王長(zhǎng)江，曲光剛，金婷婷，武曰星，劉 慧，沈志強(qiáng)1,

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北武漢 43000)

犬新孢子蟲(chóng)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制因子生物學(xué)特性鑒定

王長(zhǎng)江2，曲光剛1*，金婷婷2，武曰星2，劉 慧3，沈志強(qiáng)1,2

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北武漢 43000)

為了對(duì)犬新孢子蟲(chóng)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制因子(NcMIF)生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，將NcMIF在大腸埃希菌中以3種不同的形式進(jìn)行表達(dá)，三種蛋白分別為NcMIF(成熟的蛋白質(zhì))，NcMIFm(脯氨酸突變?yōu)楦拾彼?和NcMIFhis(在N端添加多組氨酸標(biāo)記)，對(duì)三種蛋白的多聚體狀態(tài)、互變異構(gòu)酶、氧化還原酶及是否與MIF受體(CD74)結(jié)合等進(jìn)行分析。結(jié)果顯示這三種重組的NcMIFs (rNcMIF)均不具備互變異構(gòu)酶和氧化還原酶活性；甘氨酸替代脯氨酸的重組NcMIF減少了二聚體和三聚物的形成；N端額外添加的HIS標(biāo)簽增加了三聚物的形成；rNcMIF無(wú)法與重組人MIF競(jìng)爭(zhēng)與MIF受體(CD74)結(jié)合，表明CD74不是NcMIF的結(jié)合受體；免疫熒光染色結(jié)果表明NcMIF定位于犬新孢子蟲(chóng)速殖子的頂端。免疫電鏡結(jié)果進(jìn)一步顯示NcMIF存在于微線體、棒狀體、致密顆粒及細(xì)胞核中。為進(jìn)一步分析NcMIF在寄生蟲(chóng)免疫逃逸過(guò)程中的作用提供參考。

犬新孢子蟲(chóng)；巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制因子；互變異構(gòu)酶；氧化還原酶

Correspondingauthor:QUGuang-gang,E-mail：guanggangqu@163.com

Abstract: NcMIF was cloned and expressed inEscherichiacoliin 3 forms, including NcMIF (mature protein), NcMIFm (mutation of proline-2 to glycine), and NcMIFhis (addition of a polyhistidine tag at the N-terminus). And then, the multimeric state, tautomerase and oxidoreductase of these proteins and binding ability with MIF receptor (CD74) were analyzed. Results showed that none of these recombinant NcMIFs (rNcMIF) had tautomerase and oxidoreductase activities. The glycine substitution for proline-2 of NcMIF resulted in decreased formation of dimers and trimers. The addition of N-terminal HIS-tag led to increased formation of trimers. rNcMIF was unable to compete with recombinant human MIF for a MIF receptor (CD74), suggesting that NcMIF does not bind to this MIF receptor. Immunofluorescence staining demonstrated that NcMIF was localized to the apical end ofNeosporacaninumtachyzoites. Immunoelectron microscopy further revealed that NcMIF was present in the micronemes, rhoptries, dense granules, and nuclei. This study provides a reference for further analysis of the role of NcMIF in the immune escape of parasites.

Keywords:Neosporacaninum; macrophage migration inhibitory factor; tautomerase; oxidoreductase

巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)[1-2]是40年前首先被確定的細(xì)胞因子之一。MIF具有兩種潛在的生物學(xué)催化活性，即互變異構(gòu)酶與氧化還原酶活性，并參與固有免疫應(yīng)答及適應(yīng)性免疫反應(yīng)過(guò)程[3-4]。MIF最重要的作用是對(duì)巨噬細(xì)胞[5-6]和淋巴細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)以及對(duì)激素功能的調(diào)控[7-8]。此外，MIF還參與腫瘤的發(fā)展進(jìn)程以及血管生成，并被證實(shí)能夠與細(xì)胞表面的CD74受體結(jié)合。

MIF不具有N端前導(dǎo)序列或者明顯的內(nèi)部信號(hào)序列，但是免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞能夠通過(guò)非傳統(tǒng)的無(wú)前導(dǎo)途徑分泌MIF。研究表明，與高爾基體相關(guān)聯(lián)的P115能介導(dǎo)MIF分泌[9]。化學(xué)交叉偶聯(lián)研究表明鼠MIF在生理環(huán)境下形成同型三聯(lián)體[10]，而平衡沉淀速率研究證明，人MIF在相同條件下往往形成單體、二聚體及三聚體的混合物[11]。X射線晶體學(xué)研究也支持人與鼠的MIF以同型三聚體的形式存在的結(jié)論[3, 12]。另外，這些MIF與細(xì)菌酶4-OT和5-CM-2HI在結(jié)構(gòu)上屬于同一族[13]。N端第二位的脯氨酸在啟動(dòng)蛋氨酸的水解作用下變化為N末端，它是細(xì)菌酶與MIF發(fā)生酶促反應(yīng)后的關(guān)鍵殘余物[13-14]。MIF基因嵌入的小鼠免疫試驗(yàn)表明MIF的互變異構(gòu)酶活性與免疫調(diào)節(jié)作用之間存在相關(guān)性，這一相關(guān)性也表明了第二位脯氨酸的結(jié)構(gòu)完整性介導(dǎo)蛋白質(zhì)間的相互作用，而蛋白間的這種相互作用對(duì)于MIF的生物學(xué)活性是至關(guān)重要的[15]。

本研究通過(guò)對(duì)NcMIF的生物學(xué)活性分析，為進(jìn)一步了解NcMIF在寄生蟲(chóng)免疫逃逸過(guò)程中發(fā)揮的作用提供參考。

1 材 料

1.1 主要試劑及其配方 戊二醛(Sigma，St.Louis，MO)；NaBH4(Sigma，St. Louis，MO)；脫氧膽酸鈉(Sigma，St. Louis，MO)；蛋白用染色試劑盒(Sigma，St. Louis，MO)；加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗兔IgG (Sigma，St. Louis，MO)；脂多糖(E.coliO111∶B4，Sigma-Aldridge，St. Louis，MO)；ELISA試劑盒(eBioscience Inc，San Diego，CA)

1.2 主要儀器 多孔載玻片(Erie Scientific Co.，Portsmouth，NH)；酶標(biāo)儀(Molecular Devices SpectraMaxPlus384，Ramsey，MN)；分光光度計(jì)(Beckman，Atlanta GA)

2 方 法

2.1 NcMIF偶聯(lián)反應(yīng) 2 μg/mL rNcMIF蛋白在pH6.5的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液并含1%戊二醛的溶液中室溫孵育3 h。然后向交聯(lián)后產(chǎn)物加入NaBH4(2 mol/L)至終濃度50 mmol/L進(jìn)行固定。20 min后加入終濃度為0.01%的脫氧膽酸鈉。利用三氯乙酸沉淀法濃縮蛋白，并在還原條件下通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析。蛋白使用染色試劑盒銀染后可直接觀察結(jié)果。

2.2 犬新孢子蟲(chóng)速殖子中NcMIF的免疫定位 用移液器分別向多孔載玻片的單孔中加入10 μL含有速殖子數(shù)為106/mL的PBS，自然干燥。玻片干燥后加入冷的甲醇浸泡5 min，然后加入含2%脫脂奶粉的PBS室溫封閉30 min。洗滌后向玻片中加入1∶100稀釋的兔抗NcMIF抗體或免疫血清，室溫孵育2 h。PBS洗滌5次后，加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗兔IgG，室溫孵育1 h。PBS洗滌后玻片用Vectashield封固劑覆蓋，蓋上蓋玻片，使用熒光顯微鏡觀察圖像。

免疫金電鏡染色技術(shù)(IEM)參照J(rèn)enkins等人[16]文章中的方法，即將犬新孢子蟲(chóng)速殖子用5000 g 離心2 min收集沉淀，然后將其重懸于100 μL含3%多聚甲醛、0.5%戊二醛的0.1 mol/L二甲砷酸鹽緩沖液固定劑中。經(jīng)過(guò)5 min固定，采用5000 g離心5 min收集速殖子，使用二甲砷酸鹽緩沖液洗滌，然后將其混勻形成分散的小球。隨后將速殖子用梯度乙醇脫水處理，使用LR白色硬級(jí)丙烯酸樹(shù)脂浸潤(rùn)過(guò)夜，55 ℃條件下熏蒸處理24 h。使用硅藻金剛鉆刀在切片機(jī)上制作90 nm厚度的截面，用200目的鎳網(wǎng)格收集。將這些網(wǎng)格用含0.1 mol/L甘氨酸和1%牛血清白蛋白的PBS浸潤(rùn)，并用含脫脂奶粉的PBST浸潤(rùn)。網(wǎng)格用含1∶100稀釋的羊抗NcMIF血清、兔抗NcMIF或先前免疫的血清浸潤(rùn)，室溫孵育2 h。網(wǎng)格用PBS沖洗，然后使用含1∶100金標(biāo)抗羊IgG或抗兔IgG的PBS孵育。經(jīng)過(guò)PBS和水的連續(xù)洗滌后，自然干燥網(wǎng)格，用5%乙酸雙氧鈾著色30 min后用HT7700電子顯微鏡進(jìn)行鏡檢。

2.3 互變異構(gòu)酶和氧化還原酶分析 將48 μL的10 mmol/L鹽酸左旋多巴甲酯(L-3,4-dihydroxyphen ylalanine methyl ester)和32 μL的20 mmol/L高碘酸鈉加入到720 μL含有1 mmol/L EDTA和pH6.2的50 mmol/L PBS中，反應(yīng)后生成L-多巴色素甲醇(L-dopachrome methyl ester)，以此為底物，利用分光光度計(jì)檢測(cè)NcMIF的互變異構(gòu)酶活性。將該底物800 μL加入到1 mL的比色皿中，然后加入NcMIF至終濃度2 ug/mL，在A475波長(zhǎng)處讀取吸光值20 min，同時(shí)設(shè)鼠的MIF為陽(yáng)性對(duì)照。

NcMIF氧化還原酶作用主要通過(guò)催化還原胰島素實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。將49 μL重組蛋白和6 μL 200 mmol/L還原型谷胱甘肽加到195 μL冰冷含有2 mmol/L EDTA和1 mg/mL胰島素的100 mmol/L PBS緩沖液(pH7.2)中，在23 ℃讀取650 nm的吸光值，共讀取96 min。

2.4 與人類CD74受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析 96孔細(xì)胞板上包被重組的可溶性CD74胞外域(sCD7473-232)，生物素標(biāo)記的重組人類MIF(rhMIF，2 ng/μL)(Roche Applied Sciences)與純化的(未生物素標(biāo)記的)不同濃度的rNcMIF或rNcMIFm一起同時(shí)加入三個(gè)孔中。通過(guò)加入鏈霉親和素堿性磷酸酶(R&D)檢測(cè)磷酸對(duì)硝基苯酯堿性磷酸酶來(lái)確定生物素標(biāo)記rhMIF的量，在405 nm波長(zhǎng)處讀數(shù)，讀數(shù)減去只有生物素標(biāo)記的rhMIF孔的讀數(shù)。

3 結(jié) 果

3.1 rNcMIFs偶聯(lián)反應(yīng) 為揭示rNcMIFs寡聚體形式，3種不同的rNcMIFs分別進(jìn)行交聯(lián)，并在還原條件下電泳分析。交聯(lián)反應(yīng)試驗(yàn)表明沒(méi)有，經(jīng)過(guò)偶聯(lián)的三種形式rNcMIFs蛋白主要呈現(xiàn)單體形式，但二聚體形式也較明顯(圖1)。rNcMIF呈現(xiàn)等量的單體、二聚體和三聚體，低水平的分子量更高的寡聚物也存在(圖1A)。rNcMIFm蛋白主要以單體形式存在，其中也包含有二聚體和三聚體(圖1B)。值得注意的是，rNcMIFhis蛋白主要存在形式為三聚體，還包括低水平的單體和二聚體以及高水平的寡聚體形式(圖1C)。

3.2 犬新孢子蟲(chóng)速殖子的免疫定位 免疫定位結(jié)果顯示，兔抗犬新孢子蟲(chóng)抑制蛋白[17]作陽(yáng)性對(duì)照呈現(xiàn)綠色的熒光，僅使用PBS、山羊抗兔IgG-FITC、免疫前血清或不相關(guān)的免疫血清時(shí)觀察不到相似的熒光現(xiàn)象(圖2A，a～d)，而NcMIF組顯示NcMIF被緊密地定位在寄生蟲(chóng)頂端末梢(圖2A，e和f)。免疫電鏡結(jié)果證明，NcMIF被特異性的定位在犬新孢子蟲(chóng)棒狀體和微線體(圖2B，b～d)、密集顆粒(圖2B，e)和細(xì)胞核上(圖2B，f)。

3.3 rNcMIF不具有互變異構(gòu)酶和氧化還原酶活性MIF具有互變異構(gòu)酶活性，雖然它與MIF的生物學(xué)相關(guān)性還不明確。為確定復(fù)性或未復(fù)性的rNcMIF的酶活性，使用多巴色素底物進(jìn)行互變異構(gòu)酶分析。陽(yáng)性對(duì)照鼠源MIF具有互變異構(gòu)酶活性，0.6 μg/mL的濃度條件下可檢測(cè)到酶活性315 μmoLmin-1mg-1(圖3A)。然而rNcMIF或rNcMIFm在10 μg/mL濃度下復(fù)性之前或之后均沒(méi)有檢測(cè)到互變異構(gòu)酶活性(圖3B)。rNcMIFhis在高濃度(10 μg/mL)下有很低的但可檢測(cè)到的互變異構(gòu)酶活性，后被證實(shí)這是由于該蛋白純化時(shí)蛋白洗脫液中的咪唑?qū)е碌摹?/p>

3.4 rNcMIF不能與人類MIF受體CD74結(jié)合 rNcMIF CD74受體結(jié)合試驗(yàn)證明，rNcMIF和rNcMIFm都無(wú)法競(jìng)爭(zhēng)人rhMIF與MIF受體CD74(外功能區(qū)73～232)結(jié)合(圖4)。

泳道1：用NaBH4固定蛋白而不用1%戊二醛處理；泳道2：用1%戊二醛處理蛋白而不用NaBH4固定；泳道3：蛋白用1%戊二醛處理后用NaBH4固定；泳道4：蛋白不做任何處理；M：?jiǎn)误w；D：二聚體；T：三聚體。左側(cè)顯示為蛋白marker。Lane 1: protein fixed by NaBH4 without 1% glutaraldehyde; Lane 2: protein treated with 1% glutaraldehyde without NaBH4 fixation; Lane 3: protein treated with 1% glutaraldehyde followed by NaBH4 fixation; Lane 4: protein without any treatment. M, monomer; D, dimer; T, trimer. Molecular weight ladder is shown to the left.圖1 NcMIF(A)、rNcMIFm(B)和rNcMIFhis(C)的化學(xué)交叉偶聯(lián)及4%～12%銀染NuPAGE分析Fig 1 Chemical crosslinking of rNcMIF(A), rNcMIFm, and rNcMIFhis(C) and analysis by silver-stained 4%～12% NuPAGE

A：兔抗NcMIF血清作為一抗，山羊抗兔IgG-FITC作為二抗進(jìn)行IFA檢測(cè)，不同情況下NcMIF的定位情況：(a)僅加入PBS不加抗體；(b)僅加二抗(1∶100稀釋)；(c)免疫前兔血清(1∶100稀釋)；(d)兔抗非犬新孢子蟲(chóng)重組蛋白血清(1∶100稀釋)；(e)兔抗重組犬新孢子蟲(chóng)抑制蛋白對(duì)照(1∶100稀釋)；(f)兔抗rNcMIF血清(1∶100稀釋)。B：用綿羊抗NcMIF作為一抗，兔抗綿羊IgG-gold作為二抗，通過(guò)免疫電子顯微鏡對(duì)NcMIF進(jìn)行定位。R：棒狀體；M：微絲；A:頂端；N：細(xì)胞核；DG：致密顆粒。9a：放大10000倍；b-f：放大50000倍。A. IFA using a rabbit anti-NcMIF serum as primary antibody and goat anti-rabbit IgG-FITC as secondary reagent: (a) PBS alone without application of antibodies; (b) second antibody (1∶100) alone; (c) pre-immune rabbit serum (1∶100 dilution); (d) rabbit antisera to a non-N. caninum recombinant protein (beta-giardin of Giardia lamblia) (1∶100 dilution) as an irrelevant antibody control;(e) rabbit antisera to recombinant Neospora profilin (1∶100 dilution) as a positive control; (f) rabbit antisera against rNcMIF (1∶100). B. Localization of NcMIF by immunoelectron microscopy using sheep anti-NcMIF as primary antibody and rabbit anti-sheep IgG-gold as secondary antibody. R: rhoptry; M: microneme; A: apical; N: nucleus; DG: dense granule. a: ×10000; b～f: ×50000.圖2 間接熒光(IFA)(A)和免疫電鏡(B)在犬新孢子蟲(chóng)速殖子中對(duì)NcMIF進(jìn)行免疫定位Fig 2 Immunolocalization of NcMIF in Neospora tachyzoites by indirect fluorescence assay (IFA) (A) and immunoelectron microscopy (B)

A：0.5 μg/mL mMIF在多巴色素互變異構(gòu)酶活性檢測(cè)中用作陽(yáng)性對(duì)照；B：10 μg/mL rNcMIF和rNcMIFm的多巴色素互變異構(gòu)酶活性。A: mMIF was used as a positive control in the dopachrome tautomerase activity with a final concentration of 0.5 μg/mL;B: rNcMIF and rNcMIFm with a final concentration of 10 μg/mL were assayed for the dopachrome tautomerase activity.圖3 mMIF(A)和rNcMIFs(B)的多巴色素互變異構(gòu)酶活性Fig 3 Dopachrome tautomerase activity of mMIF (A) and rNcMIFs (B)

圖4 在與生物素標(biāo)記rhMIF競(jìng)爭(zhēng)條件下rNcMIF、rNcMIFm、rhMIF與人MIF受體功能區(qū)結(jié)合的能力Fig 4 Binding ability of rNcMIF, rNcMIFm, and rhMIF to the human MIF receptor ectodomain (sCD74) in vitro capture assay using biotinylated-rhMIF as competitor

4 討 論

本研究中，交聯(lián)反應(yīng)試驗(yàn)證明NcMIF呈現(xiàn)出與人類MIF相似的低聚物形式，第二位氨基酸由脯氨酸突變?yōu)楦拾彼釙r(shí)NcMIFm低聚物明顯增多，同時(shí)單個(gè)氨基酸的突變不利于MIF二聚體和三聚體的形成。此外，在N端額外添加His標(biāo)簽的NcMIF三聚體聚合物明顯增加。這些結(jié)果表明改變MIF蛋白N-端氨基酸序列或?qū)ζ溥M(jìn)行化學(xué)修飾會(huì)明顯改變?cè)摰鞍椎慕Y(jié)構(gòu)，但這一改變可能對(duì)蛋白功能的影響尚無(wú)法確定。在Bernacchi等[18]報(bào)道中指出MIF蛋白序列中脯氨酸的存在對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和聚合狀態(tài)至關(guān)重要，但是第二位脯氨酸的作用仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

在互變異構(gòu)酶活性方面，NcMIF在其氨基酸序列中含有與該活性相關(guān)的關(guān)鍵第二位氨基酸——脯氨酸，還含有對(duì)互變異構(gòu)酶起到重要作用的五種氨基酸殘基中的三個(gè)相關(guān)殘基(Lys33，Il65，Tyr96)。互變異構(gòu)酶活性是原生動(dòng)物MIF具有的標(biāo)志性功能，與原生動(dòng)物相比，其他動(dòng)物的MIF、NcMIF和NcMIFm均缺乏互變異構(gòu)酶活性。NcMIF缺失這一活性的原因也許不是構(gòu)象折疊導(dǎo)致的，因?yàn)槲覀儑L試對(duì)蛋白進(jìn)行復(fù)性且復(fù)性后的蛋白仍不能催化底物。然而在本研究中我們檢測(cè)到NcMIFhis具有低水平的互變異構(gòu)酶活性，但這之后被證實(shí)是因?yàn)樵诘鞍准兓瘯r(shí)低水平的咪唑的存在導(dǎo)致的。我們猜測(cè)雖然第二位脯氨酸對(duì)所有MIF同系物的互變異構(gòu)酶活性都起到重要作用，但其它與互變異構(gòu)酶活性相關(guān)的氨基酸殘基也許也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。對(duì)于NcMIF來(lái)說(shuō)，由于缺少其它氨基酸殘基或序列，從而可能失去了互變異構(gòu)酶活性。Sommerville等[19]報(bào)道稱重組的弓形蟲(chóng)MIF(TgMIF)具有互變異構(gòu)酶活性但水平較低，在37 ℃測(cè)得含量為19 μmolmin-1mg-1。而我們?cè)诜治鯪cMIF的互變異構(gòu)酶活性時(shí)，采用了較低溫度從而降低了檢測(cè)的靈敏度，這可能部分說(shuō)明為什么檢測(cè)不到NcMIF的互變異構(gòu)酶活性。

同樣，NcMIF和NcMIFm也不具備氧化還原酶活性。這從Alam等[20]的闡述中可知，由于NcMIF缺乏對(duì)該酶功能起關(guān)鍵作用的兩個(gè)半胱氨酸中的一個(gè)，從而直接導(dǎo)致氧化還原酶活性的缺失。該酶活性的缺失也進(jìn)一步解釋了NcMIF不與MIF靶向受體CD74結(jié)合的原因。雖然沒(méi)有證據(jù)表明犬新孢子蟲(chóng)會(huì)傳染人類，但這一寄生蟲(chóng)實(shí)際上可在體外侵染所有種類的細(xì)胞。另外，牛CD74與人類CD74表現(xiàn)出高度的氨基酸序列同源性，用于MIF結(jié)合試驗(yàn)中的人類CD74片段與牛CD74相關(guān)序列的同源性在77%，說(shuō)明了人類和牛CD74分子在該片段結(jié)構(gòu)上的相似性。

NcMIF主要定位于速殖子頂端。免疫電子顯微鏡進(jìn)一步揭示NcMIF定位在類似于棒狀體、微線體、致密顆粒、細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)上。需要特別注意的是NcMIF明顯存在于細(xì)胞核。近期Arnoys等[21]在研究中報(bào)道NcMIF以及其他物種的MIFs不含信號(hào)序列或核定位信號(hào)，但卻在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及胞外間質(zhì)大量存在。

報(bào)道已證明，利什曼原蟲(chóng)和瘧原蟲(chóng)的MIFs均具有生物學(xué)活性。然而我們研究發(fā)現(xiàn)NcMIF缺乏互變異構(gòu)酶和氧化還原酶活性，同時(shí)缺乏與CD74等生物活性劑受體結(jié)合的能力，故推測(cè)NcMIF的功能可能僅限于調(diào)控犬新孢子蟲(chóng)的生命周期，而不調(diào)控宿主與寄生蟲(chóng)之間的相互作用。盡管如此，NcMIF在犬新孢子蟲(chóng)發(fā)病機(jī)理方面的作用仍有待研究。下一步將做深入的比較研究，以闡明MIF的結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致其相應(yīng)功能變化的關(guān)系。

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(編輯：陳希)

FunctionalIdentificationofNeosporacaninumMacrophageMigrationInhibitoryFactorEnzyme

WANG Chang-jiang2，QU Guang-gang1*, JIN Ting-ting2，WU Yue-xing2，LIU Hui3，SHEN Zhi-qiang1,2

(1.ShandongBinzhouAnimalScience&VeterinaryMedicineAcademy,BinzhouShandong256600,China; 2.ShandongLvDuBio-ScienceandTechnologyCo.,LTD,BinzhouShandong256600,China; 3.HuazhongAgricultureUniversity,Wuhan430000,China)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.9.04

2017-06-26

A

1002-1280 (2017) 09-0018-07

S852.7

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2013CQ004)

王長(zhǎng)江，碩士研究生，從事病原源性免疫調(diào)節(jié)因子免疫調(diào)節(jié)功能方面研究。

曲光剛。E-mail：guanggangqu@163.com