魏麗娟，劉 欣，賈 興*，耿志霞，宋婷婷，瞿紅穎，魏占勇，曹興元

(1.河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，石家莊 050041；2.河北省獸藥工程技術(shù)研究中心，石家莊 050041；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083)

豬內(nèi)服和靜脈給予多西環(huán)素的藥代動(dòng)力學(xué)研究

魏麗娟1,2，劉 欣1,2，賈 興1,2*，耿志霞1,2，宋婷婷1,2，瞿紅穎1,2，魏占勇1,2，曹興元3

(1.河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，石家莊 050041；2.河北省獸藥工程技術(shù)研究中心，石家莊 050041；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083)

以10 mg/kg體重的劑量研究豬內(nèi)服鹽酸多西環(huán)素飲水劑的藥動(dòng)學(xué)特征，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，測(cè)定豬內(nèi)服與靜脈給予多西環(huán)素的血漿濃度，Winnolin軟件進(jìn)行分析。豬單次內(nèi)服多西環(huán)素飲水劑型水溶液后，MRTlast為(12.82±3.34) h，T1/2為(11.65±4.80) h，Tmax為(4.13±1.89) h，Cmax為(0.87±0.48) μg/mL，AUClast為(11.07±4.19) μg·h·mL-1。靜脈注射10 mg/kg 體重多西環(huán)素水溶液后，AUClast為(33.34±8.03) μg·h·mL-1，T1/2為(5.68±1.32) h，MRTlast為(7.98±0.56) h。結(jié)果表明多西環(huán)素飲水劑水溶液的絕對(duì)生物利用度為33.2%。豬內(nèi)服多西環(huán)素飲水劑后，具有體內(nèi)吸收速度較快，達(dá)峰時(shí)間短，消除較慢，血中平均滯留時(shí)間較長(zhǎng)等特點(diǎn)。

多西環(huán)素飲水劑；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；藥代動(dòng)力學(xué)；豬

Correspondingauthor:JIAXing,E-mail:jiaxing19881207@163.com

Abstract: The study was designed to investigate the pharmacokinetic characteristics of doxycycline drinking water in swine at a dose of 10 mg/kg bodyweight. The plasma concentration of drug in swine after oral and intravenous administration determined by UPLC-MS/MS and the pharmacokinetics were calulated by Winnolin software. MRTlast=(12.82±3.34) h, T1/2=(11.65±4.80) h, Tmax=(4.13±1.89) h, Cmax=(0.87±0.48) μg/mL, AUClast=(11.07±4.19) μg·h·mL-1. Intravenous injection at a dose of 10 mg/kg body weight of doxycycline aqueons solution, AUClast=(33.34±8.03) μg·h·mL-1, T1/2=(5.68±1.32) h, MRTlast=(7.98±0.56) h.The absolute bioavailability of the doxycycline solution was 33.2%. These results indicated that the doxycycline drinking water after oral in swine was absorbed faster,and had a shorter peak time,slower elimination and longer average blood retention time.

Keywords: doxycycline drinking water；UPLC-MS/MS；pharmacokinetics；swine

多西環(huán)素是一種半合成的四環(huán)素類(lèi)抗生素。其作用機(jī)制為抑制核糖體的蛋白質(zhì)合成，主要是與細(xì)菌核蛋白體的30S小亞基的結(jié)合。多西環(huán)素是一種廣譜抗生素，它對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、需氧菌和厭氧菌均有效，尤其是對(duì)引起豬呼吸系統(tǒng)感染的多殺性巴氏桿菌和豬肺炎支原體有效[1-3]。目前國(guó)內(nèi)外已有鹽酸多西環(huán)素在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究[4-5]，而國(guó)內(nèi)多為對(duì)鹽酸多西環(huán)素注射液的研究[6-7]。本研究對(duì)多西環(huán)素飲水劑進(jìn)行豬的內(nèi)服給藥藥代動(dòng)力學(xué)研究，同時(shí)為獲取該制劑的內(nèi)服給藥后的生物利用度，進(jìn)行了靜脈注射多西環(huán)素的藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，研究結(jié)果將對(duì)多西環(huán)素制劑在臨床上的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品 多西環(huán)素對(duì)照品(130485)，含量85.2%，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；多西環(huán)素飲水劑(規(guī)格：100 g∶50 g，批號(hào)120518)，河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司提供；乙腈、甲酸，色譜純級(jí)；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)，分析純級(jí)。

1.2 儀器設(shè)備 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源，美國(guó)Waters公司)；分析天平(CPA225D，感量0.00001 g，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；天平(JJ500，感量0.01 g，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠)；組織勻漿機(jī)(AM-2，日本Nissei公司)；高速冷凍離心機(jī)(5804R，德國(guó)Eppendorf公司)；渦旋混合器(HQ-60-Ⅱ，北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司)；固相萃取裝置(美國(guó)Waters公司)；氮吹儀(N-Evap112，美國(guó)Organomation Associates公司)；Oasis HLB固相萃取柱(3cc/60 mg，美國(guó)Waters公司)。

1.3 主要試劑 多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)貯備液(1 mg/mL)：準(zhǔn)確稱(chēng)取含10 mg多西環(huán)素的對(duì)照品，于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成濃度為1 mg/mL的多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)貯備液。-20 ℃以下保存，有效期6個(gè)月。

多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)工作液(10、100 μg/mL)：取1 mg/mL多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容，分別配制成濃度為10 μg/mL及100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。-20 ℃以下保存，有效期6個(gè)月。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 健康三元雜交豬16頭(雌雄各半，75 d，海淀區(qū)蘇家坨周春生養(yǎng)豬場(chǎng))，體重30～35 kg，自由飲水，飼喂不含任何藥物的飼料，每天定時(shí)飼喂三次。給藥前飼喂適應(yīng)2周。

1.5 給藥和血樣采集 試驗(yàn)選擇16頭豬，隨機(jī)分成兩組，每組8只，給藥前禁食12 h，并稱(chēng)量體重。8頭豬以10 mg/kg體重劑量經(jīng)口單次給予多西環(huán)素飲水劑水溶液，另外8頭豬以10 mg/kg體重劑量經(jīng)耳緣靜脈注射給予多西環(huán)素水溶液，給藥時(shí)間控制在30 s左右。內(nèi)服給藥后分別在0.16、0.33、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48 h于前腔靜脈采血5 mL，置于肝素化抗凝采血管中，3800 r/min離心10 min，吸取上層血漿放在聚丙烯管中，密封，避光，-80 ℃短時(shí)保存待用。耳緣靜脈給藥后0.08、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24、30 h于前腔靜脈采血5 mL，處理同上。

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 樣品提取 稱(chēng)取試料500 μL，于10 mL離心管中，加入5 mL 0.2 M EDTA-2Na，10000 r/min 2 ℃離心10 min。取上清液備用。

1.6.2 凈化 Oasis HLB固相萃取柱依次用甲醇1 mL和水1 mL活化，取備用液過(guò)柱，再用水1 mL淋洗，用乙腈-水溶液(90-10,V/V)2 mL洗脫。洗脫液35 ℃水浴氮?dú)獯抵列∮?00 μL，加入含0.1%甲酸的水溶液定容至500 μL，渦動(dòng)1 min復(fù)溶，14000 r/min離心10 min，過(guò)濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.6.3 液相色譜條件 色譜柱：BEH C18(50 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm)；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸乙腈溶液；進(jìn)樣量10 μL；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Tab1 Gradient elution program

1.6.4 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。電離電壓：3.0 kV；源溫：100 ℃；霧化溫度：350 ℃；錐孔氣流速：30 L/h；霧化氣流速：600 L/h；測(cè)試藥物定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓、碰撞能量見(jiàn)表2。

表2 多西環(huán)素的定性、定量離子及錐孔電壓、碰撞能量Tab 2 Qualitative,quantitative ion and cone voltage,collision energy of doxycycline

1.7 數(shù)據(jù)分析 采用Winnolin6.3藥代學(xué)軟件中的非房室模型進(jìn)行分析，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法的確證

2.1.1 方法特異性 分析不同來(lái)源的空白血漿樣品，目標(biāo)化合物的保留時(shí)間附近沒(méi)有雜質(zhì)干擾，空白樣品的特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 空白血漿樣品特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 1 The characteristic ion mass chronatogram of blank plasma sample

2.1.2 線性范圍 鹽酸多西環(huán)素血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線在0～5000 μg/L濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，得到的回歸方程為Y=1792.23X+1096.79，相關(guān)系數(shù)r=0.9998(≥0.99)。

2.1.3 準(zhǔn)確度和精密度 本方法在10、100、500 μg/kg添加濃度水平上的回收率范圍為82.4%～108.3%，批內(nèi)變異系數(shù)≤10.9%，批間變異系數(shù)≤5.6%。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

2.1.4 靈敏度 以3倍信噪比為方法的檢測(cè)限，測(cè)得血漿中多西環(huán)素的檢測(cè)限為2 μg/L。以10倍信噪比為方法的定量限，測(cè)得血漿中多西環(huán)素的定量限為10 μg/L。

2.2 血藥濃度及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 豬單次內(nèi)服給予10 mg/kg多西環(huán)素飲水劑水溶液和經(jīng)耳緣靜脈注射10 mg/kg多西環(huán)素水溶液后，血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)分別見(jiàn)表4～表5。內(nèi)服給藥和靜注多西環(huán)素后的藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖2～圖3。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表6所示。

表3 血漿中多西環(huán)素添加回收試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 The results of doxycycline recovery in plasma

表4 豬內(nèi)服給予多西環(huán)素水溶液后隨時(shí)間變化的血藥濃度(ng/mL)(n=8)Tab 4 The time-varying plasma concentration of doxycycline in swine after oral administration(ng/mL)(n=8)

表5 豬靜脈注射多西環(huán)素水溶液后隨時(shí)間變化的血藥濃度(ng/mL)(n=8)Tab 5 The time-varying plasma concentration of doxycycline aqueons solution in swine after intavenous administration(ng/mL)(n=8)

圖2 豬內(nèi)服多西環(huán)素飲水劑后藥-時(shí)曲線Fig 2 The drug plasma concentration-time curve of doxycycline drinking water after oral administration

圖3 豬靜注多西環(huán)素水溶液后藥-時(shí)曲線Fig 3 The drug plasma concentration-time curve of doxycycline aqueous solution in swine after intravenous adminstration

表6 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab 6 Pharmacokinetic parametors

3 討論與小結(jié)

3.1 生物利用度 將內(nèi)服給藥后藥-時(shí)曲線下面積(AUClast)與靜脈注射后藥-時(shí)曲線下面積(AUClast)的平均值進(jìn)行比較，經(jīng)公式F=(Dosei.v./Dosep.o.)×(AUClastp.o./AUClasti.v.) 計(jì)算多西環(huán)素飲水劑水溶液的絕對(duì)生物利用度為33.20%，說(shuō)明多西環(huán)素飲水劑單次內(nèi)服給藥吸收一般。李偉等[8]通過(guò)肌注以20 mg/kg體重給予豬多西環(huán)素注射液，獲得的絕對(duì)生物利用度為52.2%～63.5%，說(shuō)明豬給予多西環(huán)素后絕對(duì)生物利用度均較低。

3.2 藥動(dòng)學(xué)特征 本研究給豬單次內(nèi)服10 mg/kg體重多西環(huán)素飲水劑型水溶液后得到的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)說(shuō)明多西環(huán)素在豬體內(nèi)吸收速度較快，達(dá)峰時(shí)間短，消除較慢，血中平均滯留時(shí)間較長(zhǎng)。國(guó)外K.Baert[9]等研究報(bào)道了75%的多西環(huán)素制劑在豬體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)及生物利用度，健康豬單劑量?jī)?nèi)服多西環(huán)素(10.5 mg/kg)，其藥物動(dòng)力學(xué)特征符合一級(jí)吸收二室開(kāi)放模型，T1/2α為0.77 h，Vd為0.97±0.77 L/kg。T1/2β為2.9 h，Tmax為2.30±1.22 h，Cmax為1.52±0.62 μg/mL，MRT為7.36±2.68 h。翟克影等[10]研究，對(duì)豬單次口服5 mg/kg體重劑量的鹽酸多西環(huán)素后，T1/2β為6.02±0.83 h；Tmax為5.42±0.25 h；Cmax為1.09±0.26 μg/mL?？紤]到本試驗(yàn)結(jié)果相關(guān)參數(shù)的較大變異性和假定多西環(huán)素內(nèi)服給藥在上述劑量中具有線性相關(guān)性，相關(guān)參數(shù)與報(bào)道的參數(shù)類(lèi)似。

本研究給豬靜注10 mg/kg體重多西環(huán)素水溶液后，結(jié)果表明，豬靜脈注射多西環(huán)素后，藥物消除中等。李偉等[8]對(duì)豬以20 mg/kg體重的劑量靜脈給予鹽酸多西環(huán)素注射液，得到的AUC為141.76±20.38 μg·h·mL-1，T1/2β為9.44±2.6 h，與本試驗(yàn)結(jié)果相比，假定多西環(huán)素靜脈給藥存在線性藥動(dòng)學(xué)特征，藥時(shí)曲線下面積與報(bào)道的結(jié)果相比略低，消除半衰期也短于報(bào)道的數(shù)據(jù)，這可能是由于采用制劑、動(dòng)物體重和個(gè)體差異以及數(shù)據(jù)處理方法不同導(dǎo)致的。

鹽酸多西環(huán)素飲水劑相對(duì)于注射劑而言，給藥更方便，既節(jié)省了用藥成本，又減少了頻繁注射造成的應(yīng)激反應(yīng)，在獸藥市場(chǎng)具有廣闊的前景。本試驗(yàn)對(duì)鹽酸多西環(huán)素飲水劑的藥動(dòng)學(xué)特征進(jìn)行研究，以期為其在獸醫(yī)臨床應(yīng)用上提供合理依據(jù)。

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(編輯：侯向輝)

PharmacokineticsofDoxycyclineinSwineafterOralandIntravenousAdministration

WEI Li-juan1,2,LIU Xin1,2,JIA Xing1,2*,GENG Zhi-xia1,2,SONG Ting-ting1,2,QU Hong-ying1,2,WEI Zhan-yong1,2,CAO Xing-yuan3

(1.HebeiYuanzhengPharmaceuticalCo.,Ltd，Shijiazhuang050041,China; 2.HebeiEngineeringResearchCenterofVeterinary，Shijiazhuang050041,China; 3.ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100083,China)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.9.05

魏麗娟，高級(jí)工程師，從事獸藥基礎(chǔ)研究與開(kāi)發(fā)工作。E-mail:yuanchengcheng@sina.com

2017-04-13

A

1002-1280 (2017) 09-0024-06

S859.796