周應培，馮莉莉

（1.湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128；2.長沙道勤生物科技有限公司，湖南長沙410129）

試驗研究

泰萬菌素對大鼠胃菌群的影響

周應培1,2，馮莉莉1,2

（1.湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128；2.長沙道勤生物科技有限公司，湖南長沙410129）

為了解泰萬菌素對大鼠胃內菌群結構的影響,試驗采用PCR-DGGE技術分離方法分析大、小劑量泰萬菌素作用下大鼠胃內細菌的變化情況及其停藥后恢復狀態(tài)。結果顯示：泰萬菌素作用時，大鼠胃內細菌數(shù)量減少，菌群多樣性降低，且在大劑量組效果顯著；停藥后僅有兩種細菌恢復，大、小劑量組各有2種、4種細菌消失。泰萬菌素在某種程度上能抑制細菌的生長，但也可以間接促進某些細菌生長，總體而言泰萬菌素對大鼠腸道菌群結構的影響不大。

泰萬菌素；DGGE；胃；菌群結構

胃在動物消化、吸收營養(yǎng)等方面具有重要意義，同時，胃內菌群結構在維持胃正常功能方面發(fā)揮著至關重要的作用。然而，近年來，由于抗生素的濫用，造成了消化道菌群結構紊亂、細菌間的交互耐藥性等方面的問題。為此，英國伊科動物保健公司開發(fā)出比同類型大環(huán)內酯類抗生素在抗菌譜、作用強度、毒副作用等方面更具優(yōu)勢的泰萬菌素,其作用機理是阻斷肽鏈延伸，導致細菌難以合成蛋白質，從而發(fā)揮殺滅有害菌的治療效果。但抗生素在殺滅有害菌的同時也可能抑殺有益菌，故探究泰萬菌素是否對消化道內細菌產(chǎn)生嚴重傷害有一定意義，但目前國內外對這方面的研究較少，本研究采用PCR-DGGE技術探討泰萬菌素對大鼠胃內菌群的影響及用藥后細菌恢復力。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

Wester大鼠18只，體重180±8 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

泰萬菌素，購自湖南某生物科技股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA片段快速純化/回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；變性梯度凝膠電泳儀系統(tǒng)（DGGEK-2001），購自美國CBS公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗動物處理與試驗方法

將大鼠連續(xù)預飼7 d后，隨機分成3組（分別為對照組、小劑量組、大劑量組），每組6只。

以純凈水溶解泰萬菌素，使其濃度為11.6 mg/50mL和23.2mg/50mL，分別供大、小劑量試驗組自由飲用，連續(xù)3d。對照組自由飲用純凈水。第4 d后，兩試驗組停藥，改飲純凈水。

分別于投藥后的第4 d、11 d取樣，取樣方法是：每組隨機取鼠3只，無菌條件下分別取胃內容物約2 g置入無菌離心管內，加入滅菌生理鹽水（300μL），然后300 r/min離心10min，移取上清液至另一干凈離心管，12 000 r/min，10min，棄上清，沉淀備用。

1.3.2 樣品細菌總DNA提取

取沉淀，加入緩沖液，蛋白酶k消化，按細菌基因組DNA提取試劑盒步驟提取細菌基因組DNA，操作見說明書。

1.3.3 細菌16S rDNA V3區(qū)擴增

以 細 菌 總 DNA 為 模 板 ，341F（5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 907R（5’-CCCCGTCAATTCATTTGAGTTT-3’）為引物，進行第一輪擴增。以上述PCR產(chǎn)物為模板，以341F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC CGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和 518R(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)為引物，進行第二輪擴增，產(chǎn)物即為細菌16S rDNA V3區(qū)。上述擴增體系為：細菌DNA模板2.0μL，上、游引物各1μL，TransTaqHiFiSuperMix 25 μL，補加 ddH2O 至50μL。擴增條件為：95℃ 5min；95℃ 30 s、66℃30 s、72.0 ℃ 12 s，32 個循環(huán)；72.0 ℃ 7min。

取第二輪PCR產(chǎn)物5μL，于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳30min，觀察結果。

1.3.4DGGE電泳及產(chǎn)物處理

取第二輪PCR產(chǎn)物10μL，點樣于預先制備好的變性凝膠點樣孔，在60℃、300 V電壓下預電泳10min，再電泳7.0 h。取出凝膠，EB染色20min，觀察，拍照，分析。

紫外光下切取DGGE膠中明亮、清晰的條帶，沖洗3次至滅菌EP管中，以DNA片段快速純化回收試劑盒純化回收DNA片段。產(chǎn)物與pMETeasy載體連接，轉化DH5α感受態(tài)細胞，陽性克隆，送至深圳華大基因科技服務有限公司測序。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

將測序序列與GenBank上已登錄序列進行Blast比對，尋找相似度最高的同源性序列。用Quantity One v4.6.2構建DGGE電泳譜圖進行分析。

2 結果與分析

2.1 細菌16S rDNA V3區(qū)擴增結果

上述樣品經(jīng)二輪擴增，產(chǎn)物大小約為200bp，與預計大小一致，見圖1。

圖1 大鼠胃內細菌16S rDNA V3區(qū)擴增片段

2.2 細菌16S rRNA V3區(qū)DGGE電泳結果分析

用上述擴增的細菌16S rRNA V3區(qū)產(chǎn)物進行DGGE電泳，結果見圖2。

圖2 大鼠胃細菌菌群DGGE電泳圖

從圖2可見：大鼠飲用泰萬菌素后，細菌種類有所減少，如小劑量組A2、A6、A8等條帶消失，大劑量組A2、A3、A4等條帶消失；細菌數(shù)目下降，如小劑量組A5、A7條帶亮度降低，大劑量組A10條帶亮度減弱；有新的細菌出現(xiàn)，如小劑量組A9、A13條帶出現(xiàn)，大劑量組A9條帶出現(xiàn)。停藥后，相對于用藥期：細菌數(shù)目下降，如小劑量時的A1、A12、A13等條帶消失，大劑量時的A9、A12消失；而用藥時消失的細菌部分恢復，如停藥后A2、A10條帶重新出現(xiàn)。停藥后細菌種類沒有恢復到原來狀態(tài)，但有恢復趨勢。

2.3 優(yōu)勢條帶測序結果與分析

本實驗切取13條DGGE優(yōu)勢條帶，純化、回收，經(jīng)測序、比對后，選擇與之最相近菌種，結果見表1。

表1 DGGE回收條帶序列比對結果

從表1中可見：胃內存在細菌有乳酸菌、糞芽孢桿菌、志賀氏桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和巴氏梭菌等桿菌屬和梭菌屬，其相似度大97%以上。

結合圖2和表1，用藥后條帶發(fā)生了明顯的變化，一些細菌豐度降低，另一些細菌豐度升高，胃內細菌多樣性降低,這一現(xiàn)象在高濃度作用時更顯著。停藥后細菌短時間內未恢復到原來狀態(tài)，但有恢復傾向。這與陳鳳[1]（2015）研究：口服抗生素后腸道菌群發(fā)生改變，停藥3周后腸道菌群恢復到原來狀態(tài)結果相近。

3 討論

泰萬菌素導致胃內菌群結構不同程度的改變，其潛在影響因素可能有如下幾種：

（1）泰萬菌素的抗菌作用，大環(huán)內酯類抗生素對需氧革蘭陽性菌、部分革蘭陰性菌有很好的抑殺作用[2]。同時，一些抗生素可抑制消化道內有害菌的生長，如諾氟沙星可干擾致病菌DNA復制來抑制致病菌生長。

（2）胃內細菌形成相互競爭，相互制約的關系，當一種細菌減少或消失時，另外一種細菌可能因為獲得其生態(tài)位或失去制約而瘋長。如：朱小翠認為，芽孢桿菌（Bacillus）能參與生物奪氧，降低腸道內局部的氧分壓，維持腸道環(huán)境的穩(wěn)定，抑制某些細菌的生長[3]。

（3）胃內微生態(tài)改變，在泰萬菌素的作用下胃內菌群結構改變，引起其微生態(tài)發(fā)生變化。新的條件更適于一些細菌的生長，而不利于另外一些菌的生長。

（4）泰萬菌素在胃內的吸收效果，胃由于胃酸的作用，同時大環(huán)內酯類抗生素為弱堿性[4]，泰萬菌素在胃內可能由于被中和而導致藥物濃度無法抑制某些細菌生長。

（5）腸道菌群的代謝功能，陳懷俠[5]（2007）等采用液質聯(lián)用技術對阿托品在大鼠腸道菌群中的代謝產(chǎn)物進行了研究，發(fā)現(xiàn)了9種阿托品腸道菌群代謝產(chǎn)物，如脫水阿托品、脫品和脫品酸。藥物進入消化道后，可通過消化道內細菌的代謝活化使之具備強大的藥理活性[6]，從而發(fā)揮更好療效，對某些細菌抑制作用加強。

無論是胃內細菌增多或減少，結果表明泰萬菌素作用下，對胃腸道產(chǎn)生了一定影響，但未造成不可逆損傷，且停藥后胃內菌群結構有恢復到原來狀態(tài)的趨勢。這預示著在養(yǎng)殖生產(chǎn)上合理使用泰萬菌素是安全的，但若過量使用可能會導致腸道菌群失衡，產(chǎn)生耐藥性細菌，故用藥時應謹慎。

本實驗采用的DGGE技術克服了微生物難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)兩方面的局限，不僅具有可大量檢測、能與其他方法結合使用等優(yōu)點，其在揭示自然界微生物多樣性方面具有獨特的優(yōu)越性。

[1]陳鳳.口服抗生素改變大鼠腸道菌群和大腦海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達及其恢復[D].遼寧：大連醫(yī)科大學,2015：13.

[2]李喆宇,崔玉彬,張靜霞,等.大環(huán)內酯類抗生素的研究新進展[J].國外醫(yī)藥（抗生素分冊）,2013,34(1)：6-15.

[3]朱小翠.斷奶仔豬胃腸道乳酸菌與芽孢桿菌分離鑒定及其生物學特性研究[D].南京：南京農業(yè)大學,2012：4-7.

[4]周秀錦,張靜,林維宣,等.質譜檢測泰樂菌素的方法研究進展[J].安徽農業(yè)科學,2016,44(23)：31-34.

[5]陳懷俠,陳勇,韓鳳梅,等.電噴霧串聯(lián)質譜法分析阿托品及其代謝物[J]．分析化學,2007,35(1)：61-65.

[6]張照楠,陳瑞雪,王躍飛,等.藥物與腸道菌群的相互作用[J].中藥材,2015,38(6)：1319-1323.

S859.796

A

1006-4907（2017）04-0033-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.04.017

2017-07-17

周應培（1981～），男，漢族，湖南寧鄉(xiāng)人，助理獸醫(yī)師，主要從事動物疫病的防控和研究，E-mail：779977588@.com。