吳冰珊，黃枝妙，歐劍鳴，齊孝旗，黃業(yè)偉，翁育偉

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.010

諾如病毒新重組株GII.P16/ GII.2引起福建省2016年冬季病毒性胃腸炎暴發(fā)

吳冰珊1,2，黃枝妙1，歐劍鳴1，齊孝旗1，黃業(yè)偉3，翁育偉1,2

目的本文旨在鑒定福建省2016年冬季導致病毒性胃腸炎暴發(fā)的病原體，并對病原體進行分子特征研究。方法對疫情暴發(fā)地上送的福建省2016年胃腸炎暴發(fā)急性病例標本，采用熒光PCR初步判定病原體，常規(guī)RT-PCR檢測諾如病毒RNA聚合酶和衣殼蛋白基因片段，并進行序列測定和分子特征分析。結(jié)果在3起暴發(fā)疫情中18份標本經(jīng)熒光PCR檢測均為諾如病毒核酸陽性，其中15份標本RT-PCR檢測判為GII型諾如病毒，9份標本成功測序。分析測序結(jié)果，證實引起本輪疫情為諾如病毒新重組株，該重組株有別于本地散發(fā)流行及全球暴發(fā)流行的優(yōu)勢基因型GII.4。毒株RNA聚合酶核苷酸序列與2016年日本的GII.4悉尼變異株Kawasaki194毒株的同源性最高，達98%，為GII.P16亞型；衣殼蛋白核苷酸序列與2008 年比利時的IPH2161-08VG06毒株同源性最高(97.7%～98.8%)，為GII.2亞型。結(jié)論這是福建省首次報道諾如病毒重組株GII.P16/ GII.2的檢出，并引起病毒性胃腸炎暴發(fā)。

病毒性胃腸炎；暴發(fā)；諾如病毒；GII.P16/ GII.2；分子特征

Supported by the National High Technology Research and Development project (No. 2011AA02A114) Corresponding author: Wen Yu-wei, Email: wengywfjcdc@aliyun.com

諾如病毒 (Norovirus, NV)自1968年被發(fā)現(xiàn)以來，已成為引起人類急性非細菌性胃腸炎流行和暴發(fā)的主要病原，容易引起學校、養(yǎng)老院、醫(yī)院及郵輪等環(huán)境的疫情集中暴發(fā)，病毒感染力強，主要是通過污染的水、食物和環(huán)境直接或間接造成人傳人感染。福建省地處我國東南沿海，橫跨中亞熱帶和南亞熱帶兩個自然地理帶，屬亞熱帶濕潤季風氣候，全省共有9個設區(qū)市。2006年我省首次出現(xiàn)諾如病毒暴發(fā)[1]，之后全省各地發(fā)生多次暴發(fā)，引起業(yè)內(nèi)和社會的關注。2016年12月廈門、永泰及漳州三所學校相繼發(fā)生疑似病毒引起的胃腸炎暴發(fā)事件，綜合流行病學調(diào)查、臨床表現(xiàn)及實驗室檢測結(jié)果，證實這3起事件為諾如病毒重組株引起的感染事件。本文擬通過對陽性標本進行分析，并與本省散發(fā)流行的諾如病毒地方株及相關序列進行比對，以探討該重組株的分子特征。

1 材料和方法

1.1 材料 2016年冬季福建省多地市相繼發(fā)生多起疑似病毒性腹瀉暴發(fā)疫情，其中3起疫情暴發(fā)地所在市疾控中心共送檢18份標本，包括漳州某幼兒園學生病例2份肛拭子、1份嘔吐物、1份糞便；永泰某小學5份發(fā)病學生肛拭子、1份糞便；廈門某幼兒園8份發(fā)病學生肛拭子。送檢標本均以生理鹽水處理成10%懸液，高速離心后取上清液檢測。

1.2 暴發(fā)定義 2015年中國疾病預防控制中心下發(fā)的《諾如病毒感染暴發(fā)調(diào)查和預防控制技術指南》規(guī)定，病毒性腹瀉暴發(fā)是指7 d內(nèi)同一學校、托幼機構(gòu)、醫(yī)療機構(gòu)、養(yǎng)老院、工廠、建筑工地、游輪、社區(qū)/村莊等集體單位或場所，發(fā)生20例及以上有流行病學關聯(lián)的諾如病毒感染病例，其中至少2例是實驗室診斷病例。

1.3 主要試劑 病毒核酸提取試劑盒購自天隆公司，諾如病毒核酸熒光檢測試劑盒購自上海之江和江蘇碩世公司，膠回收純化試劑盒購自QIAGEN公司，逆轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen公司，Taq DNA聚合酶購自Takara公司，引物序列由鉑尚公司合成，其他試劑均為分析純試劑。

1.4 實驗室方法

1.4.1 病毒RNA提取 取離心后的懸液上清200 μL，按照天隆公司的病毒核酸提取試劑盒說明書操作，NP968-S全自動病毒核酸提取儀提取病毒核酸，吸取核酸置于1.5 mL的離心管，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 諾如病毒的檢測 按照商品試劑盒說明書采用熒光RT-PCR檢測諾如病毒核酸。采用逆轉(zhuǎn)錄、多重PCR擴增杯狀病毒RNA多聚酶(RdRp)/衣殼蛋白基因片段，引物組合可同時鑒定諾如病毒(I型和II型)和扎如病毒[2]，目的片段分別為330 bp、380 bp和435 bp，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4.3 基因片段序列測定 為對諾如病毒進行基因亞型鑒定，采用JV12[3]/G2SKR引物對擴增諾如病毒多聚酶/衣殼蛋白基因片段，產(chǎn)物片段為1 110 bp。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性產(chǎn)物膠回收純化后送鉑尚公司測序。

1.4.4 序列分析 采用DNAstar軟件對擴增產(chǎn)物核苷酸測序結(jié)果進行編輯、推導相應的氨基酸序列，選擇本省散發(fā)流行地方株及GenBank中收錄的參考毒株序列進行分析，分別針對諾如病毒RNA聚合酶3′端780 bp和衣殼蛋白5′端250 bp核苷酸序列，采用Mega 6.06版本構(gòu)建進化樹，選擇鄰位相連法(Neighbor joining，NJ)，bootstrap值設置為1 000次，核酸替代模型Kimura 2-parameter+G，比較序列同源性，分析毒株系統(tǒng)進化特征。

1.4.5 重組分析 采用Simplot軟件分析毒株重組位點，采用200 bp的滑動窗口， 20 bp的滑動步伐。

2 結(jié) 果

2.1 流行概況 2016年12月福建省廈門市某幼兒園、漳州市某幼兒園、永泰縣某小學分別發(fā) 生病毒胃腸炎暴發(fā)，發(fā)病例數(shù)共計53例(廈門11例、漳州21例、永泰21例)，病例年齡組較小(4～6歲)。發(fā)病時間均在48 h內(nèi)，臨床表現(xiàn)以嘔吐為主及不同程度的腹瀉和腹痛。這3起暴發(fā)疫情均發(fā)生于學校，傳播方式為人傳人，發(fā)病人群年齡距離較小，癥狀較輕以嘔吐為主，無重癥和死亡病例。由于疫情早期迅速采取干預措施，暴發(fā)局限于小范圍的人群，未造成大面積擴散。綜合流行病學調(diào)查和實驗室檢測結(jié)果認為這3起疫情均排除食源性和水源性傳播的可能性，判定為諾如病毒感染引起的人傳人聚集性/暴發(fā)事件。

2.2 諾如病毒檢測 送檢的18份標本經(jīng)熒光PCR檢測均含GII型諾如病毒核酸；采用杯狀病毒特異分型引物進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，15份標本在380 bp處有特異條帶，判定為諾如病毒GII型(表1)。

2.3 序列測定 對陽性標本核苷酸進行測序，有9份成功測序， NCBI在線提交測序結(jié)果進行同源性比對搜索，結(jié)果表明為諾如病毒核苷酸序列片段。

2.4 序列分析結(jié)果 在線軟件(http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool)證實[4]本輪暴發(fā)毒株為諾如病毒重組株GII.P16/GII.2，毒株間序列高度同源，相似性介于96.9%～100%暴發(fā)毒株的RNA聚合酶核苷酸序列與2016年日本的GII.4悉尼變異株Kawasaki194毒株的同源性最高，達98%，屬GII.P16；而衣殼蛋白與2008 年比利時IPH2161-08VG06毒株同源性最高(97.7%-98.8%)，屬GII.2。比對分析本輪暴發(fā)毒株與我省散發(fā)流行毒株，我省流行的諾如病毒以GII型為主(圖1-2)。2016年哨點監(jiān)測結(jié)果表明福建省諾如病毒散發(fā)毒株主要為GII.4、GII.6和 GII.3，仍以2012 Sydney變異株GII.Pe/GII.4為優(yōu)勢流行型別，并檢測到GII.17型，未檢測到GII.2型。采用Simplot軟件分析毒株重組位點，位于ORF1/ORF2交界處735-737bp處(圖3)。

表1 暴發(fā)性胃腸炎標本諾如病毒檢測結(jié)果
Tab.1 Detection results of norovirus collected from viral gastroenteritis outbreaks

來源source送檢數(shù)量number送檢發(fā)生時間dateofinspection熒光PCR檢測結(jié)果resultsofrealtimeRT-PCRRT-PCR檢測結(jié)果resultsofRT-PCR廈門Xiamen82017-1-68/8NVGII(+)7/8NVGII(+)漳州Zhangzhou42016-12-274/4NVGII(+)4/4NVGII(+)永泰Yongtai62016-12-306/6NVGII(+)4/6NVGII(+)

●Outbreak strains of norovirus in 2016;▼ Sporadic strains of norovirus in 2016圖1 諾如病毒衣殼蛋白核苷酸片段進化分析(250 bp)Fig.1 Phylogenetic analyses based on partial VP1 genes of norovirus (250 bp)

●Outbreak strains of norovirus in 2016;▼ Sporadic strains of norovirus in 2016圖2 諾如病毒RNA聚合酶核苷酸片段進化分析(780 bp)Fig.2 Phylogenetic analyses based on partial RNA polymerase genes of norovirus (780 bp)

圖3 Simplot 分析2016年諾如病毒GII.P16/GII.2重組株Fig.3 Simplot analyses of the NoV recombinant GII.P16/GII.2 detected in 2016

3 討 論

根據(jù)衣殼蛋白區(qū)序列差異，諾如病毒分為 7個基因組(GI ～ GVII)，各基因組可細分為不同的基因型[5]，造成人類感染的主要是基因組I和II (GI和GII)，全球約50%急性胃腸炎暴發(fā)是由感染諾如病毒引起的[6]。諾如病毒變異率極高，每隔2～3年出現(xiàn)新的變異/重組株，人群普遍缺少對新變異株的免疫能力，導致新變異株極易引起急性胃腸炎暴發(fā)。既往福建省從未在散發(fā)或暴發(fā)病例中檢測到諾如病毒GII.P16/GII.2，這是福建省首次檢測到諾如病毒GII.P16/GII.2，也是首次證實由GII.P16/GII.2引起的病毒性腹瀉暴發(fā)疫情。在這次暴發(fā)中，疫情均發(fā)生在學校，傳播方式為人傳人，易感人群年齡距離較小，癥狀較輕以嘔吐為主，無重癥和死亡病例。由于及時采取控制措施，未造成大范圍的擴散，認為疫情流行特征和GII.4引起的暴發(fā)相類似，提示這兩個型別的病毒感染特征基本一致，諾如病毒GII.P16/GII.2具有在局部人群的傳播流行能力。

與流感病毒相類似，不同基因亞型的諾如病毒可同時感染同一個宿主；另一方面諾如病毒復制過程中存在亞基因組的產(chǎn)生，因此不同型別的病毒容易在ORF1/ORF2 重疊交界區(qū)發(fā)生型間或型內(nèi)重組，自然環(huán)境下可檢測到不同G/P組合的毒株，重組株的產(chǎn)生是諾如病毒進化的主要機制之一[7-8]。諾如病毒GII. P16在自然流行過程不斷發(fā)生進化，近年來重組株不斷被發(fā)現(xiàn)。目前已檢測到的組合包括GIIP.16/GII.16.和GII.P16/GII.2、GII.P16/GII.3、GII.P16/GII.13、及新近發(fā)現(xiàn)的GII.P16/GII.4重組株。2011年孟加拉在一名嬰兒檢出GII.P16/ GII.3[9]，2010-2011年GII.P16/GII.3在巴西造成4起暴發(fā)[10]，隨后西班牙也報道了GII.P16/GII.3的檢出[11]，2010年歐洲首先在意大利發(fā)現(xiàn)GII.P16/GII.13[12]。2016年日本在1起暴發(fā)中首次檢出9株GII.P16/GII.4_Sydney2012新重組株[13]，并對基因組進行全長測序。GII.P16/GII.4毒株的出現(xiàn)改變GII.Pe/GII.4_Sydney2012在日本的流行狀況。

2009-2010年諾如病毒引起日本胃腸炎暴發(fā)，其中 GII.2亞型占44.6%，首次報道GII.P16/GII.2引起的暴發(fā)[14]。引起福建省本輪暴發(fā)的諾如病毒GII.P16/GII.2的RdRp序列與新重組株Kawasaki194毒株(GII.P16/GII.4)的同源性最高，提示諾如病毒GII.P16型RdRp節(jié)段已進化能結(jié)合更多型別的衣殼蛋白。根據(jù)目前文獻報道，造成全球范圍病毒性腹瀉暴發(fā)的主要型別為GII.4，并非GII.P16/GII.2諾如病毒。GII.P16/GII.2引起散發(fā)病毒胃腸炎感染所占比例也甚低，世界各地對該型諾如病毒認識有限，尚未徹底掌握病毒傳染性、致病力及致病機制等病原體特征。GenBank中收錄的GII.P16/GII.2參考毒株序列不夠多，不足以從系統(tǒng)發(fā)生樹分析的角度對新出現(xiàn)的變異株的來源進行更為細致的溯源分析。本實驗室監(jiān)測資料結(jié)果顯示，截至2016年尚未在福州地區(qū)5歲以下散發(fā)腹瀉兒童檢出GII.P16/GII.2諾如病毒。由于病毒性腹瀉日常監(jiān)測地理范圍僅局限于福州地區(qū)，本次暴發(fā)諾如病毒GII.P16/GII.2的地理范圍超出監(jiān)測區(qū)，不排除福州以外的人群存在GII.P16/GII.2散發(fā)感染。

2014年12月長沙市某廠區(qū)暴發(fā)了一起由新型諾如病毒GII.P17/GII.17引起的急性胃腸炎疫情[15]，本研究也提示福建省內(nèi)不僅存在多種型別的諾如病毒同時流行，并且新型諾如病毒不斷出現(xiàn)引起暴發(fā)，因此在監(jiān)測工作中應同時開展諾如病毒的RdRp和衣殼蛋白檢測，以期及時發(fā)現(xiàn)新的毒株。為明確諾如病毒GII.P16/GII.2在本省的流行消長情況，長期監(jiān)測、擴大監(jiān)測對象包括地區(qū)與全人群監(jiān)測是必須的。

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ViralgastroenteritisoutbreaksassociatedwithnewrecombinantstrainGII.P16/GII.2ofnorovirusinFujian,2016

WU Bing-shan1,2, HUANG Zhi-miao1, OU Jian-ming1, QI Xiao-qi1, HUANG Ye-wei3, WENG Yu-wei1,2

(1.FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China; 2.FujianKeyLaboratoryofZoonoses,Fuzhou350001,China; 3.PublicHealthSchoolofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

We delineated the molecular characteristic of recombinant strain GII.P16/GII.2 of norovirus associated with acute viral gastroenteritis outbreaks in Fujian Province in winter of 2016. Norovirus were detected in specimens of patients collected from the gastroenteritis outbreaks by real-time reverse transcription-PCR and reverse transcription-PCR (RT-PCR). The PCR products of the positive samples were purified, and partial RNA dependent RNA polymerase (RdRp) gene and partial capsid gene were sequenced. The sequences were analyzed using bioinformatics software and online database,and phylogenetic tree were also constructed. Norovirus were detected in all 18 stools. Analysis of 9 positive sequences indicated an emergence of norovirus GII. P16/ GII.2 and confirmed being the cause of gastroenteritis outbreaks. All the strains shared homology of 98% with strains of Kawasaki 194 of Japan detected in 2016 and 97.7%-98.8% with IPH2161-08VG06 of Belgium detected in 2008, RdRp and capsid separately. These outbreak strains showed some degree of differences from the predominant strain, 2012 Sydney GII.4 variant. This is the first time to have found norovirus GII.P16/ GII.2 causing viral gastroenteritis outbreaks in Fujian. More in-depth analysis of the Norovirus GII.P16/ GII.2 could be useful to optimize preventative strategies and develop new and more effective therapeutic measure.

viral gastroenteritis; outbreaks; norovirus; GII.P16/GII.2; molecular characteristic

翁育偉，Email：wengywfjcdc@aliyun.com

1.福建省疾病預防控制中心，福州 350001； 2.福建省疾病預防控制中心人獸共患病重點實驗室，福州 350001； 3.福建醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，福州 350001

R373.2

：A

：1002-2694(2017)09-0805-04

2017-02-28編輯：劉岱偉

國家高技術研究發(fā)展計劃(2011AA02A114)