文│呂艷秋 黃東風(fēng) 姚學(xué)軍 邱海蓮 劉潔 高曉波 張亦馳（北京市昌平區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心）

抗體滴度與更換吸頭的相關(guān)性報告

文│呂艷秋 黃東風(fēng) 姚學(xué)軍 邱海蓮 劉潔 高曉波 張亦馳（北京市昌平區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心）

目前，基層獸醫(yī)實驗室主要采用血凝抑制（HI）試驗（微量）方法檢測新城疫免疫抗體滴度。此方法過程：用微量移液器在96孔V型微量反應(yīng)板的1～11孔加入0.025毫升等滲磷酸鹽緩沖液（PBS），第12孔加入0.05毫升PBS；吸取0.025毫升血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸取0.025毫升于第2孔，依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025毫升棄去，第11孔為陽性對照，第12孔為PBS對照；1～11孔均加入含4個血凝單位（4HAU）混勻的病毒抗原液0.025毫升，室溫（約20℃）靜置至少30分鐘；每孔加入0.025毫升體積分?jǐn)?shù)為1%的紅細(xì)胞懸液混勻，微量振蕩器震蕩1分鐘，靜置約40分鐘（室溫20℃）。當(dāng)PBS對照孔紅細(xì)胞呈明顯紐扣狀沉于孔底時，即可判定。

試驗中我們發(fā)現(xiàn)，移液器吸頭吸出血清樣本時，吸頭外壁會粘黏上血清。如果利用同一個吸頭將血清樣本加入96孔V型微量反應(yīng)板，再將混合液依次倍比稀釋，那么在吸頭外壁上粘黏的血清將與PBS液混合，這樣就導(dǎo)致血清樣本與PBS液的體積不一致。但是，如果將血清樣品加入96孔V型微量反應(yīng)板時不與PBS液面接觸，血清樣本的體積與PBS液的體積是等量的。針對這一問題，筆者進(jìn)行了一項對比試驗。以期檢驗出血凝抑制試驗微量法檢驗過程中更換吸頭，是否會影響HI抗體效價（滴度）。

一、材料與方法

1.樣本。被檢雞血清來自北京市昌平區(qū)3家養(yǎng)殖戶。隨機(jī)抽檢49只健康成年雞的血清。

2.檢測分組。

（1）試驗一組。用移液器將吸頭伸入血清樣本儲存管中吸出0.025毫升血清，再將血清加入96孔V型微量反應(yīng)板后，使用同一個吸頭參與混勻血清和PBS液，并依次倍比稀釋血清樣本。

（2）試驗二組。用移液器將吸頭伸入血清樣本管中吸出0.025毫升血清，打入96孔V型微量反應(yīng)板后（吸頭不接觸液面），棄去吸頭，另取一支新的吸頭在96孔V型微量反應(yīng)板中混勻血清和PBS液，并按照操作步驟依次倍比稀釋血清樣本。

表1 雞血清NDV-HI試驗抗體滴度檢測結(jié)果統(tǒng)計

表2 雞血清NDV-HI試驗抗體檢測結(jié)果方差分析

以上兩個試驗組檢測的血清樣本相同。

3.檢測試劑。

新城疫（NDV）抗原批號：20150201，新城疫（NDV）陽性血清批號：20151003。以上試劑均購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

4.檢測方法。

室溫條件下，將采集的雞血液離心，分離血清，血凝抑制（HI）試驗法測定抗體效價，具體操作參照GB/T 16550-2008 新城疫診斷技術(shù)中6血凝抑制試驗進(jìn)行。

5.檢測結(jié)果判定。

以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。

二、檢測結(jié)果

試驗一組和試驗二組均采用血凝抑制試驗方法檢測抗體滴度，采用方差分析，結(jié)果統(tǒng)計分析見表1～2。

三、結(jié)果與分析

從試驗分析結(jié)果可以看出，采用NDV-HI試驗檢測雞血清抗體，從血清管內(nèi)吸出血清和混合稀釋過程使用同一支吸頭與稀釋前更換吸頭檢測抗體效價，經(jīng)t檢驗，P值為0.46 （P＞0.05）。方差分析結(jié)果，雞血清采樣在吸出血清和稀釋過程使用同一支吸頭和更換吸頭的抗體效價兩組差異不顯著。因此，實驗室利用血凝抑制試驗（微量法）檢測雞血清樣品在稀釋前，不更換吸頭，不會影響新城疫抗體效價結(jié)果。