功能驗證和篩選以及開發(fā)以 RNAi技術(shù)為基礎(chǔ)的朱砂葉螨防控方法提供了依據(jù)。

朱砂葉螨；RNA干擾技術(shù)；致死效應(yīng)；綜合綠色防控

Abstract:【Objective】 The objective of this study is to clarify the molecular information of Sro and β-COP genes of Tetranychus cinnabarinus, using the optimized RNAi system to study the lethal effects of these two genes on the T. cinnabarinus,and to provide a basic information to identify target genes, which are useful in the application of RNAi control. 【Method】 Firstly,full sequences of the two genes were identified and the bioinformatics were analyzed by homologous alignment of the sequence,prediction of the conserved region, protein structure and construction of the phylogenetic tree. Secondly, the RNAi system was improved by reducing the factors that will degrade the dsRNA, timely replenishment of dsRNA and other methods, and the gene silencing effect of the new RNAi system was evaluated by quantitative PCR technique. Finally, based on the optimized RNAi system,the expressions of β-COP and Sro genes were silenced to evaluate the lethal effects, and the lethal phenotypes were observed.【Result】The length of open reading frame of β-COP is 2 688 bp, encoding a 895 aa protein, which belonging to “WD40 superfamily” and “Coatomer_WDAD superfamily”, containing the conserved regions of “WD 40” and “Coatomar_WDAD”. The length of open reading frame of Sro is 1 119 bp, encoding a 372 aa protein. It has two characteristics of typical short chain dehydrogenase: one is binding sequence of NADP+biding binding sequence “TGxxxGx”, the other is “YxxxK” Motif and its upstream aspartic acid (Asn), serine (Ser) active sites. The optimized RNAi could maintain the silencing efficiency of about 50%after 96 h. Based on this system, the expressions of β-COP and Sro were silenced and the death rate showed significant differences between experimental group and control group after 48 h. β-COP dsRNA caused 57.4% mortality rates at 108 h post-treatment, and Sro dsRNA caused 28.8% death rates at 96 h post-treatment. In addition, the phenotype of dead individuals in the β-COP group showed that the four pairs of feet were curled up on the body side and died, and in the Sro group, the mites dead during the molting process. 【Conclusion】The optimized RNAi technique has stable and continuous silencing effect on the T. cinnabarinus. The combination of β-COP and Sro genes functional verification with RNAi technique showed that the silencing of the two target genes can produce a certain lethal effect on the mite. It also shows that the combination of gene and technology has great potential for development and utilization, which can lay a basis for the future functional verification, screening gene and developing the RNAi technology to control the T. cinnabarinus.

Key words:Tetranychus cinnabarinus; RNA interference technology; lethal effect; comprehensive prevention and green control

0 引言

【研究意義】朱砂葉螨（Tetranychus cinnabarinus）是一種在溫帶地區(qū)廣泛分布的雜食性農(nóng)林害螨，在中國各地均有發(fā)生，可危害140科1 100種作物或雜草，以成若螨在葉背吸取汁液危害，嚴(yán)重時導(dǎo)致全葉干枯脫落，縮短結(jié)果期，影響產(chǎn)量。多年來，施用化學(xué)農(nóng)藥是防治該害螨的主要方式，但由于螨體小、世代多、繁殖速度快、發(fā)育歷期短的特點，極易產(chǎn)生抗藥性[1]。RNAi技術(shù)作為一種基因沉默的有效工具，近年來成為一種有效的有害生物防治新方法而受到廣泛關(guān)注[2-4]。因此，篩選適用于RNAi技術(shù)的朱砂葉螨致死基因，既可增進(jìn)對基因功能的了解，對該害螨新型防治方法的開發(fā)也具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】RNAi技術(shù)是驗證基因功能的重要技術(shù)之一，如何將 dsRNA成功導(dǎo)入目標(biāo)生物體內(nèi)是沉默目的基因的關(guān)鍵步驟，目前主要使用的方法有飼喂法、注射法和利用載體媒介將 dsRNA導(dǎo)入等[5-11]。2006年，ARAUJO 等[12-13]通過飼喂法沉默了長紅烈蝽（Rhodnius prolixus）NP2和蘋果透翅蛾（Epiphyas postvittana）EposCXE1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過飼喂dsRNA降低了靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平，表明通過飼喂可以達(dá)到基因沉默的效果。由于該方法操作簡單方便，對蟲體造成的傷害小，因此其不僅適用于一些難于采用注射RNAi研究的小型害蟲，而且還是一種快速篩選靶基因的途徑，為害蟲、害螨的可持續(xù)治理提供重要的依據(jù)與保障。植食性葉螨的RNAi一般采用飼喂法，由于體外合成的dsRNA易降解，因此SHI等[14]基于RNAi的朱砂葉螨基因功能驗證試驗基本限定在48 h內(nèi)。但要驗證目的基因的沉默致死效應(yīng)需要觀察更長的時間，因此亟需對朱砂葉螨的飼喂法進(jìn)行改良。同時，要將RNAi技術(shù)應(yīng)用于害蟲、害螨的防控中，需要選擇合適的靶基因，目前常用的候選基因功能大都與害蟲、害螨的生長發(fā)育、生殖行為和繁殖能力密切相關(guān)，干擾后能使害蟲、害螨出現(xiàn)畸形、交配能力下降、繁殖力減弱，甚至死亡等現(xiàn)象，這些基因有的是調(diào)控能量代謝方面的酶（質(zhì)子代謝的V-ATPase，毒物質(zhì)代謝的細(xì)胞色素P450酶等）[14-16]，也有與生長發(fā)育相關(guān)的激素（蛻皮激素、保幼激素等）[17-20]，還有針對神經(jīng)調(diào)控通路的受體和酶[7]。在此基礎(chǔ)上通過與其他技術(shù)相結(jié)合，使RNAi技術(shù)用于防控害蟲、害螨的潛能大大提升，例如TIAN等[21]用大腸桿菌表達(dá)dsRNA方法來飼喂甜菜夜蛾（Spodoptera exigua），發(fā)現(xiàn)連續(xù)取食dsRNA后幾丁質(zhì)合成酶基因SeCHSA的表達(dá)受到了抑制，且昆蟲的蛻皮發(fā)育也受到了阻礙；PITINO等[22]通過對桃蚜（Acyrthosiphon pisum）飼喂表達(dá)腸道基因Rack1和唾腺基因MpC002 dsRNA的轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因的表達(dá)被抑制達(dá)60%以上，而且目標(biāo)基因被抑制的桃蚜所產(chǎn)的后代數(shù)量更少；THAIRU等[9]將siRNA與納米顆粒結(jié)合形成復(fù)合物，沉默了3種蚜蟲（Acyrthosiphon pisum、Aphis glycines和Schizaphis graminum）的胡蘿卜素脫氫酶（tor）基因，可影響蚜蟲的生長發(fā)育并出現(xiàn)相關(guān)表型；ZHANG等[5]利用質(zhì)體介導(dǎo)的 RNAi技術(shù)防控馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata），并取得較好的效果。在生物體中，β-COP與其他外被體蛋白相互作用共同形成一種復(fù)合物COPI。COPI介導(dǎo)的囊泡逆向轉(zhuǎn)運在維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體結(jié)構(gòu)與形態(tài)、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、生長發(fā)育和能量代謝等方面發(fā)揮重要作用，特別是對卵巢的發(fā)育及食物消化代謝有影響。ISOE等[23]報道COPI缺陷的埃及伊蚊（Aedes aegypti）在96 h后死亡率高達(dá)80%。Sro作為蛻皮激素合成過程中的限速還原酶，在家蠶（Bombyx mori）和果蠅（Drosophila melanogaster）的報道中均表明其對生長發(fā)育中的蛻皮過程可產(chǎn)生重要影響，該基因缺陷后可致畸、致死[11,24-25]?！颈狙芯壳腥朦c】雖然適用于 RNAi技術(shù)防控的靶基因篩選已在多種昆蟲中進(jìn)行了研究，但是關(guān)于朱砂葉螨靶基因的篩選還未見報道。因此，選取可能會對螨類的生長發(fā)育和生命活動有重要影響的兩條基因，即與能量代謝、神經(jīng)調(diào)節(jié)相關(guān)的β′-外被體蛋白（簡稱β-COP）和與生長發(fā)育相關(guān)的蛻皮激素-β-11-短鏈脫氫酶（簡稱 Sro）基因為研究對象，在明確其分子生物學(xué)信息的基礎(chǔ)上評估它們用于RNAi時的致死效果?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以朱砂葉螨為研究對象，使用改良的RNAi技術(shù)，在保證目的基因沉默效率的基礎(chǔ)上延長干擾時間，記錄朱砂葉螨的死亡率及死亡表型等，篩選適用于RNAi技術(shù)的致死基因，為基因功能的研究提供新思路，并為該螨的綠色防控打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于 2016—2017年在西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥毒理與科學(xué)應(yīng)用實驗室完成。

1.1 供試螨源

供試朱砂葉螨于 1997年采于重慶市北碚區(qū)田間豇豆苗上，飼養(yǎng)于室內(nèi)豇豆苗上，飼養(yǎng)條件：溫度25—27℃，相對濕度35%—55%，光周期14 h光照∶10 h黑暗，在飼養(yǎng)期間沒有接觸或使用任何藥劑。

1.2 主要試劑

動物組織總RNA提取試劑盒（TIANGEN公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit，TaKaRa公司）；Taq DNA聚合酶（TaKaRa公司）；瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒（TIANGEN公司）；載體（pGEM-T Easy Vector，TaKaRa公司）；感受態(tài)細(xì)胞T1（TaKaRa公司）；qPCR 試劑（GoTaq? qPCR Master Mix，Promega公司）；dsRNA基因體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司）。

1.3 主要儀器

核酸蛋白質(zhì)濃度測定儀 NanoVue（GE Health care）；q TOWER 2.2熒光定量梯度PCR儀（quantitative PCR instrument，Analytik Jena AG公司）；立式壓力蒸汽滅菌器 YXQ-LS-50G（上海博迅實業(yè)公司）；CT14RD高速冷凍離心機(jī)（上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司）；德國 Leica萊卡體現(xiàn)顯微鏡 M205A（Leica公司）。

1.4 基因克隆

1.4.1 總RNA的提取 從豇豆苗上挑取成螨，收集雌成螨200頭于1.5 mL離心管中，至少重復(fù)收集3管，按照動物組織總 RNA提取試劑盒使用說明書逐步提取，完成后使用核酸蛋白質(zhì)濃度測定儀NanoVue（GE Health care）檢測OD260/OD280是否在1.8—2.2范圍內(nèi)，保證所提取的RNA樣品的濃度和純度，然后再利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步檢測其完整性。將檢測合格的總 RNA保存于-80℃冰箱備用或立即進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.4.2 cDNA第一鏈合成 采用 PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。試驗全程使用RNase離心管，反應(yīng)液的配置均在冰上完成并按照說明書逐步進(jìn)行，合成cDNA保存于-20℃或立即進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.4.3 β-COP與Sro全序列擴(kuò)增 將兩條致死基因的核苷酸序列在二斑葉螨（Tetranychus urticae）基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，記錄比對后匹配度最高的基因（二斑葉螨與朱砂葉螨是姐妹種，具有最為相似的基因組，因此可以作為本研究的參考基因組）。使用Primer Premier 5.0 軟件分別設(shè)計引物，然后使用朱砂葉螨cDNA作為模板進(jìn)行兩端擴(kuò)增。擴(kuò)增所用的25 μL PCR 體系：2 μL cDNA、14 μL ddH2O、2.5 μL 10×PCR buffer、2.5 μL MgCl2、2 μL dNTPs、0.25 μL Taq 酶以及上下游引物各1 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，60℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收目的條帶，膠回收按試劑盒說明書操作，回收產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy Vector上，再轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中，通過藍(lán)白斑篩選，經(jīng)PCR鑒定的陽性克隆送往華大基因公司測序。

1.4.4 信息學(xué)分析 將測序正確的核苷酸序列，使用NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST程序進(jìn)行同源序列比對以及保守區(qū)域的檢測（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），并使用作圖軟件IBS 1.0.1進(jìn)行繪制[26]。選取NCBI數(shù)據(jù)庫氨基酸比對結(jié)果，下載模式物種黑腹果蠅等及與目的基因相似性最高的數(shù)條氨基酸序列，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）在MEGA7.0.2軟件中完成系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建[27]，各分支重復(fù)檢驗次數(shù)均為1 000。

1.5 RNAi

1.5.1 前期準(zhǔn)備 從豇豆苗上挑取成螨，使用葉碟法飼養(yǎng)。產(chǎn)卵24 h后挑除葉碟上的成螨，保證試驗用螨為同一歷期，后逐日觀察，收集3日齡雌成螨，用于β-COP RNAi試驗；收集5日齡若螨，用于Sro RNAi試驗，開始干擾試驗前高溫滅菌所需要的培養(yǎng)皿及焦碳酸二乙酯（以下簡稱DEPC）處理的槍頭、PCR管、水等。

使用表1所列出的目的基因特異性片段引物和綠色熒光蛋白GFP（ACY56286）基因片段引物，按1.4.3方法克隆擴(kuò)增特異性靶標(biāo)基因片段，獲得膠回收產(chǎn)物，嚴(yán)格按照試劑盒說明書合成及純化dsRNA，合成純化過程均在冰上進(jìn)行并使用DEPC處理后無酶槍頭及離心管，具體步驟：（1）使用基因體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（Themo公司），冰上融化所需試劑；（2）質(zhì)粒模板 1 μg，10×Reaction Buffer 2 μL，ATP/CTP/GTP/UTP 各 2 μL，T7 Enzyme Mix 2 μL，Neclease-free water補至 20 μL，37℃孵育 2 h；（3）加 2 μL DNaseI，37℃反應(yīng)15 min；2 μL 0.5 mol·L-1EDTA，65℃反應(yīng) 10 min；（4）加 115 μL DEPC-treated water，15 μL 3 mol·L-1Sodium Acetate Solution（pH 5.2），混勻后依次加150 μL苯酚氯仿混合液（苯酚∶氯仿=1∶1，現(xiàn)配現(xiàn)用）和300 μL氯仿，混勻，12 000 r/min、4℃離心10 min；（5）取上清至新管，加入350 μL無水乙醇，-20℃放置2 h；（6）12 000 r/min、4℃離心 10 min。去上清，加 500 μL 70%乙醇（預(yù)冷），7 500 r/min、4℃離心5 min；（7）棄廢液，晾干沉淀，加入100 μL DEPC-treated water，檢測 dsRNA濃度；（8）DEPC-treated water稀釋至200 ng·μL-1，分裝存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

以飼喂dsGFP作為陰性對照，飼喂DEPC處理的水作為空白對照。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

1.5.2 RNAi具體操作 參照SHI等[14]干擾方法并進(jìn)行改進(jìn)（圖 1）。首先需要提前將朱砂葉螨的雌成螨饑餓處理24 h（由于Sro干擾試驗使用的是若螨，所以沒有進(jìn)行饑餓處理），試驗時用新鮮的嫩豇豆葉剪裁為合適大小的正方形（約2 cm×2 cm），60℃烘干1 min；在小培養(yǎng)皿中加入 100 μL 200 ng·μL-1的dsRNA，將葉片正面朝上放置2 h，充分吸收；后在小培養(yǎng)皿中放置濾紙，并將葉片背面朝上，晾干后（約2 h），在小培養(yǎng)皿中加入2 mL無酶水（每隔36 h向培養(yǎng)皿中添加 100 μL 200 ng·μL-1的 dsRNA），每片葉子上最多可挑約180頭成螨。根據(jù)試驗需要，用于每時段定量檢測沉默效率的每片葉子上挑150—180頭，各個時段收集雌成螨/若螨約200頭于1.5 mL離心管中，至少重復(fù)收集3管，按照1.4.1中方法提取總RNA并檢測，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit，TaKaRa公司），轉(zhuǎn)錄后可保存于-20℃冰箱備用。而用于統(tǒng)計死亡率的試驗，每片葉子上挑40—50頭螨，試驗至少重復(fù)3次，每12或24 h后開蓋計數(shù)（跳水的螨將其挑至濾紙，等待一段時間后觀察存活數(shù)量）。

圖1 RNA干擾方法對比圖Fig. 1 Comparison of RNAi methods

1.6 沉默效率檢測

使用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測飼喂dsRNA后目的基因沉默效率。設(shè)計并篩選基因特異的qPCR引物（表 1），反應(yīng)體系為 20 μL：熒光染料 GoTaq? qPCR Master Mix 10 μL，Nuclease-free Water 7 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)；并在每個循環(huán)中插入熔解曲線，并選取 18S作為朱砂葉螨各時段飼喂dsRNA后qPCR檢測的內(nèi)參基因[28]。

1.7 數(shù)據(jù)處理及圖片整合

通過飼喂目的基因的片段dsRNA后，對朱砂葉螨Sro和β-COP進(jìn)行干擾，對特定時間目的基因的qPCR 數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCT方法進(jìn)行計算[29]，使用 IBM SPSS 22.0軟件對目的基因相對表達(dá)量及死亡率進(jìn)行顯著性分析（ANOVA，Duncan’s tests，P＜0.05），數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，各試驗均獨立重復(fù) 3次。死亡表型拍攝使用德國Leica M205A顯微鏡，在同一時間，使用相同倍數(shù)進(jìn)行拍攝，圖片使用Adobe Photoshop CS6軟件編輯，固定選區(qū)大小（240×300像素），并調(diào)整選區(qū)，將選區(qū)中軸線盡量與蟲體中線對齊截取并復(fù)制選區(qū)，最后將截取的圖片排列整齊。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆與全長分析

β-COP的開放閱讀框長度為2 688 bp，編碼895 aa，GenBank登錄號為MF045039。通過NCBI比對發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆凇癢D40 superfamily”及“Coatomer_WDAD superfamily”，并且包含了“WD 40”和“Coatomar_WDAD”的保守區(qū)域。在預(yù)測的蛋白三維結(jié)構(gòu)圖中可清晰地看到“WD 40”的重復(fù)結(jié)構(gòu)（圖2-A、2-B）。

Sro的開放閱讀框長度為1 119 bp，編碼372 aa，GenBank登錄號為MF045040。通過NCBI比對發(fā)現(xiàn)該基因具有典型的短鏈脫氫酶所特有的兩個特征：一是位于氨基酸70—76位的NADP+biding結(jié)合位點基序“TGxxxGx”，二是位于229—233位的“YxxxK”基序與上游的180位天冬氨酸（Asn）、216位絲氨酸（Ser）等活性位點可形成典型的催化四分體（圖2-C、2-D）。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

將β-COP氨基酸序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫對比后，收集參考主要模式物種以及其他物種的相關(guān)序列，使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支重復(fù)檢驗次數(shù)均為1 000。結(jié)果表明，朱砂葉螨β-COP與二斑葉螨β-COP的同源性最高（99%），然后與疥螨（Sarcoptes scabiei）聚為一支（圖3），從外被體蛋白-β的聚類情況來看，各個綱或目的物種均單獨成一支，與傳統(tǒng)分類一致。

圖2 β-COP與Sro生物信息學(xué)分析Fig. 2 β-COP and Sro bioinformatics analysis

圖3 朱砂葉螨β-COP系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of β-COP of T. cinnabarinus

將Sro氨基酸序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫對比后，收集主要模式物種以及其他物種的 shroud或 17-β-羥化類固醇脫氫酶（簡寫為 17-β-D）的氨基酸序列，使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支重復(fù)檢驗次數(shù)均為1 000。結(jié)果與β-COP相似，即目的基因與二斑葉螨的shroud同源性最高，其次是疥螨等（圖4）。

2.3 RNAi沉默效率及死亡率檢測

改進(jìn)的RNAi體系在干擾3日齡雌成螨108 h后依然可保持對β-COP 50%左右的沉默效率，死亡個體與正常個體相比較，有較為明顯的死亡表型，均表現(xiàn)為 4對足蜷縮在體側(cè)（圖5-A、圖 6）。試驗組與對照組的死亡率在干擾36 h后差異顯著，并且在108 h達(dá)到57.4%的死亡率（圖7）。

而干擾3日齡雌成螨的Sro 96 h后，目的基因的沉默效率下降（表 2），且不能觀察到相應(yīng)表型。但干擾若螨的Sro 96 h，目的基因的沉默效率在50%左右，死亡個體與正常個體相比較，均出現(xiàn)蛻皮過程受阻的現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為在靜伏期死亡，或在蛻皮過程中不能蛻皮而死亡（圖5-B、圖8）。試驗組與對照組的死亡率在干擾48 h后差異顯著（圖9）。

圖4 朱砂葉螨Sro系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of Sro of T. cinnabarinus

表2 干擾3日齡雌成螨Sro的qPCR檢測結(jié)果Table 2 The results of qPCR of Sro RNAi with 3-day-old female adult mite

圖5 顯微拍攝死亡表型Fig. 5 Microscopic pictures of the death phenotype

圖6 各時間點β-COP相對表達(dá)量Fig. 6 Relative expression of β-COP at different time points

圖7 β-COP RNAi后死亡率檢測Fig. 7 The mortality of β-COP RNAi

圖8 各時間點Sro相對表達(dá)量Fig. 8 Relative expression of Sro at different time points

圖9 Sro RNAi后死亡率檢測Fig. 9 The mortality of Sro RNAi

3 討論

改進(jìn)后的RNAi技術(shù)主要有以下3個優(yōu)點：（1）試驗材料經(jīng)DEPC處理滅菌后形成無酶環(huán)境，從而減少可能降解 dsRNA的因素；（2）利用葉片與無酶dsRNA溶液間的張力，形成液面略高于葉面的自然“水封”，減少朱砂葉螨跳水或避免其爬入背面的間隙中。朱砂葉螨在葉面背面取食危害，有研究認(rèn)為朱砂葉螨在葉背取食可能是其躲避天敵的策略或本身具有避光的習(xí)性[30]，改進(jìn)后的方法可減少該螨跳水及爬進(jìn)背面間隙等情況的發(fā)生頻率，有利于死亡率等數(shù)據(jù)的統(tǒng)計；（3）持續(xù)添加dsRNA溶液，試驗中每隔36 h，就添加約20 μg的dsRNA，保證試驗時dsRNA濃度在相對適合的范圍，從而延長干擾時間，保證目的基因沉默效率維持在較高水平。

RNAi技術(shù)是否取得成功，還受到以下因子的影響[31-32]：（1）最佳的dsRNA濃度，濃度不佳會影響最終的干擾效果。本試驗不僅最大限度地減少dsRNA降解的各類因素，還采用持續(xù)添加dsRNA的方法來保證試驗時 dsRNA的濃度，而試驗結(jié)果證明改進(jìn)的RNAi方法可以在保證目的基因沉默效率較穩(wěn)定的情況下實現(xiàn)較長時間的干擾試驗；（2）核苷酸序列的特異性，主要從檢測目的基因沉默效率和特定表型來判斷dsRNA是否具有特異性。但由于同一個靶標(biāo)基因在害蟲的不同齡期、不同生育階段會有不同的干擾效果[33]，這就要根據(jù)靶標(biāo)基因的功能來決定試驗齡期，如本試驗在進(jìn)行朱砂葉螨Sro干擾時，曾采用與β-COP一樣的3日齡雌成螨作為供試對象，結(jié)果觀察不到相關(guān)表型，其根本原因就是Sro的功能是影響蛻皮過程而對成螨影響較小。因此，選擇對若螨進(jìn)行干擾時，觀察到了與基因功能相符的表型。

β-COP是功能復(fù)合物COPI的重要組成部分[34]，研究表明在埃及伊蚊中注射能引起COPI、COPII和網(wǎng)格蛋白缺陷的dsRNA后，發(fā)現(xiàn)只有缺失COPI后，蚊卵巢的發(fā)育和中腸消化血液的進(jìn)程都受到了阻礙，證明該基因在消化代謝中起十分重要的作用[23]。本研究表明，干擾該基因后死亡個體均表現(xiàn)為4對足蜷縮，根據(jù)該基因的功能可推測其受到干擾可能會影響朱砂葉螨對植物汁液的消化，由于能量代謝不足導(dǎo)致出現(xiàn)類似于足無力而蜷縮、擊倒的效果?；谠摶虮憩F(xiàn)出較好的致死率，因此筆者認(rèn)為β-COP可作為RNAi防控朱砂葉螨的靶基因。蛻皮激素是一類由前胸腺合成，具有蛻皮活性的甾類化合物，蛻皮激素在昆蟲體內(nèi)的合成過程為先借助Rieske加氧酶Neverland（Nvd）將膽固醇或植物甾醇轉(zhuǎn)變?yōu)?7-脫氫膽固醇[19,25]；經(jīng)“black box”過程后，利用幾種P450酶完成由三脫氧蛻皮酮向 20-羥基蛻皮酮的轉(zhuǎn)變。該過程環(huán)環(huán)相扣，缺一不可，而11β-羥化類固醇脫氫酶（Sro）則是“black box”中重要的限速還原酶。NIWA 等[25]研究表明，干擾該基因能影響昆蟲（家蠶）的蛻皮過程以致死亡，或過表達(dá)該基因?qū)е吕ハx發(fā)育和變態(tài)出現(xiàn)異常，甚至死亡。朱砂葉螨的生長發(fā)育過程中涉及多次蛻皮，而對 Sro的干擾可能會影響蛻皮激素合成中的“black box”過程。本研究表明沉默Sro對朱砂葉螨若螨具有致死效應(yīng)，若將Sro應(yīng)用于RNAi防控朱砂葉螨，通過影響蛻皮而干擾朱砂葉螨新螨態(tài)的形成，對于減少基礎(chǔ)蟲量有重大意義。

由于朱砂葉螨極易產(chǎn)生抗藥性，因此其抗性治理也是研究的重點。目前，低毒農(nóng)藥及防控新技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用是主要的發(fā)展方向?；赗NAi原理的有害生物防治技術(shù)已被多次報道，如結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)以植物或細(xì)菌為載體、或利用納米材料作為運載工具實現(xiàn)對有害生物靶基因的RNAi等[5-6,9,35]。本研究得到兩條適用于RNAi技術(shù)的靶標(biāo)基因，不僅可用于室內(nèi)基因功能等研究，還具有大田防治應(yīng)用的潛力，在后續(xù)試驗中將嘗試用這些候選靶標(biāo)基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)或納米材料載體進(jìn)行實際防控效果及植物互作等研究，為綠色防控提供依據(jù)。

4 結(jié)論

沉默朱砂葉螨β-COP和Sro后具有明顯的致死效應(yīng)，這兩條基因作為RNAi的靶標(biāo)在朱砂葉螨的防控中具有應(yīng)用價值。

[1]何林, 趙志模, 鄧新平, 王進(jìn)軍, 劉懷, 劉映紅. 朱砂葉螨對3種殺螨劑的抗性選育及抗性治理研究. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2003, 36(4):403-408.HE L, ZHAO Z M, DENG X P, WANG J J, LIU H, LIU Y H.Resistance breeding of Tetranychus urticae to three kinds of acaricides and its resistance treatment. Scientia Agricultura Sinica,2003, 36(4): 403-408. (in Chinese)

[2]HUNTER C P. Genetics: a touch of elegance with RNAi. Current Biology, 1999, 9(12): R440-R442.

[3]CAPLEN N J, FLEENOR J, FIRE A, MORGAN R A. dsRNA-mediated gene silencing in cultured Drosophila cells: a tissue culture model for the analysis of RNA interference. Gene, 2000, 252(1/2):95-105.

[4]FAY D S, STANLEY H M, HAN M, WOOD W B. A Caenorhabditis elegans homologue of hunchback is required for late stages of development but not early embryonic patterning. Developmental Biology, 1999, 205(2): 240-253.

[5]ZHANG J, KHAN S A, HASSE C, RUF S, HECKEL D G, BOCK R.Full crop protection from an insect pest by expression of long double-stranded RNAs in plastids. Science, 2015, 347(6225):991-994.

[6]SHEN G M, SONG C G, AO Y Q Y, XIAO Y H, ZHANG Y J, PAN Y, HE L. Transgenic cotton expressing CYP392A4 double-stranded RNA decreases the reproductive ability of Tetranychus cinnabarinus.Insect Science, 2016, 24(4): 559-568.

[7]ARAKANE Y, LOMAKIN J, BEEMAN R W, MUTHUKRISHNAN S, GEHRKE S H, KANOST M R, KRAMER K J. Molecular and functional analyses of amino acid decarboxylases involved in cuticle tanning in Tribolium castaneum. The Journal of Biological Chemistry,2009, 284(24): 16584-16594.

[8]PRABHA S, VYAS R, GUPTA N, AHMED B, CHANDRA R,NIMESH S. RNA interference technology with emphasis on delivery vehicles-prospects and limitations. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology, 2016, 44(6): 1391-1399.

[9]THAIRU M W, SKIDMORE I H, BANSAL R, NOVáKOVá E,HANSEN T E, LI-BYARLAY H, WICKLINE S A, HANSEN A K.Efficacy of RNA interference knockdown using aerosolized short interfering RNAs bound to nanoparticles in three diverse aphid species. Insect Molecular Biology, 2017, 26(3): 356-368.

[10]SINGH N, AGRAWAL A, LEUNG AKL, SHARP P A, BHATIA S N. Effect of nanoparticle conjugation on gene silencing by RNA interference. Journal of the American Chemical Society, 2010,132(24): 8241-8243.

[11]ENDO S, MIYAGI N, MATSUNAGA T, HARA A, IKARI A.Human dehydrogenase/reductase (SDR family) member 11 is a novel type of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2016, 472(1): 231-236.

[12]ARAUJO R N, SANTOS A, PINTO F S, GONTIJO N F, LEHANE M J, PEREIRA M H. RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera:Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2006, 36(9): 683-693.

[13]TURNER C T, DAVY M W, MACDIARMID R M, PLUMMER K M,BIRCH N P, NEWCOMB R D. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by doublestranded RNA feeding. Insect Molecular Biology, 2006, 15(3):383-391.

[14]SHI L, ZHANG J, SHEN G, XU Z, WEI P, ZHANG Y, XU Q, HE L.Silencing NADPH-cytochrome P450 reductase results in reduced acaricide resistance in Tetranychus cinnabarinus (Boisduval).Scientific Reports, 2015, 5: 15581.

[15]YOON J, SHUKLA J N, GONG Z J, MOGILICHERLA K, PALLI S R. RNA interference in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata: Identification of key contributors. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2016, 78: 78-88.

[16]KWON D H, PARK J H, LEE S H. Screening of lethal genes for feeding RNAi by leaf disc-mediated systematic delivery of dsRNA inTetranychus urticae. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2013,105(1): 69-75.

[17]程道軍, 李志清, 孟勐, 彭健, 錢文良, 康麗霞, 夏慶友. 家蠶蛻皮激素合成相關(guān)的細(xì)胞色素 P450基因的鑒定分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2014, 47(3): 594-604.CHENG D J, LI Z Q, MENG M, PENG J, QIAN W L, KANG L X,XIA Q Y. Characterization of cytochrome P450 genes involving in ecdysteroidogenesis in silkworm (Bombyx mori). Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(3): 594-604. (in Chinese)

[18]TAN A, PALLI S R. Ecdysone receptor isoforms play distinct roles in controlling molting and metamorphosis in the red flour beetle,Tribolium castaneum. Molecular and Cellular Endocrinology, 2008,291(1/2): 42-49.

[19]YAMAZAKI Y, KIUCHI M, TAKEUCHI H, KUBO T. Ecdysteroid biosynthesis in workers of the European honeybee Apis mellifera L.Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2011, 41(5): 283-293.

[20]OGIHARA M H, HIKIBA J, IGA M, KATAOKA H. Negative regulation of juvenile hormone analog for ecdysteroidogenic enzymes.Journal of Insect Physiology, 2015, 80: 42-47.

[21]TIAN H, PENG H, YAO Q, CHEN H, XIE Q, TANG B, ZHANG W.Developmental control of a lepidopteran pest Spodoptera exigua by ingestion of bacteria expressing dsRNA of a non-midgut gene. PLoS ONE, 2009, 4(7): e6225.

[22]PITINO M, COLEMAN A D, MAFFEI M E, RIDOUT C J,HOGENHOUT S A. Silencing of aphid genes by dsRNA feeding from plants. PLoS ONE, 2011, 6(10): e25709.

[23]ISOE J, STOVER W, MIESFELD R B, MIESFELD R L. COPI-mediated blood meal digestion in vector mosquitoes is independent of midgut ARF-GEF and ARF-GAP regulatory activities. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2013, 43(8): 732-739.

[24]KWON D H, PARK J H, ASHOK P A, LEE U, LEE S H. Screening of target genes for RNAi in Tetranychus urticae and RNAi toxicity enhancement by chimeric genes. Pesticide Biochemistry and Physiology,2016, 130: 1-7.

[25]NIWA R, NAMIKI T, ITO K, SHIMADA-NIWA Y, KIUCHI M,KAWAOKA S, KAYUKAWA T, BANNO Y, FUJIMOTO Y,SHIGENOBU S, KOBAYASHI S, SHIMADA T, KATSUMA S,SHINODA T. Non-molting glossylshroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the ‘Black Box’ of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development, 2010, 137(12):1991-1999.

[26]LIU W, XIE Y, MA J, LUO X, NIE P, ZUO Z, LAHRMANN U,ZHAO Q, ZHENG Y, ZHAO Y, XUE Y, REN J. IBS: an illustrator for the presentation and visualization of biological sequences.Bioinformatics, 2015, 31(20): 3359-3361.

[27]KUMAR S, STECHER G, TAMURA K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis Version 7.0 for bigger datasets.Molecular Biology and Evolution, 2016, 33(7): 1870-1874.

[28]SUN W, JIN Y, HE L, LU W C, LI M. Suitable reference gene selection for different strains and developmental stages of the carmine spider mite, Tetranychus cinnabarinus, using quantitative real-time PCR. Journal of Insect Science, 2010, 10: Article 208.

[29]PFAFFL M W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research, 2001, 29(9): e45.

[30]TAKABAYASHI J, SHIMODA T, DICKE M, ASHIHARA W,TAKAFUJI A. Induced response of tomato plants to injury by green and red strains of Tetranychus urticae. Experimental & Applied Acarology, 2000, 24(5/6): 377-383.

[31]PAIM R M, ARAUJO R N, LEHANE M J, GONTIJO N F,PEREIRA M H. Long-term effects and parental RNAi in the blood feeder Rhodnius prolixus (Hemiptera; Reduviidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2013, 43(11): 1015-1020.

[32]YANG D, LU H, ERICKSON J W. Evidence that processed small dsRNAs may mediate sequence-specific mRNA degradation during RNAi in Drosophila embryos. Current Biology, 2000, 10(19):1191-1200.

[33]LINZ D M, CLARK-HACHTEL C M, BORRàS-CASTELLS F,TOMOYASU Y. Larval RNA interference in the red flour beetle,Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments, 2014, 92:e52059.

[34]LI W, ELLIOTT R W, NOVAK E K, SWANK R T. cDNA sequence and mapping of the mouse Copb gene encoding the beta subunit of the COPI coatomer complex. Somatic Cell and Molecular Genetics, 1999,25(3): 177-183.

[35]WU K, HOY M A. Oral delivery of double-stranded RNA induces prolonged and systemic gene knockdown in Metaseiulus occidentalis only after feeding on Tetranychus urticae. Experimental & Applied Acarology, 2014, 63(2): 171-187.

（責(zé)任編輯 岳梅）

Identification of β-COP and Sro of Tetranychus cinnabarinus and Their Lethal Effects After Silencing

AO YiQianYun1,2, SHEN GuangMao1,2, WANG MengYao1,2, LIU JiaLu1,2, PAN Yu3, HE Lin1,2
(1College of Plant Protection, Southwest University/Laboratory of Pesticide Toxicology and Science, Chongqing 400716;2Academy of Agricultural Sciences, Southwest University, Chongqing 400716;3College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400716)

2017-05-22；接受日期：2017-06-26

國家自然科學(xué)基金（31672085）、中央高校團(tuán)隊項目（XDJK2016A005）

聯(lián)系方式：敖已倩云，Tel：18375639762；E-mail：hacy0538@163.com。通信作者何林，Tel：023-68251541；E-mail：helinok@vip.tom.com