李海，劉巧紅，唐雪穎，陳武個(gè)，丁少雄*

(1. 國(guó)家海洋局第三海洋研究所 海洋生物與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361005；2. 福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門(mén) 361102；3.廈門(mén)海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361012)

我國(guó)近岸多室草苔蟲(chóng)(Bugula neritina)的群體遺傳分化研究

李海1，2，劉巧紅2，唐雪穎2，陳武個(gè)3，丁少雄2*

(1. 國(guó)家海洋局第三海洋研究所 海洋生物與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361005；2. 福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門(mén) 361102；3.廈門(mén)海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361012)

基于線粒體控制區(qū)序列和SLAF-seq，對(duì)重要藥源生物多室草苔蟲(chóng)的群體遺傳分化水平開(kāi)展了研究?？刂茀^(qū)序列中檢測(cè)到8個(gè)單倍型，單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)分別為0.130 7和0.000 7，單倍型網(wǎng)絡(luò)圖和NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)構(gòu)都較簡(jiǎn)單，無(wú)明顯拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。中性檢驗(yàn)和核苷酸不配對(duì)分析結(jié)果均表明多室草苔蟲(chóng)未經(jīng)歷過(guò)大規(guī)模群體擴(kuò)張。Fst和AMOVA分析顯示遺傳變異主要來(lái)自于群體內(nèi)。SLAF建庫(kù)共開(kāi)發(fā)得到214 409個(gè)SLAF標(biāo)簽，其中多態(tài)性SLAF標(biāo)簽23 437個(gè)，共開(kāi)發(fā)出99 432個(gè)SNP位點(diǎn)。群體間的遺傳距離較小，且低于群體內(nèi)的遺傳距離。基于SNP所做的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，各群體之間沒(méi)有顯著的遺傳結(jié)構(gòu)。綜上所述，我國(guó)沿海多室草苔蟲(chóng)的遺傳多樣性水平較低，不同地理群體之間不存在顯著的遺傳結(jié)構(gòu)。多室草苔蟲(chóng)較強(qiáng)的擴(kuò)散能力是造成上述結(jié)果的主要原因。另外，本研究還驗(yàn)證和討論了SLAF-seq應(yīng)用在海洋生物群體遺傳分化研究中的可行性和優(yōu)勢(shì)。

多室草苔蟲(chóng)；群體遺傳分化；線粒體DNA；SLAF-seq；簡(jiǎn)化基因組

1 引言

多室草苔蟲(chóng)(Bugulaneritina)，又稱(chēng)總合草苔蟲(chóng)，隸屬于苔蘚動(dòng)物門(mén)(Bryozoa)，裸唇綱(Cymndaemata)，唇口目(Cheilostomida)，草苔蟲(chóng)科(Bugulidae)，草苔蟲(chóng)屬(Bugula)，系環(huán)熱帶廣布種，廣泛地分布于世界各地的中低緯海域[1]。在中國(guó)范圍內(nèi)的表層水體中，多室草苔蟲(chóng)只分布于東海和南海等南方海區(qū)[2]。作為一類(lèi)常見(jiàn)的污損苔蟲(chóng)，多室草苔蟲(chóng)經(jīng)常附著于船底、浮標(biāo)、石油平臺(tái)等人造水下設(shè)施以及養(yǎng)殖網(wǎng)箱、定置漁網(wǎng)等水產(chǎn)養(yǎng)殖設(shè)施上。

多室草苔蟲(chóng)還是一種重要的海洋藥源生物。到目前為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一共從多室草苔蟲(chóng)中成功分離到22個(gè)抗癌活性成分[3-5]。草苔蟲(chóng)內(nèi)酯bryostatin系列成分，具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用[6]，其中，bryostatin 1對(duì)于阿爾茨海默癥和許多癌癥更有著顯著的療效，是草苔蟲(chóng)內(nèi)酯中最有希望成藥的抗癌藥物來(lái)源[7-11]。目前，該活性成分已經(jīng)被美國(guó)食品與藥品管理局批準(zhǔn)進(jìn)入臨床 Ⅱ 期試驗(yàn)[12]。然而，bryostatin 1只在美國(guó)的東太平洋沿岸等海域生長(zhǎng)的多室草苔蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)[4]，從中國(guó)沿海生長(zhǎng)的多室草苔蟲(chóng)中卻一直未能成功分離。類(lèi)似的由于多室草苔蟲(chóng)生長(zhǎng)地點(diǎn)的地域性差別而造成活性產(chǎn)物不同的現(xiàn)象在世界其他地方也同樣存在[4，13]，在中國(guó)范圍內(nèi)，從生長(zhǎng)于不同地方的多室草苔蟲(chóng)中提取得到的草苔蟲(chóng)內(nèi)酯亦存在一定差異[4]，但其影響因素是來(lái)源于內(nèi)在的遺傳差異還是外在的環(huán)境因子目前尚不得知。而關(guān)于這種重要藥源生物的生物地理學(xué)和群體遺傳學(xué)的研究至今仍少有報(bào)道。因此，開(kāi)展中國(guó)沿海多室草苔蟲(chóng)的群體遺傳分化研究不僅可為類(lèi)似污損生物的擴(kuò)散方式研究提供借鑒，亦可為該重要藥源生物的種質(zhì)資源保護(hù)及其活性產(chǎn)物研發(fā)提供必要參考。

線粒體DNA(mtDNA)已被眾多學(xué)者證實(shí)其在海洋生物群體遺傳學(xué)研究中的適用性[14-17]。而SLAF-seq作為一種基于限制性酶切的簡(jiǎn)化基因組新技術(shù)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用在全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)、遺傳圖譜構(gòu)建及QTL定位、群體遺傳進(jìn)化分析和基因組選擇等領(lǐng)域[18-21]。本研究同時(shí)采用線粒體DNA控制區(qū)(D-loop)片段和SLAF-seq技術(shù)對(duì)中國(guó)沿海多室草苔蟲(chóng)的群體遺傳分化開(kāi)展研究，研究結(jié)果對(duì)深入了解這種重要藥源生物在我國(guó)的資源狀況及種群分化具有重要意義。

2 材料與方法

2.1 樣品采集與DNA提取

根據(jù)中國(guó)多室草苔蟲(chóng)的分布范圍及可能存在的地理阻隔特征，本研究采集了4個(gè)地理群體共104個(gè)個(gè)體(表1)，分別來(lái)自于三亞(SY)、深圳(SZ)、廈門(mén)(XM)和溫州(WZ)(圖1)。所有個(gè)體都根據(jù)《中國(guó)海洋污損苔蟲(chóng)生物學(xué)》一書(shū)中的分類(lèi)檢索表進(jìn)行鑒定。樣品用無(wú)菌海水清洗3次后，置于95%的乙醇中固定，-20℃保存。

DNA的提取參考孫名安等[22]關(guān)于苔蘚動(dòng)物基因組DNA的提取方法。提取的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2線粒體DNA控制區(qū)片段克隆和遺傳多樣性分析

根據(jù)GenBank上的多室草苔蟲(chóng)線粒體全基因組序列(序列號(hào)：NC_010197)，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增D-loop片段的引物。引物F-bncn序列為5′-CTAATTTCTCACCCTTATTC-3′，引物R-bncn序列為5′-GTTGGTTGGCTGACACTT-3′。

圖1 多室草苔蟲(chóng)采樣地點(diǎn)示意圖Fig.1 Sampling localities of B. neritina

PCR的反應(yīng)體系為25 μL，其中包括10×反應(yīng)緩沖液(Mg2+)2.5 μL， 引物 (10 μmol/L)各0.5 μL，Taq酶(2.5 U/μL) 0.2 μL， DNA 模板(100 ng/μL)1 μL， dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL， ddH2O 18.3 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用TaKaRa DNA Fragment Purification kit純化后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果良好的樣品送至北京六合華大基因科技股份公司進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果使用Sequencher 4.1.4軟件進(jìn)行比對(duì)和校正，使用DnaSP 5.0軟件[23]統(tǒng)計(jì)單倍型數(shù)目，并計(jì)算單倍型多樣性和核苷酸多樣性。使用Network 5.0.0.0軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。采用 Tajima′sD和Fu′sFs中性檢驗(yàn)以及核苷酸不配對(duì)分布來(lái)檢測(cè)多室草苔蟲(chóng)群體的歷史動(dòng)態(tài)。

2.3 SLAF-seq簡(jiǎn)化基因組測(cè)序

2.3.1 酶切建庫(kù)

選取紫色球海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)基因組作為參考基因組進(jìn)行酶切預(yù)測(cè)。根據(jù)最優(yōu)酶切方案，從三亞(SY)、深圳(SZ)、廈門(mén)(XM)和溫州(WZ)群體中各隨機(jī)選取12個(gè)樣品對(duì)其基因組DNA進(jìn)行酶切，對(duì)得到的SLAF標(biāo)簽3′端進(jìn)行加A處理，連接Dual-index測(cè)序接頭后PCR擴(kuò)增，純化，產(chǎn)物混樣處理后切膠回收目的大小片段的產(chǎn)物。

2.3.2 高通量測(cè)序及測(cè)序片段質(zhì)量檢驗(yàn)和分析

文庫(kù)構(gòu)建成功質(zhì)檢合格后用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測(cè)序。選取擬南芥(Arabidopsisthalianaecotype Columbia)參與酶切和測(cè)序作為對(duì)照。利用Dual-index對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行識(shí)別，得到各個(gè)樣品的reads。過(guò)濾掉測(cè)序reads的接頭后，對(duì)其進(jìn)行GC含量和Q30分析，以評(píng)估測(cè)序質(zhì)量和數(shù)據(jù)量。通過(guò)對(duì)照的數(shù)據(jù)評(píng)估選取的酶切方案的酶切效率，判斷實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和有效性。

2.3.3SLAF標(biāo)簽的獲得和全基因組范圍SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

根據(jù)序列相似度對(duì)各個(gè)樣品的reads進(jìn)行聚類(lèi)，聚類(lèi)到一起的reads來(lái)源于同一個(gè)SLAF標(biāo)簽，同一個(gè)SLAF標(biāo)簽在不同樣品間的序列相似度要遠(yuǎn)高于不同SLAF標(biāo)簽間的相似度。一個(gè)SLAF標(biāo)簽在不同樣品間有差異即可定義為多態(tài)性SLAF標(biāo)簽。根據(jù)具有多態(tài)性的SLAF標(biāo)簽尋找SNP位點(diǎn)。

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于線粒體DNA控制區(qū)片段的測(cè)序結(jié)果，使用MEGA 5.0軟件[24]計(jì)算群體內(nèi)和群體間基于Kimura 2-parameter的遺傳距離，并采用鄰接法構(gòu)建單倍型的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，設(shè)定重復(fù)抽樣1 000次以檢驗(yàn)單倍型關(guān)系樹(shù)各分枝的置信度。使用Arlequin 3.5.1.2軟件[25]中的分子方差分析(AMOVA)估算遺傳變異的分布和固定系數(shù)Fst，1 000次隨機(jī)重復(fù)抽樣后進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

從SLAF-seq技術(shù)開(kāi)發(fā)得到的分子標(biāo)記中，選取群體內(nèi)具有代表性的高質(zhì)量(篩選標(biāo)準(zhǔn)為MAF>0.05)的SNP位點(diǎn)開(kāi)展群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。使用MEGA 5軟件[24]，運(yùn)用neighbor-joining算法[26]，構(gòu)建群體的進(jìn)化樹(shù)。使用structure軟件[27]和admixture軟件[28]，分別假設(shè)樣品的分群數(shù)(K值)為1～10，進(jìn)行聚類(lèi)，通過(guò)交叉驗(yàn)證確定分群數(shù)為何時(shí)驗(yàn)證結(jié)果的錯(cuò)誤率ΔK最低，以ΔK值最低的分群作為最佳分群數(shù)。使用cluster軟件[29]，進(jìn)行主元成分分析(Principal components analysis， PCA)分析，通過(guò)樣品間的接近程度輔助進(jìn)化分析。

3 結(jié)果

3.1 基于線粒體控制區(qū)序列的結(jié)果

3.1.1 遺傳多樣性分析和單倍型統(tǒng)計(jì)

共檢測(cè)到10個(gè)多態(tài)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和11個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)，定義了8個(gè)單倍型。單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)分別為0.130 7和0.000 7，顯示其多樣性水平較低。各個(gè)群體的遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計(jì)情況見(jiàn)表1。

單倍型網(wǎng)絡(luò)圖如圖2所示。Hap 1是所有群體共享的主單倍型。Hap 5、Hap 6、Hap 7這3個(gè)單倍型均是三亞群體的獨(dú)有單倍型，且數(shù)量?jī)H有1個(gè)。

4個(gè)群體D-loop片段的單倍型NJ系統(tǒng)樹(shù)，如圖3所示。從圖中可以看出進(jìn)化枝主要分為兩支，但兩進(jìn)化枝之間枝長(zhǎng)均較短。

3.1.2 群體歷史動(dòng)態(tài)

各群體和總體的Fu′sFs和Tajima′sD中性檢驗(yàn)結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，除了三亞群體的Fu′sFs中性結(jié)果為正值外，其他的都為負(fù)值，然而除了深圳群體的結(jié)果為顯著以外，其他群體和總體的中性檢驗(yàn)結(jié)果都不顯著。4個(gè)群體的核苷酸不配對(duì)分析和吻合度分析見(jiàn)表2，根據(jù)核苷酸不配對(duì)分析結(jié)果所做的核苷酸不配對(duì)分布曲線如圖4所示。結(jié)果顯示，4個(gè)群體的核苷酸不配對(duì)分布曲線都不是典型的單峰分布，說(shuō)明多室草苔蟲(chóng)在歷史上可能并未發(fā)生過(guò)大規(guī)模擴(kuò)張事件。

表1 不同群體的遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計(jì)

圖2 多室草苔蟲(chóng)4個(gè)群體的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Haplotype network of 4 B. neritina populations

圖3 多室草苔蟲(chóng)4個(gè)群體的D-loop片段的單倍型NJ系統(tǒng)樹(shù)Fig.3 Neighbor-joining tree of D-loop sequence haplotypes from 4 B. neritina populations

群體中性檢驗(yàn)核苷酸不配對(duì)分析吻合度檢驗(yàn)Tajima′sD檢驗(yàn)Fu′sFs檢驗(yàn)τθ0θ1SSDRaggedness指數(shù)溫州-11647-079433000000000013223000010061728廈門(mén)-11424-12648?3000000000006855000001076953深圳-11401?-12903?3000000000006611000001077594三亞-07967064513000000000033604007064043347總體-10610-067613000000000015073001769064906

注：τ 用突變單位表示的種群擴(kuò)張時(shí)間，θ0種群開(kāi)始擴(kuò)張前大小，θ1種群擴(kuò)張后大??；數(shù)值右上方的*號(hào)表示結(jié)果顯著。

圖4 多室草苔蟲(chóng)4個(gè)群體D-loop序列核苷酸不配對(duì)分布圖Fig.4 Mismatch distribution for D-loop sequences of 4 B. neritina populations

3.2 基于SLAF-seq簡(jiǎn)化基因組的結(jié)果

3.2.1 SLAF建庫(kù)評(píng)估

根據(jù)對(duì)參考基因組序列的電子酶切結(jié)果，確定最佳的限制性?xún)?nèi)切酶組合為HinCII+EcoRV-HF?，酶切長(zhǎng)度在314～344 bp的序列定義為SLAF標(biāo)簽，預(yù)測(cè)可得到14 540個(gè)SLAF標(biāo)簽。另外，擬南芥的酶切片段雙端比對(duì)效率為79.21%，表明比對(duì)效率基本正常；酶切效率為99.21%，表明酶切反應(yīng)正常。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)SLAF建庫(kù)正常。

3.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與評(píng)估

為保證后續(xù)生物信息學(xué)分析質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)采用去掉接頭后讀長(zhǎng)的80 bp×2作為后續(xù)的數(shù)據(jù)評(píng)估和分析數(shù)據(jù)。各樣品經(jīng)測(cè)序共獲得11.93 M的reads數(shù)據(jù)，每個(gè)樣品的總測(cè)序讀長(zhǎng)74 430～735 578 bp不等。各樣品的GC含量35.09%～48.85%，達(dá)到測(cè)序要求；來(lái)自所有樣品的個(gè)體堿基測(cè)序評(píng)估的指標(biāo)Q30比例80.01%～91.16%，所有樣品Q(chēng)30比例都在80%以上，說(shuō)明測(cè)序過(guò)程中堿基錯(cuò)誤率低，獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量合格可信。

3.2.3 SLAF標(biāo)簽的開(kāi)發(fā)和SNP信息統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)中針對(duì)所有樣品共開(kāi)發(fā)得到214 409個(gè)SLAF標(biāo)簽，樣品的平均測(cè)序深度為10.29×。根據(jù)等位基因數(shù)和基因序列之間的差異進(jìn)行多態(tài)性分析，共得到23 437個(gè)多態(tài)性SLAF標(biāo)簽，比例為10.93%；190 972個(gè)非多態(tài)性的SLAF標(biāo)簽，比例為89.07%。利用得到的多態(tài)性SLAF標(biāo)簽共開(kāi)發(fā)出99 432個(gè)SNP位點(diǎn)。

3.3 多室草苔蟲(chóng)群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于控制區(qū)序列的4個(gè)群體的遺傳距離，如表3所示。從中可以看出，群體內(nèi)遺傳距離的大小比較為三亞(0.002 82)>溫州(0.000 16)>深圳(0.000 09)=廈門(mén)(0.000 09)，而群體間的遺傳距離范圍為0.000 09～0.001 62。整體來(lái)看，群體間的遺傳距離水平低于群體內(nèi)的遺傳距離，沒(méi)有顯著的遺傳結(jié)構(gòu)。但是，三亞群體與另外3個(gè)群體之間的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。

注：*為群體內(nèi)Kimura 2-parameter遺傳距離。

基于控制區(qū)序列的4個(gè)群體的遺傳分化，其結(jié)果如表4所示。Wright[30]曾經(jīng)提出了關(guān)于遺傳分化指數(shù)的大小和分化程度的解釋?zhuān)J(rèn)為Fst值小于0.05時(shí)，群體間遺傳分化程度很低；在0.05～0.15之間表明群體遺傳分化達(dá)中等水平。由基于D-loop片段序列的數(shù)據(jù)可知，三亞群體對(duì)另外3個(gè)群體的Fst值均高于0.05，且三亞對(duì)深圳和三亞對(duì)廈門(mén)的Fst分析均顯示差異顯著。這說(shuō)明三亞群體相對(duì)于另外3個(gè)群體可能存在一定的遺傳分化。

表4 多室草苔蟲(chóng)4個(gè)群體的遺傳分化

注：對(duì)角線以下群體間Fst值；對(duì)角線以上基于Fst值的顯著性分析(以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn))結(jié)果差異顯著為“+”，反之為“-”。

將三亞群體和另外3個(gè)群體分別歸為1個(gè)群組進(jìn)行AMOVA分析，結(jié)果如表5所示?？梢钥闯觯?2.75%的變異來(lái)自群組間，而79.70%的變異來(lái)自群體內(nèi)，而群體間、群組間固定系數(shù)Fst和Fct分別為0.095 12和0.227 47，說(shuō)明三亞群體和其他群體間存在較大的遺傳差異。

表5 多室草苔蟲(chóng)群組間的AMOVA分析

基于SNP位點(diǎn)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖5。由圖可知，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)呈現(xiàn)出與分布地點(diǎn)不相關(guān)的散狀分枝，說(shuō)明各群體之間的遺傳分化并不明顯。

基于SNP位點(diǎn)的群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果顯示，來(lái)自不同地點(diǎn)的群體的最佳分群數(shù)為1(圖6，圖7)，這表明所有多室草苔蟲(chóng)均屬于同一個(gè)群體。PCA分析結(jié)果(圖8)則顯示，來(lái)自溫州、廈門(mén)、深圳的樣品比較接近，而來(lái)自三亞的樣品與其他地點(diǎn)的樣品較為疏遠(yuǎn)。

4 討論

4.1多室草苔蟲(chóng)的遺傳多樣性水平和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

物種的遺傳多樣性水平與其適應(yīng)和生存的能力以及進(jìn)化的潛力密切相關(guān)[31]?；诰€粒體控制區(qū)序列的結(jié)果表明，我國(guó)的多室草苔蟲(chóng)群體的單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)均處于較低水平。當(dāng)種群的h值和π值都較低時(shí)(h<0.5，π<0.005)，說(shuō)明該種群的遺傳多樣性水平較低，有可能在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)(bottleneck effect)或者是奠基者效應(yīng)(founder effect)[32]。群體歷史動(dòng)態(tài)結(jié)果也顯示多室草苔蟲(chóng)在歷史上沒(méi)有發(fā)生過(guò)顯著的擴(kuò)張行為?；赟LAF-seq的群體遺傳分化分析結(jié)果顯示，只有約10%的SLAF標(biāo)簽是多態(tài)性的，這同樣表明該物種的遺傳多樣性水平較低。由此，基于線粒體DNA和SLAF-seq的群體遺傳分化結(jié)果都一致表明，多室草苔蟲(chóng)的遺傳多樣性處于較低的水平，這也與其他學(xué)者對(duì)世界范圍內(nèi)多室草苔蟲(chóng)的群體遺傳學(xué)研究中只發(fā)現(xiàn)了1種COⅠ單倍型的結(jié)果相吻合[33]。

圖5 基于SNP位點(diǎn)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree based on SNP loci

圖6 分群數(shù)為1～10的聚類(lèi)圖Fig.6 Dendrogram of clustering from 1-10

圖7 ΔK值分布圖Fig.7 Scattergram of ΔK value

圖8 PCA聚類(lèi)分析圖Fig.8 PCA clustering analysis

群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，4個(gè)不同地點(diǎn)的多室草苔蟲(chóng)之間未檢測(cè)到顯著的遺傳結(jié)構(gòu)，故應(yīng)屬于同一個(gè)群體。導(dǎo)致生物群體遺傳結(jié)構(gòu)同質(zhì)化的原因有很多，對(duì)于海洋生物而言，其自身的生活史與擴(kuò)散能力、海洋水文環(huán)境條件和理化因素、生境的連續(xù)性等，都是有可能影響其遺傳結(jié)構(gòu)的重要因素[34]。

多室草苔蟲(chóng)是固生的海洋動(dòng)物，其完整生活史中只有幼蟲(chóng)階段具有潛在的擴(kuò)散能力，但幼蟲(chóng)在海水中僅能自由游動(dòng)1～2 h便會(huì)附著在固著基上[35-36]，其較差的擴(kuò)散能力，限制了不同地點(diǎn)群體間的基因交流[37-38]。在憑借自身?xiàng)l件難以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離擴(kuò)散的情況下，多室草苔蟲(chóng)仍可以依靠艦船航行擴(kuò)散。艦船航行使得依附在其表面的污損生物有可能克服其原本無(wú)法逾越的海洋陸地阻隔、溫度差別以及低鹽度的河口徑流等障礙，從而擴(kuò)大種群的分布范圍[1]。然而，要實(shí)現(xiàn)上述目的污損生物還必須滿足以下條件：(1)能經(jīng)受艦船快速航行和波浪沖擊；(2)能抵御溫度、鹽度等環(huán)境條件的急劇變化；(3)能在新環(huán)境里進(jìn)行有性生殖[39]。對(duì)多室草苔蟲(chóng)而言，其直立生長(zhǎng)和鈣化程度較低的群體特性不利于應(yīng)對(duì)艦船快速航行和波浪沖擊，但其幼蟲(chóng)附著變態(tài)后幼體生長(zhǎng)發(fā)育迅速，形成初蟲(chóng)直立生長(zhǎng)至群體第四次分歧僅需30 d，因此，多室草苔蟲(chóng)仍然可借助附著在艦船底部進(jìn)行有效的長(zhǎng)距離擴(kuò)散[1]。另外一方面，作為一種常見(jiàn)的污損生物，多室草苔蟲(chóng)對(duì)棲息環(huán)境的適應(yīng)范圍較廣，在半裸露的巖石、浮標(biāo)、棧橋、漁排、船底、海帶和石花菜表面等地方均可大量生長(zhǎng)[1]，在擴(kuò)散到新的環(huán)境后有能力生存下來(lái)。

綜上所述，多室草苔蟲(chóng)廣泛的擴(kuò)散行為和對(duì)環(huán)境較好的適應(yīng)性可以使不同群體間保持頻繁的基因交流，在一定程度上使基因庫(kù)趨于同質(zhì)化，同時(shí)抵消了選擇壓力下對(duì)特定遺傳變異的保留[40]，進(jìn)而影響群體的遺傳多樣性水平并阻礙群體遺傳結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。

4.2SLAF-seq應(yīng)用在多室草苔蟲(chóng)群體遺傳分化研究中的可行性和優(yōu)勢(shì)

目前，SLAF-seq技術(shù)已經(jīng)在各個(gè)領(lǐng)域的研究中成功開(kāi)發(fā)出眾多分子標(biāo)記[41]。對(duì)于沒(méi)有參考基因組的物種，如鯉魚(yú)等，SLAF-seq也能進(jìn)行SNP位點(diǎn)的挖掘[42]；對(duì)于基因組序列組成高度雜合的物種，如牡丹、茶樹(shù)、胡桃等，在沒(méi)有參考基因組序列的情況下，SLAF-seq可以通過(guò)先進(jìn)行電子酶切設(shè)計(jì)方案再測(cè)序的方式，實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記的大規(guī)模開(kāi)發(fā)[43-45]；而對(duì)于多態(tài)率低的物種，如大豆等，SLAF-seq大規(guī)模開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記的能力也得到過(guò)檢驗(yàn)[18]。因此，盡管目前由于沒(méi)有多室草苔蟲(chóng)及其近緣物種的基因組序列可供參考，無(wú)法了解其基因組的復(fù)雜程度和組成特性，但是根據(jù)SLAF-seq技術(shù)在其他諸多物種上的成功實(shí)踐案例，我們依然可以將其用于多室草苔蟲(chóng)全基因組范圍內(nèi)SNP位點(diǎn)的開(kāi)發(fā)。

分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)的結(jié)果顯示，實(shí)際開(kāi)發(fā)出的SLAF標(biāo)簽數(shù)遠(yuǎn)高于用電子酶切預(yù)測(cè)的結(jié)果，同時(shí)做到了對(duì)所有樣品的深度覆蓋。10.29×的覆蓋率，不僅高于預(yù)期的5×，同時(shí)也確保了堿基讀取的準(zhǔn)確性和SNP位點(diǎn)的有效性。另外，獲得的SLAF標(biāo)簽中沒(méi)有重復(fù)性標(biāo)簽，而只有多態(tài)性標(biāo)簽和非多態(tài)性標(biāo)簽。由于缺乏參考基因組信息，無(wú)法排除多室草苔蟲(chóng)基因組本身重復(fù)序列比例較低的可能性；但是事先通過(guò)電子酶切來(lái)預(yù)測(cè)最優(yōu)酶切方案，顯然對(duì)于研究結(jié)果中重復(fù)性標(biāo)簽的杜絕和分子標(biāo)記挖掘效率的提升起到了重要的作用。最終開(kāi)發(fā)出的99 432個(gè)分子標(biāo)記，數(shù)量可觀，并實(shí)現(xiàn)了在全基因組范圍內(nèi)的高密度均勻覆蓋，因此完全可以用于后續(xù)的群體遺傳分析。另外， SLAF-seq在遺傳多樣性水平和群體遺傳結(jié)構(gòu)方面，呈現(xiàn)出與線粒體DNA序列相一致的結(jié)果，這也從另一個(gè)側(cè)面證明了，SLAF-seq技術(shù)完全可以應(yīng)用于包括多室草苔蟲(chóng)在內(nèi)的海洋生物群體遺傳分化研究。

作為一種生物信息學(xué)分析輔助的基于酶切的簡(jiǎn)化基因組技術(shù)，SLAF-seq有著(1)不受參考基因組限制，可以應(yīng)用于各種非模式生物；(2)對(duì)SLAF標(biāo)簽的深度測(cè)序可以保證基因分型的高度準(zhǔn)確性；(3)對(duì)目標(biāo)基因組簡(jiǎn)化代表的策略顯著降低了測(cè)序成本；(4)酶切方案靈活，能夠有效避開(kāi)重復(fù)序列，優(yōu)化了分子標(biāo)記的挖掘效率；(5)開(kāi)發(fā)的SNP分子標(biāo)記性?xún)r(jià)比高，穩(wěn)定性好，在基因組中分布均勻；(6)雙端barcode接頭的系統(tǒng)非常適合大群體研究等諸多優(yōu)勢(shì)[42，46]。特別是相較于其他傳統(tǒng)的分子標(biāo)記，如線粒體DNA等，SLAF-seq有著高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)的分子標(biāo)記數(shù)目。另外，由于在全基因組范圍內(nèi)的高密度均勻覆蓋，而非其它分子標(biāo)記僅僅來(lái)源于基因組的局部有限范圍，如線粒體基因組等，SLAF-seq在群體研究中有著更精細(xì)的分辨率，因而能傳遞出更多的遺傳信息。在本研究中，盡管兩種技術(shù)手段的結(jié)果基本一致，但是相較于線粒體控制區(qū)序列結(jié)果中的8個(gè)單倍型，SLAF-seq從來(lái)源相同、樣品數(shù)目卻更少的4個(gè)群體中共得到99 432個(gè)SNP位點(diǎn)，其呈現(xiàn)出的有關(guān)遺傳變異的信息量顯然更為豐富和準(zhǔn)確，因此，能夠更加全面和深入地反映多室草苔蟲(chóng)的群體遺傳結(jié)構(gòu)和群體遺傳分化水平。另外，SLAF-seq在群體遺傳學(xué)研究中對(duì)每個(gè)群體的樣品數(shù)量要求較低，在綜合考慮研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和測(cè)序成本的前提下，通常只需要10～15個(gè)，較線粒體DNA等傳統(tǒng)分子標(biāo)記所需的30～50個(gè)而言大幅減少，在一定程度上降低了采樣成本和難度。由此可見(jiàn)，相較于線粒體DNA等傳統(tǒng)分子標(biāo)記，SLAF-seq技術(shù)在群體遺傳分化研究中有著無(wú)可比擬的巨大技術(shù)優(yōu)勢(shì)。

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Population genetic variation study of Bugula neritina in coastal waters of China

Li Hai1，2，Liu Qiaohong2，Tang Xueying2，Chen Wuge3，Ding Shaoxiong2

(1.LaboratoryofMarineBiologyandEcology，ThirdInstituteofOceanography，StateOceanicAdministration，Xiamen361005,China; 2.FujianCollaborativeInnovationCenterforExploitationandUtilizationofMarineBiologicalResources，Xiamen361102,China; 3.XiamenOceanVocationalCollege，Xiamen361012,China)

We studied the genetic diversity and population genetic variation ofBugulaneritina，an important pharmaceutical organism，sampled from 4 distinct localities along China coastline by mitochondrial control region amplification and SLAF-seq. 8 haplotypes were detected in control region， haplotype diversity (h) and nucleotide diversity (π) were 0.130 7 and 0.000 7， respectively. No significant topological structure was found in haplotype network and NJ phylogenetic tree. Neutrality tests and mismatch distribution both suggested thatB.neritinadid not experience a range expansion.Fstand AMOVA analysis indicated that genetic variation mainly occurred within populations. SLAF library construction generated 214 409 SLAFs， among which 23 437 were polymorphic， 99 432 SNP loci were developed. Genetic distances among populations were short and even shorter than those within populations. Phylogenetic tree and population genetic analysis based on SNP data revealed that no significant genetic structure were observed among populations. In conclusion， genetic diversity ofB.neritinain coastal waters of China were low， and no significant genetic structure existed among geographically distinct populations. We assumed this was mainly attributed to bryozoan’s capability to disperse. In addition， our study validated the application and advantages of SLAF-seq in population genetic variation study of marine organisms．

Bugulaneritina; population genetic variation; mitochondrial DNA; SLAF-seq; reduced representation sequencing

10.3969/j.issn.0253-4193.2017.10.008

Q953+.1

：A

：0253-4193(2017)10-0090-11

2017-02-28；

：2017-06-15。

國(guó)家海洋局公益性項(xiàng)目“幾種重要海洋藥用生物種質(zhì)資源發(fā)掘、保藏和利用——重要海洋藥用生物優(yōu)良種質(zhì)評(píng)價(jià)和篩選”(201205024-2)。

李海(1988—)，男，江西省萍鄉(xiāng)市人，博士，主要從事海洋生物遺傳多樣性與進(jìn)化研究。E-mail:lihai@tio.org.cn

*通信作者：丁少雄，教授，主要從事海洋生物資源保護(hù)與利用研究。E-mail:sxding@xmu.edu.cn

李海，劉巧紅，唐雪穎，等. 我國(guó)近岸多室草苔蟲(chóng)(Bugulaneritina)的群體遺傳分化研究 [J].海洋學(xué)報(bào)，2017，39(10)：90—100，

Li Hai，Liu Qiaohong，Tang Xueying，et al. Population genetic variation study ofBugulaneritinain coastal waters of China[J]. Haiyang Xuebao，2017，39(10)：90—100， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2017.10.008