劉豐，周輝，袁泰先（1.咸寧市中醫(yī)醫(yī)院藥房，湖北咸寧437100；.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院/臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016）

·臨床藥學(xué)與研究·

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定人尿液中布洛芬和吲哚美辛的濃度Δ

劉豐1＊，周輝2，袁泰先3#（1.咸寧市中醫(yī)醫(yī)院藥房，湖北咸寧437100；2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院/臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016）

目的：建立同時(shí)測(cè)定人尿液中布洛芬和吲哚美辛濃度的方法。方法：尿液樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白后，采用高效液相色譜法測(cè)定。色譜柱為Discovery C18，流動(dòng)相為乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（85∶15，V/V，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3.5），紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為80 μL。結(jié)果：布洛芬和吲哚美辛的尿藥濃度均在0.1～50.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r分別為0.999 6、0.999 5，n＝3），定量下限均為0.1 μg/mL，最低檢測(cè)限均為0.03 μg/mL；日內(nèi)、日間RSD均小于10%（n＝5），準(zhǔn)確度為94.7%～97.2%；布洛芬和吲哚美辛的提取回收率分別為89.5%～91.8%、90.2%～92.4%（RSD均小于10%，n＝15）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快速，且選擇性、精密度、準(zhǔn)確度良好，適用于人尿液中布洛芬和吲哚美辛濃度的同時(shí)測(cè)定。

高效液相色譜法；布洛芬；吲哚美辛；尿藥濃度

布洛芬（Ibuprofen）和吲哚美辛（Indometacin）均屬于非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥[1]。布洛芬通過(guò)強(qiáng)力抑制前列腺素的合成，發(fā)揮止痛和抗炎作用，臨床上主要用于治療輕中度偏頭痛、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰痛、手術(shù)后外傷及拔牙后的消炎、鎮(zhèn)痛等[2-3]。吲哚美辛也是強(qiáng)效前列腺素合成抑制劑之一，具有顯著的抗炎解熱作用，目前臨床已廣泛應(yīng)用于早產(chǎn)兒動(dòng)脈導(dǎo)管未閉、腎小球腎炎、原發(fā)性直立性低血壓、Batter綜合征、眼科疾患、各種腫瘤發(fā)熱和非特異性低熱等[4-5]。這兩種藥物口服后大部分經(jīng)小腸吸收，在肝臟轉(zhuǎn)化，胃腸道不良反應(yīng)較輕，臨床應(yīng)用廣泛[6-7]。目前，臨床上常將二者合用，治療早產(chǎn)兒動(dòng)脈導(dǎo)管未閉[8]。二者都具有很高的蛋白結(jié)合率，合用時(shí)可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合蛋白；同時(shí)，吲哚美辛與蛋白的結(jié)合較布洛芬更穩(wěn)定，可置換出已與蛋白結(jié)合的布洛芬，從而使后者的血藥濃度升高，增加不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)；此外，二者聯(lián)用還有可能加劇共同存在的不良反應(yīng)，如胃出血、肝損害等[9]。因此，為減少不良反應(yīng)發(fā)生，當(dāng)兩藥聯(lián)用時(shí)有必要對(duì)患者體內(nèi)的藥物濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)[10]。目前，已有多種技術(shù)可用于體內(nèi)藥物監(jiān)測(cè)，也有研究者對(duì)布洛芬和吲哚美辛的測(cè)定方法進(jìn)行了報(bào)道，主要包括高效液相色譜（HPLC）法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法、氣相色譜（GC）法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法、毛細(xì)管電泳法、分光光度法、薄層色譜法（TLC）等，檢測(cè)的樣品以血液、尿液、動(dòng)物組織為主[11-18]。為了進(jìn)一步提高檢測(cè)效率，本研究嘗試建立一種無(wú)創(chuàng)、低成本、高靈敏度、簡(jiǎn)便、快速的同時(shí)測(cè)定尿液中布洛芬和吲哚美辛濃度的方法，以期為其人體藥動(dòng)學(xué)研究提供參考依據(jù)，為臨床個(gè)體化用藥提供技術(shù)支持。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀，配有紫外檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；TDZ4B-WS型低速離心機(jī)（湖南賽特湘儀儀器公司）；MS3型漩渦混合器（廣州艾卡儀器設(shè)備公司）；MTN-2800D型氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器公司）。

1.2 藥品與試劑

布洛芬對(duì)照品（批號(hào)：17905，純度：99.7%）、吲哚美辛對(duì)照品（批號(hào)：17378，純度：99.6%）均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈為色譜純，乙酸銨為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 空白尿液

空白尿液來(lái)源自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院健康體檢者，無(wú)生殖泌尿系統(tǒng)感染且5 d內(nèi)未服用過(guò)任何藥物。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Discovery C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；保護(hù)柱：Agilent Zorbax SB-C18（12.5 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（85∶15，V/V，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3.5）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：80μL；整個(gè)分析流程共10 min。

2.2 溶液的配制

取布洛芬和吲哚美辛對(duì)照品各10 mg，置于10 mL量瓶中，用乙腈溶解并定容，得質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液，置于4℃冰箱中保存。取上述貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，用乙腈定容，得質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，備用。

2.3 尿液樣品的處理

取空白尿液100μL，加入乙腈1 mL，渦旋振蕩2 min，以離心半徑10.5 cm、轉(zhuǎn)速4 200 r/min離心10 min后，取上清液，置于另一試管中，以氮?dú)饬鞔蹈桑瑲堅(jiān)昧鲃?dòng)相200 μL復(fù)溶，渦旋振蕩30 s，混勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液80μL進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專(zhuān)屬性考察 分別取空白尿樣、空白尿樣+布洛芬+吲哚美辛（質(zhì)量濃度均為10 μg/mL）的尿液樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，吲哚美辛和布洛芬的保留時(shí)間分別為7.02 min和8.13 min，而空白尿液在該保留時(shí)間處未見(jiàn)有色譜峰出現(xiàn)，詳見(jiàn)圖1。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及檢測(cè)限與定量限的考察 取空白尿液100 μL，分別加入“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)工作液各適量，配制成相當(dāng)于二者質(zhì)量濃度均為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的混合尿液樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以待測(cè)物質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)、待測(cè)物峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得布洛芬的回歸方程：y布＝56.3c布－9.1（r＝0.999 6，n＝3），吲哚美辛的回歸方程：y吲＝71.9c吲+12.0（r＝0.999 5，n＝3）。結(jié)果表明，布洛芬和吲哚美辛的尿藥濃度均在0.1～50.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按信噪比（S/N）為3測(cè)得兩者的最低檢測(cè)限均為0.03 μg/mL，按S/N為10測(cè)得兩者的定量下限均為0.1 μg/mL。

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取空白尿液100 μL，分別加入“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)工作液各適量，配制成布洛芬和吲哚美辛低、中、高質(zhì)量濃度（均為0.2、10.0和30.00 μg/mL）的混合尿液樣品，各質(zhì)量濃度平行測(cè)定5次，考察其日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5 d，考察其日間精密度；將實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，考察準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，日內(nèi)、日間RSD均小于10%（n＝5），表明精密度良好；準(zhǔn)確度為94.7%～97.2%，表明準(zhǔn)確度良好，符合2015年版《中國(guó)藥典》（四部）“通則”中生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則對(duì)準(zhǔn)確度的要求[19]，詳見(jiàn)表1。

表1 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1 Results of precision and accuracy tests（±s，n＝5）

表1 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1 Results of precision and accuracy tests（±s，n＝5）

待測(cè)物布洛芬吲哚美辛理論質(zhì)量濃度，μg/mL 0．2 10．0 30．0 0．2 10．0 30．0日內(nèi)實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，μg/mL 0．20±0．02 9．52±1．02 28．41±1．74 0．20±0．02 9．72±1．32 29．13±2．26 RSD，%5．7 5．6 5．2 5．4 6．1 6．3日間實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，μg/mL 0．18±0．02 9．35±1．12 28．06±1．81 0．18±0．02 9．37±1．42 29．04±2．47 RSD，%8．5 7．4 7．9 7．9 6．5 7．2準(zhǔn)確度，%95．6 95．2 94．7 96．7 97．2 97．1

2.4.4 提取回收率試驗(yàn) 取空白尿液100 μL，分別加入“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)工作液各適量，配制成布洛芬和吲哚美辛低、中、高質(zhì)量濃度（均為0.2、10.0、30.0 μg/mL）的混合尿液樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析。連續(xù)3 d配制上述各質(zhì)量濃度樣品，每日平行測(cè)定5次，將上述樣品的峰面積與未經(jīng)提取的標(biāo)準(zhǔn)工作液（質(zhì)量濃度與前者對(duì)應(yīng)）的峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算提取回收率。結(jié)果顯示，布洛芬、吲哚美辛的平均提取回收率分別為89.5%～91.8%、90.2%～92.4%（RSD均小于10%，n＝15），詳見(jiàn)表2。

表2 提取回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of extraction recovery tests

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取空白尿液100 μL，分別加入“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)工作液各適量，配制成布洛芬和吲哚美辛低、中、高質(zhì)量濃度（均為0.2、10.0、30.0 μg/mL）的混合尿液樣品各5份。以當(dāng)日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算尿液樣品中2種待測(cè)物的質(zhì)量濃度，分別考察其在室溫、4℃冰箱和－20℃冷凍條件下放置的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在室溫放置2 d、4℃冰箱放置5 d、－20℃冷凍放置15 d后，上述混合尿液樣品中各待測(cè)物的質(zhì)量濃度均超過(guò)理論質(zhì)量濃度的90%，RSD均小于5%（n＝5），表明穩(wěn)定性良好，詳見(jiàn)表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of stability tests

3 討論

布洛芬和吲哚美辛是兩種常見(jiàn)的非甾體抗炎藥，而布洛芬更是世界衛(wèi)生組織、美國(guó)FDA唯一共同推薦的兒童退燒藥，是公認(rèn)的兒童首選抗炎藥[20]。非甾體抗炎藥是全球使用較多的藥物種類(lèi)之一，而布洛芬和吲哚美辛又是非甾體抗炎藥中使用最多的藥物。這兩種藥物的同時(shí)應(yīng)用容易加劇共同不良反應(yīng)的發(fā)生（如胃腸道反應(yīng)加重、肝臟受損等），尤其是在兒童用藥中應(yīng)時(shí)刻保持警惕。因此，監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)布洛芬和吲哚美辛的藥物濃度顯得尤為重要。該類(lèi)藥物的檢測(cè)方法包括HPLC法、LC-MS/MS法、TLC法等，但大部分前處理方法復(fù)雜或僅適用于單一藥物的檢測(cè)[11-18，21]，而同時(shí)檢測(cè)這兩種藥物的報(bào)道較少。

本研究在已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，建立了同時(shí)測(cè)定人尿液中布洛芬和吲哚美辛濃度的HPLC法。與現(xiàn)有方法相比，該法以尿液作為研究對(duì)象，經(jīng)乙腈沉淀蛋白后，進(jìn)樣分析，樣品的前處理方法簡(jiǎn)單，且用量少。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，布洛芬和吲哚美辛在200～250 nm波長(zhǎng)內(nèi)峰形良好[22]，故本研究比較了200、220、250 nm波長(zhǎng)下的檢測(cè)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為200 nm時(shí)，待測(cè)物的響應(yīng)信號(hào)較弱；當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm時(shí)，出現(xiàn)了眾多雜質(zhì)峰，干擾了待測(cè)物的測(cè)定；而當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm時(shí)，2個(gè)待測(cè)物的分離度良好，雜質(zhì)峰不干擾其測(cè)定。因此，最終將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為220 nm。前期試驗(yàn)中，筆者對(duì)流動(dòng)相的構(gòu)成進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相中加入乙酸銨可增強(qiáng)待測(cè)物的離子化效果，且避免了色譜峰的拖尾現(xiàn)象，提高了靈敏度。同時(shí)，還考察了流動(dòng)相不同pH（3.0、3.5、4.0、4.5）對(duì)檢測(cè)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動(dòng)相pH為3.5時(shí)，布洛芬和吲哚美辛的峰形良好，且受尿液中其他物質(zhì)的干擾最小，故最終將流動(dòng)相確定為乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（85∶15，V/V，pH＝3.5）。方法學(xué)考察結(jié)果顯示，在上述色譜條件下，日內(nèi)、日間RSD＜10%，準(zhǔn)確度為94.7%～97.2%，提取回收率為89.5%～92.4%，符合生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的要求[19]。

綜上所述，本法以患者的尿液樣品為檢測(cè)對(duì)象，大大簡(jiǎn)化了樣品的前處理過(guò)程，縮短了檢測(cè)時(shí)間，且具有較好的選擇性、精密度和準(zhǔn)確度，可用于同時(shí)測(cè)定人尿液中布洛芬和吲哚美辛的濃度；同時(shí)，本法也進(jìn)一步為布洛芬和吲哚美辛藥物濃度監(jiān)測(cè)和藥動(dòng)學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)，也為其他非甾體抗炎藥的分析提供了參考。

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Simultaneous Determination of Ibuprofen and Indomethacin in Human Urine by HPLC

LIU Feng1，ZHOU Hui2，YUAN Taixian3（1.Pharmacy，Xianning Hospital of TCM，Hubei Xianning 437100，China；2.School of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；3.School of Laboratory Medicine，Chongqing Medical University/Key Lab of Clinical Laboratory Diagnostics，Ministry of Education，Chongqing 400016，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of ibuprofen and indomethacin concentration in human urine.METHODS：The urine samples were precipitated by acetonitrile.HPLC method was adopted.The determination was performed on Discovery C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-20 mmol/L ammonium acetate solution（85∶15，V/V，pH value adjusted to 3.5 with glacial acetic acid）at the flow rate of 1.0 mL/min.UV detection wavelength was set at 220 nm.The column temperature was room temperature，and sample size was 80 μL.RESULTS：The linear range of ibuprofen and indomethacin were both 0.1-50.0 μg/mL（r＝0.999 6，0.999 5，n＝3）.The limits of quantitation were both 0.1 μg/mL，and the limits of detection were both 0.03 μg/mL.RSDs of inter-day and intra-day were all lower than 10%（n＝5），and accuracy ranged 94.7%-97.2%.The extraction recoveries of ibuprofen and indomethacin were 89.5%-91.8%and 90.2%-92.4%（all RSDs＜10%，n＝15），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple and rapid with high selectivity，sensitivity and accuracy.It is suitable for simultaneous determination of ibuprofen and indomethacin concentration in human urine.

HPLC；Ibuprofen；Indomethacin；Urine concentration

R969.3

A

1001-0408（2017）26-3631-04

2017-03-03

2017-07-09）

（編輯：張?jiān)拢?/p>

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.26.09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.21672031）

＊主管藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：0715-8897019。E-mail：liufeng12345000@163.com

#通信作者：高級(jí)實(shí)驗(yàn)師。研究方向：生物分析化學(xué)。電話：023-68485006。E-mail：514387405@qq.com