吳鳳禮，彭彥峰，徐毅誠，曹 鵬，陳五九，王欽宏

(中國科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308)

代謝工程改造微生物生產(chǎn)芳香族化合物的研究進展

吳鳳禮，彭彥峰，徐毅誠，曹 鵬，陳五九，王欽宏

(中國科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308)

芳香族化合物廣泛應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)。利用代謝工程改造微生物生產(chǎn)各種芳香族化合物越來越受到人們的關(guān)注。通過理性改造，微生物可以定向地大量積累人們需要的各種芳香族化合物。此外，通過設(shè)計新的反應(yīng)途徑并引入外源基因，可以拓寬微生物生物合成的產(chǎn)物譜，獲得某些具有重要應(yīng)用價值的新的芳香族化合物。這些研究成果對解決化石能源危機和環(huán)境可持續(xù)發(fā)展問題具有積極意義。本文中，筆者主要對近年來微生物生產(chǎn)各種芳香族化合物的最新研究進展及相應(yīng)的代謝工程改造策略進行綜述，為開展相關(guān)研究提供參考。

合成生物學(xué);代謝工程;莽草酸途徑;芳香族化合物;微生物發(fā)酵

芳香族化合物(aromatic chemicals)廣泛用于醫(yī)藥、化工、食品和飼料等領(lǐng)域，其主要來自化石能源產(chǎn)物“三苯”的衍生轉(zhuǎn)化。近年來，隨著化石能源儲量的減少、人類生存環(huán)境的逐漸惡化和人們環(huán)境保護意識的增強，使得利用生物合成技術(shù)，構(gòu)建綠色高效的細胞工廠生產(chǎn)目標芳香族化合物的替代合成途徑逐漸成為合成生物學(xué)研究的熱點和前沿。改良的微生物細胞工廠利用葡萄糖、甘油等可再生生物質(zhì)資源，在合適的營養(yǎng)、溫度、pH和溶氧等發(fā)酵培養(yǎng)條件下，大量積累目標芳香族化合物，然后通過分離純化獲得目的產(chǎn)物。

莽草酸途徑(shikimate pathway)是生物體合成芳香族化合物的基礎(chǔ)，是一種廣泛存在于植物、藻類、真菌和細菌等生命體中的生物合成途徑［1］。但是，芳香族化合物在生物體中的含量較低，難以滿足生產(chǎn)需求。通過代謝工程手段，對微生物中心代謝途徑和莽草酸途徑進行優(yōu)化，同時導(dǎo)入外源所需生化反應(yīng)酶的編碼基因，使微生物具有更強的積累芳香族化合物的能力。近些年來，通過微生物代謝工程方法生產(chǎn)芳香族化合物的研究取得了較大進展，獲得了一系列積累各種芳香族化合物的基因工程菌［1-3］，這些研究為今后的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用奠定了良好的工作基礎(chǔ)。本文中，筆者主要對近年來微生物生產(chǎn)各種芳香族化合物的最新研究進展及相應(yīng)的代謝工程改造策略進行綜述，以期為開展工業(yè)菌種的優(yōu)化改造研究提供參考。

圖1 莽草酸途徑代謝流程Fig.1 Schematic diagram of shikimate pathway

1 莽草酸途徑

莽草酸途徑由7個酶催化反應(yīng)步驟組成(圖1)，將糖酵解途徑(glycolytic pathway或EMP)產(chǎn)生的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway)產(chǎn)生的赤蘚糖-4-磷酸(E4P)縮合生成 3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)，DAHP再經(jīng)過6步催化反應(yīng)生成分支酸(chorismate)［1］。在分支酸之后，反應(yīng)分為兩條途徑，一條途徑轉(zhuǎn)化為L-苯丙氨酸(L-Phe)或L-酪氨酸(L-Tyr)，另一條生成 L-色氨酸(L-Trp)［4-5］。莽草酸途徑的重要功能是為微生物細胞內(nèi)芳香族氨基酸的生物合成提供必需的前體物質(zhì)。莽草酸途徑中間產(chǎn)物(如，3-脫氫莽草酸和分支酸等)以及L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸在相關(guān)酶的作用下可以進一步衍生為其他芳香族化合物［3-4，6］。

莽草酸途徑是微生物合成芳香族化合物的主要途徑。因此，構(gòu)建高產(chǎn)莽草酸途徑中間代謝產(chǎn)物的工程菌株可以為芳香族化合物的生物合成提供良好的底盤細胞。Li等［7］以缺失aroE的大腸桿菌(Escherichia coli)AB2834菌株作為出發(fā)菌株，通過紫外誘變獲得 aroFFBR突變體(FBR：feedbackinhibition resistant)，解除了DAHP合成酶的酪氨酸反饋抑制;在染色體serA位點插入aroB，加快DAHP向DHQ的轉(zhuǎn)變速率;通過質(zhì)粒同時引入aroFFBR、serA和tktA這3個基因，最終菌株以葡萄糖為碳源進行分批補料發(fā)酵48 h，在上清液中積累69 g/L的3-脫氫莽草酸。筆者所在課題組正通過對E．coli進行染色體改造的方式，在染色體上過表達aroFFBR、tktA，弱化 aroE、pykA、pykA 和 pgi，敲除 tyrR，用GalP/Glk葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)替換葡萄糖轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)運(PTS)系統(tǒng)，最終菌株不含任何質(zhì)粒且遺傳特性穩(wěn)定，利用葡萄糖進行分批補料發(fā)酵52 h積累94．4 g/L的3-脫氫莽草酸(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。Kogure等［8］以谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)ACX-araE菌株作為出發(fā)菌株，通過敲除莽草酸激酶基因aroK，葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)基因pts和代謝副產(chǎn)物編碼基因qsuB、qsuD、hdpA和ldhA，在染色體上過表達非PTS葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)相關(guān)基因iolT1、glk和ppgk以及前體物質(zhì)合成基因tkt、tal和gapA，通過質(zhì)粒過表達莽草酸途徑基因 aroGFBR、aroB、aroD和aroE，最終獲得莽草酸高產(chǎn)菌株，該菌株利用葡萄糖進行分批補料發(fā)酵48 h積累141 g/L的莽草酸。在上述底盤細胞的基礎(chǔ)上，通過進一步的代謝工程改造，可以快捷地獲得高產(chǎn)目標芳香族化合物的微生物細胞工廠。

2 莽草酸途徑芳香族化合物的生物合成

3-脫氫莽草酸和分支酸是莽草酸途徑中的重要代謝產(chǎn)物。這兩種物質(zhì)可以直接在相關(guān)生物酶的催化作用下生成相應(yīng)的芳香族化合物(圖2，表1)，從而避開過長的芳香族氨基酸合成途徑。

2.1 3-脫氫莽草酸衍生物

3-脫氫莽草酸在3-脫氫莽草酸脫水酶(AroZ)作用下轉(zhuǎn)化為原兒茶酸(protocatechuic acid)，原兒茶酸在原兒茶酸脫羧酶(AroY)作用下生成兒茶酚(catechol)，兒茶酚在兒茶酚1，2-雙氧化酶(CatA)作用下生成順，順-粘康酸(cis，cis-muconic acid)(圖2)，順，順-粘康酸是合成高值化學(xué)品——己二酸的前體物質(zhì)。Niu等［9］在E．coli染色體上整合2個拷貝的aroZ，并通過質(zhì)粒過表達aroY、catA和aroFFBR，最終菌株WN1/pWN2．248以葡萄糖為碳源通過分批補料發(fā)酵48 h產(chǎn)生36．8 g/L順，順-粘康酸，摩爾轉(zhuǎn)化率達到22%。Curran等［10］將帶有密碼子優(yōu)化過的aroZ、aroY和catA 3個基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，同時敲除aro3和zwf1，過表達aro4K229I和tkl，最終菌株僅僅產(chǎn)生141 mg/L的順，順-粘康酸，產(chǎn)量遠遠低于E．coli工程菌。

3-脫氫莽草酸可以通過兩條途徑轉(zhuǎn)化為沒食子酸(gallic acid)，一條途徑通過莽草酸脫氫酶(SDH，AroE的同工酶)作用生成沒食子酸，另一條通過3-脫氫莽草酸脫水酶作用生成原兒茶酸，然后在對-羥基苯甲酸羥化酶突變體(pobAY385F)催化作用下生成沒食子酸(圖 2)［11-12］。Kambourakis 等［11］在 E．coli KL7菌株中以質(zhì)粒的形式過表達 pobAY385F和aroFFBR，獲得 E．coli KL7/pSK6．161 菌株，該菌株在葡萄糖和氮源豐富的培養(yǎng)基中通過分批補料發(fā)酵48 h產(chǎn)生20 g/L沒食子酸。在微生物細胞內(nèi)，莽草酸脫氫酶更傾向于催化3-脫氫莽草酸生成莽草酸的反應(yīng);體外檢測該酶的酶活力較低，并且只在弱堿性條件下才有利于合成沒食子酸［13］。

2.2 分支酸衍生物

莽草酸途徑的代謝終產(chǎn)物分支酸可以在不同生物酶的催化作用下衍生為相應(yīng)的芳香族化合物，如對氨基苯甲酸(para-aminobenzoate)、對羥基苯甲酸(para-hydroxybenzoic acid)、兒茶酚和水楊酸(salicylic acid)等等。分支酸先后在氨基脫氧分支酸合酶復(fù)合體(PabAB)和氨基脫氧分支酸裂解酶(PabC)作用下生成對氨基苯甲酸(圖2)。Kubota等［14］在 C．glutamicum 染色體上過表達 E．coli莽草酸途徑的6個aro基因和aroGFBR，敲除ldhA，通過質(zhì)粒過表達pabAB和pabC，最終菌株ABA239以葡萄糖為碳源進行分批補料發(fā)酵48 h產(chǎn)生43 g/L的對氨基苯甲酸，轉(zhuǎn)化率達到 20%。Averesch等［15］在S．cerevisiae中采用相似的改造策略，通過質(zhì)粒過表達葡萄酒酵母的氨基脫氧分支酸合酶基因ABZ1和氨基脫氧分支酸裂解酶基因ABZ2，最終菌株在甘油-乙醇混合碳源條件下進行分批補料發(fā)酵105 h積累215 mg/L的對氨基苯甲酸，碳源轉(zhuǎn)化率為2．64%。此外，Satoh等［16］通過功能互補的方式發(fā)現(xiàn)在阻斷分支酸合成的E．coli△pabABC△aroB菌株中表達Nitrosomonas europaea中的NE1434基因或Chlamydia trachomatis的CT610基因，仍然能夠生成對氨基苯甲酸，表明這兩個基因編碼的酶的作用底物不是分支酸，但是作者并未找到該酶的作用底物。

圖2 3-脫氫莽草酸和分支酸芳香族衍生物的生物合成途徑Fig.2 Biosynthetic pathways of 3-dehydroshikimate and chorismate derivatives

分支酸在分支酸裂解酶(UbiC)作用下生成對羥基苯甲酸(圖2)。Barker等［17］在過表達莽草酸途徑相關(guān)基因的E．coli中，通過質(zhì)粒過表達ubiC，目標菌株以葡萄糖為碳源通過分批補料發(fā)酵72 h產(chǎn)生12 g/L的對羥基苯甲酸，摩爾轉(zhuǎn)化率達到13%。Yu等［18］將含有 ubiC和aroGD146N的表達載體轉(zhuǎn)入Pseudomonas putida KT2440，同時敲除 pobA、pheA、trpE和hexR，通過分批補料發(fā)酵，對羥基苯甲酸的最高產(chǎn)量達到1．73 g/L。在S．cerevisiae中通過質(zhì)粒過表達ubiC，通過分批補料發(fā)酵，對羥基苯甲酸產(chǎn)量達到 2．9 g/L［19］。

據(jù)報道，由分支酸生成兒茶酚有4條合成途徑，而兒茶酚是合成順，順-粘康酸的底物(圖2)。下面列舉了由4條不同的途徑均實現(xiàn)了由分支酸到兒茶酚生物合成。1)Sengupta等［20］在E．coli中通過質(zhì)粒過表達外源的順，順-粘康酸合成基因pobA、aroY和catA，通過另一個載體過表達內(nèi)源的ubiC、aroFFBR、aroE 和 aroL，同時敲除 ptsH、ptsI、crr和 pykF，最終菌株通過搖瓶發(fā)酵72 h產(chǎn)生170 mg/L的順，順-粘康酸。2)Noda 等［2］在 高 產(chǎn) L-苯 丙 氨 酸 的 E．coli ATCC31882菌株中通過質(zhì)粒過表達外源的menF，用Galp/Glk系統(tǒng)替換本身的PTS系統(tǒng)，敲除競爭性途徑基因pheA和tyrA，獲得CF51菌株通過分批補料發(fā)酵48 h產(chǎn)生11．5 g/L的水楊酸;然后在CF51菌株中通過質(zhì)粒過表達nahG和catA，最終菌株CFT511通過搖瓶發(fā)酵96 h產(chǎn)生約3．1 g/L的順，順-粘康酸。3)Wang等［21］在E．coli中通過質(zhì)粒過表達外源的entC、entA、entB、entX和catA，并對莽草酸途徑基因進行改造，最終菌株通過搖瓶發(fā)酵48 h產(chǎn)生約605．18 mg/L的順，順-粘康酸。4)Balderas-Hernandez等［22］在高產(chǎn)鄰氨基苯甲酸的E．coli中通過質(zhì)粒過量表達鄰氨基苯甲酸1，2-雙加氧酶復(fù)合體基因antABC、aroGFBR和tktA，最終菌株以葡萄糖為碳源進行分批補料發(fā)酵72 h產(chǎn)生4．47 g/L兒茶酚。這些研究表明微生物可以利用莽草酸途徑的代謝產(chǎn)物直接合成芳香族化合物，避開后續(xù)的氨基酸合成途徑過長的催化反應(yīng)步驟，從而提高生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率。

圖3 芳香族氨基酸生物合成途徑Fig.3 Biosynthetic pathways of aromatic amino acids

3 苯丙氨酸及其衍生物的生物合成

分支酸在分支酸變位酶作用下生成預(yù)苯酸，預(yù)苯酸經(jīng)預(yù)苯酸脫水酶催化生成苯丙酮酸，苯丙酮酸經(jīng)氨基酸轉(zhuǎn)氨酶催化得到L-苯丙氨酸(圖3)。L-苯丙氨酸是人體必需氨基酸之一，作為重要的原材料被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域。L-苯丙氨酸和其前體物質(zhì)苯丙酮酸在不同生物酶的作用下可以生成多種芳香族衍生物(圖4，表1)。因此，構(gòu)建高產(chǎn)L-苯丙氨酸的底盤細胞是生產(chǎn)苯丙氨酸衍生物需要解決的首要問題。

3.1 苯丙氨酸的生物合成

微生物發(fā)酵法逐漸成為L-苯丙氨酸的主流生產(chǎn)工藝，而微生物發(fā)酵法離不開高效的細胞工廠。構(gòu)建L-苯丙氨酸高產(chǎn)菌株需要提高中心代謝途徑碳流量，消除代謝產(chǎn)物抑制和代謝副產(chǎn)物積累。Zhou等［23］在對 β-2-噻吩丙氨酸具有抗性的 E．coli K12菌株中通過質(zhì)粒過表達 pheAFBR和aroF，獲得WSH-Z06(pAP-B03)菌株，該菌株通過分批補料發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生35．38 g/L L-苯丙氨酸。噬菌體污染是微生物發(fā)酵過程中遇到的非常棘手的問題。Zhou等［24］對 E．coli WSH-Z06(pAP-B03)菌株進行亞硝基胍(NTG)誘變，獲得對噬菌體BP-1具有顯著抗性的菌株BR-42，并對分批補料發(fā)酵條件進行優(yōu)化，最終菌株L-苯丙氨酸的產(chǎn)量達57．63 g/L。高產(chǎn)L-苯丙氨酸菌株可以作為構(gòu)建L-苯丙氨酸衍生物基因工程菌的底盤細胞。

3.2 苯丙氨酸衍生物的生物合成

苯丙酮酸和L-苯丙氨酸可以衍生為多種芳香族化合物，例如肉桂酸(cinnamic acid)、肉桂醛(cinnamaldehyde)、肉桂醇(cinnamyl alcohol)、苯乙烯(styrene)、苯乳酸(phenyllactic acid)、苯乙醇(2-phenylethanol)、苯乙酸(2-phenylacetic acid)、扁桃酸(mandelate)、D/L-苯甘氨酸(D/L-phenylglycine)和D-苯丙氨酸(D-phenylalanine)等(圖 4，表 1)，這些芳香族化合物具有重要的應(yīng)用價值。

L-苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)作用下生成肉桂酸，肉桂酸可進一步轉(zhuǎn)化為肉桂醛、肉桂醇和苯乙烯(圖4)。肉桂酸、肉桂醇和肉桂醛廣泛應(yīng)用于食品、香料及有機合成等領(lǐng)域。Bang等［25］在構(gòu)建的 L-苯丙氨酸高產(chǎn) E．coli菌株中轉(zhuǎn)入含有SmPAL、ScCCL和AtCCR這3個外源基因的高拷貝質(zhì)粒，工程菌YHP05(pHB-CA＆pYHP)菌株通過搖瓶發(fā)酵積累287 mg/L肉桂酸，YHP05(pHB-CAD＆ pYHP)菌株積累75 mg/L肉桂醛。Gottardi等［26］在 S．cerevisiae中表達 AtPal2、acar和 entD 3個外源基因，利用自身的醇脫氫酶，能夠?qū)⑼庠刺砑拥娜夤鹚徂D(zhuǎn)化為肉桂醇，也可以從頭合成并積累27．8 mg/L肉桂醇。

圖4 L-苯丙氨酸衍生物的生物合成途徑Fig.4 Biosynthetic pathways of L-phenylalanine derivatives

苯乙烯是合成樹脂、塑料等高分子聚合物材料的重要單體，但是苯乙烯對微生物細胞有很強的毒性［27］，所以微生物合成苯乙烯的產(chǎn)量較低。McKenna 等［27］在 L-苯丙氨酸高產(chǎn) E．coli菌株中過表達擬南芥(Arabidopsis thaliana)的L-苯丙氨酸氨解酶基因PAL2和來自于S．cerevisiae的阿魏酸脫羧酶基因FDC1，最終菌株通過搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達到260 mg/L，接近對苯乙烯的耐受性極限。該研究組采用相同的合成途徑在S．cerevisiae中同樣實現(xiàn)了苯乙烯的從頭合成，但是苯乙烯產(chǎn)量只有29 mg/L［28］。

苯乳酸可以抑制食品腐敗菌和人類的某些致病菌，有望成為一種新型的防腐劑和藥物制劑。苯丙酮酸在乳酸脫氫酶(LdhA)作用下生成苯乳酸(圖4)。Koma等［29］將兩個拷貝的乳酸脫氫酶基因ldhA整合到L-苯丙氨酸高產(chǎn)E．coli菌株的染色體上獲得PAR-58菌株，該菌株以葡萄糖為碳源，在搖瓶發(fā)酵條件下積累6 mmol/L(約1 g/L)苯乳酸。

苯乙醇具有特殊的玫瑰花香，廣泛應(yīng)用于食品和化妝品;苯乙酸是醫(yī)藥、農(nóng)藥、香料等有機合成的中間體。苯丙酮酸在苯丙酮酸脫羧酶作用下生成苯乙醛，苯乙醛分別在醛還原酶和苯乙醛脫氫酶作用下轉(zhuǎn)化為苯乙醇和苯乙酸(圖4)。Koma等在苯丙氨酸高產(chǎn)E．coli菌株的染色體上過表達ipdC和yahK，敲除feaB獲得PAR-84菌株，該菌株在搖瓶發(fā)酵條件下積累 7．7 mmol/L(約 0．94 g/L)苯乙醇。該研究組采用類似的方式過表達ipdC和feaB，同時敲除tyrA，PAR-100工程菌株積累 8．8 mmol/L(約1．2 g/L)苯乙酸。Chen 等［30］在 S．cerevisiae中通過質(zhì)粒分別過表達氨基酸透性酶基因GAP1和調(diào)控GAP1表達的轉(zhuǎn)錄因子基因GLN3和GAT1以及共表達GLN3/GAT1或GLN3/GAP1，均能明顯提高苯乙醇產(chǎn)量，其中GLN3過表達菌株效果最明顯，搖瓶發(fā)酵苯乙醇產(chǎn)量達到 3．59 g/L。Etschmann 等［31］利用馬克思克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)CBS600菌株，通過分批補料發(fā)酵的方式，以聚丙二醇作為細胞原位發(fā)酵提取劑和前體物質(zhì)積累26．5 g/L苯乙醇和6．1 g/L苯乙酸。

D-苯丙氨酸是一種手性分子，可以作為許多藥物合成的前體物質(zhì)。苯丙酮酸在D-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶作用下，以D-丙氨酸作為氨基供體生成D-苯丙氨酸(圖4)。構(gòu)建D-苯丙氨酸高產(chǎn)菌株，需要阻斷苯丙酮酸到D-苯丙氨酸反應(yīng)步驟或?qū)-苯丙氨酸逆向催化生成苯丙酮酸，同時保證細胞內(nèi)有足夠的氨基供體 D-丙氨酸。Liu等［32］將 Bacillus subtilis的D-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因dat通過質(zhì)粒在苯丙氨酸高產(chǎn)E．coli菌株中過表達，獲得的工程菌株通過分批補料發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生1．72 g/L D-苯丙氨酸。

L-扁桃酸、D-苯甘氨酸和L-苯甘氨酸均是藥物合成的重要前體物質(zhì)。苯丙酮酸在4-羥基扁桃酸合酶(HmaS)作用下生成L-扁桃酸，L-扁桃酸可以進一步轉(zhuǎn)化為D-苯甘氨酸或L-苯甘氨酸(圖4)。Sun等［33］在 E．coli中通過質(zhì)粒過表達 hmaS、aroFFBR和pheAFBR，敲除競爭性途徑基因tyrB、aspC和tyrA，最終菌株以葡萄糖為碳源進行搖瓶發(fā)酵84 h 產(chǎn)生 1．02 g/L L-扁桃酸。Muller等［34］在苯丙酮酸高產(chǎn) E．coli菌株中通過質(zhì)粒過表達 hmaS、hmo和hpgAT，最終菌株以葡萄糖為碳源通過分批補料發(fā)酵產(chǎn)生(102±6)mg D-苯甘氨酸(以1 g干細胞計)。Liu等［35］在 E．coli中通過質(zhì)粒過表達hmaS、hmo和hpgT，并對苯丙氨酸合成途徑進行改造，敲除轉(zhuǎn)氨酶基因tyrB、aspC和ilvE，最終菌株通過分批補料發(fā)酵積累51．6 mg L-苯甘氨酸。4-羥基扁桃酸合酶催化的反應(yīng)是該途徑的限速步驟，過表達hmaS能夠進一步提高D/L-苯甘氨酸的產(chǎn)量。

4 酪氨酸及其衍生物的生物合成

分支酸在分支酸變位酶作用下生成預(yù)苯酸，預(yù)苯酸經(jīng)預(yù)苯酸脫氫酶催化得到4-羥基苯丙酮酸，4-羥基苯丙酮酸經(jīng)過轉(zhuǎn)氨酶催化得到L-酪氨酸(圖3)。L-酪氨酸在人和動物的生長發(fā)育和新陳代謝過程中發(fā)揮重要作用，也是有機合成工業(yè)的重要前體物質(zhì)，可以轉(zhuǎn)化為多種芳香族化合物。通過代謝工程手段構(gòu)建高產(chǎn)L-酪氨酸的工程菌株，為代謝工程改造微生物生產(chǎn)L-酪氨酸衍生物提供優(yōu)良的底盤細胞。

4.1 酪氨酸的生物合成

L-酪氨酸的制備主要是采取動物蛋白(如毛發(fā)和羽毛等)水解提取法，但是L-酪氨酸收率不高。微生物發(fā)酵法具有環(huán)境友好、提取工藝簡單、反應(yīng)條件溫和以及可實現(xiàn)連續(xù)大批量生產(chǎn)等優(yōu)點，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，構(gòu)建高產(chǎn)L-酪氨酸菌株的策略多采用代謝工程改造L-苯丙氨酸高產(chǎn)菌株，使其積累L-酪氨酸。Patnaik等［36］通過敲除L-苯丙氨酸高產(chǎn)E．coli菌株的pheA和pheL，將tyrA本身啟動子替換為強啟動子Ptrc，最終菌株在200 L發(fā)酵罐中通過分批補料發(fā)酵48 h積累55 g/L的L-酪氨酸。Huang等［37］設(shè)計了一個繞開酪氨酸反饋抑制的新合成途徑，在E．coli中通過質(zhì)粒過表達苯丙氨酸4-羥化酶基因P4H和循環(huán)系統(tǒng)酶基因MH4，并對莽草酸途徑進行改造，最終菌株通過搖瓶發(fā)酵積累401 mg/L 的 L-酪氨酸。Gold 等［38］通過解除 S．cerevisiae DAHP(Aro4K229L)和酪氨酸代謝反饋抑制(Aro7G141S)，過表達 Aro1和 Tyr1，敲除 Aro10和ZWF1，最終菌株在細胞內(nèi)積累520 μmol的 L-酪氨酸(以1 g干細胞計)。

4.2 酪氨酸衍生物的生物合成

雪，以最純粹的色彩，帶給我們最純粹的快樂。這份快樂，人類與動物共享?！堆┨斓亩Y物》中，一心盼著下雪的睡鼠兄弟再也熬不住，去冬眠了，他們夢見了打雪仗、滑雪橇，把積雪踩出“咯吱咯吱”的聲響；把雪捧在手上感受“白砂糖”般的質(zhì)感。而媽媽繡了點點雪花的圍巾就靜靜地躺在他們身邊，飽藏著媽媽的疼愛，等他們醒來后，禮物還會陪著他們慢慢長大。

4-羥基苯丙酮酸和L-酪氨酸可以衍生為多種具有重要經(jīng)濟價值的芳香族化合物，例如4-羥基苯乳酸(4-hydroxyphenyllactic acid)、4-羥基苯乙醇(4-hydroxyphenylethanol)、 4-羥 基 苯 乙 酸 (4-hydroxyphenylacetic acid)、丹參素(salvianic acid A)、苯酚(phenol)、對羥基香豆酸(p-coumaric acid)、4-羥基苯乙烯(4-hydroxystyrene)、左旋多巴(L-DOPA)和咖啡酸(caffeic acid)等(圖5，表1)。

圖5 L-酪氨酸衍生物的生物合成途徑Fig.5 Biosynthetic pathways of L-tyrosine derivatives

4-羥基苯乳酸、4-羥基苯乙醇(俗稱酪醇tyrosol)和4-羥基苯乙酸均是重要的有機合成中間體，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、香料合成等領(lǐng)域。這3種物質(zhì)的生物合成與苯丙氨酸衍生物苯乳酸、苯乙醇和苯乙酸的生物合成途徑所需的酶相同。Koma等［29］采用與構(gòu)建苯乳酸、苯乙醇和苯乙酸高產(chǎn)菌株相同的策略，以 L-酪氨酸高產(chǎn)E．coli菌株作為出發(fā)菌株，分別在染色體上過表達ldhA，獲得4-羥苯基乳酸搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達到8．1 mmol/L的菌株;過表達ipdC和yahK，同時敲除feaB和pheA獲得4-羥基苯乙醇產(chǎn)量達到8．3 mmol/L的菌株;過表達ipdC和feaB，同時敲除yahK和pheA，獲得4-羥基苯乙酸產(chǎn)量達到 6．1 mmol/L 的菌株。Xue 等［39］將 S．cerevisiae的芳香族氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因ARO8和苯丙酮酸脫羧酶基因ARO10通過質(zhì)粒在E．coli中過表達，獲得4-羥基苯乙醇搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達到8．71 mmol/L的菌株。

丹參素是從藥用植物丹參中提取的主要藥用成分之一。Yao等［40］通過質(zhì)粒模塊化手段過表達莽草酸途徑和L-酪氨酸合成途徑中的多個關(guān)鍵基因，獲得高產(chǎn)L-酪氨酸E．coli菌株，然后通過質(zhì)粒過表達 D-乳酸脫氫酶突變體基因 d-ldhY52A和hpaBC，實現(xiàn)丹參素的從頭合成，分批補料發(fā)酵72 h，產(chǎn)量達到7．1 g/L，相對于葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達到0．47 mol/mol。隨后，該研究組敲除 E．coli BAK5 的ptsG、pykF、pykA、pheA和 tyrR 獲得 BAK11菌株，通過模塊化的方式將3個模塊(PlacUV5-aroGFBR-tyrAFBR-aroE，Ptrc-glk-tktA-ppsA和P5tacs-hpaBC-d-ldhY52A)整合到染色體上，最終菌株BKD13以葡萄糖為碳源通過分批補料發(fā)酵60 h積累5．6 g/L丹參素［41］。

苯酚是生產(chǎn)樹脂、殺菌劑和防腐劑以及藥物的重要原料。Kim 等［42］在 E．coli BL21中利用 RNA干擾技術(shù)抑制負調(diào)控基因，過表達酪氨酸酚裂解酶基因tpl，并對酪氨酸合成途徑進行改造，最終菌株利用葡萄糖通過分批補料發(fā)酵的方式，苯酚產(chǎn)量達1．69 g/L。由于苯酚對微生物具有毒性，限制了其發(fā)酵積累，通過兩相分批補料發(fā)酵21 h配合甘油三丁酸酯萃取的方法，使苯酚產(chǎn)量提高至3．79 g/L。

對-羥基香豆酸，又稱對-羥基肉桂酸，被廣泛應(yīng)用于食品、化工和醫(yī)藥等行業(yè)，是合成許多重要化合物的前體或中間體。Vargas-Tah等［43］在 E．coli W3110中通過質(zhì)粒過表達Rhodotorula glutinis的苯丙氨酸解氨酶基因PAL和自身的tktA，解除DAHP代謝反饋抑制(aroGFBR)，工程菌株W(pheA-)Rg通過搖瓶發(fā)酵 16 h 積累 355．87 μmol/L(49．85 mg/L)對-羥基香豆酸。Rodriguez等［44］在 Δpdc5Δaro10 背景的 S．cerevisiae中過表達自身的 ARO4K229L和ARO7G141S、E．coli 中 的 aroL 以 及 Flavobacterium johnsoniaeu的PAL，通過分批補料發(fā)酵的方式，對-羥基香豆酸的產(chǎn)量最高達1．93 g/L。Nijkamp等［45］將惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的對-羥基香豆酸降解酶基因fcs敲除，通過載體過表達pal，并對L-酪氨酸代謝途徑進行優(yōu)化，工程菌通過分批補料發(fā)酵的方式積累1．7 g/L對-羥基香豆酸。

對-羥基香豆酸在脫羧酶作用下生成4-羥基苯乙烯。4-羥基苯乙烯是合成許多高聚物的單體。Qi等［46］在高產(chǎn)L-酪氨酸 E．coli菌株中通過質(zhì)粒過表達Rhodotorulaglutinis的 PAL和 Lactobacillus plantarum的對-羥基香豆酸脫羧酶基因pdc，最終菌株通過分批補料發(fā)酵產(chǎn)生0．4 g/L的4-羥基苯乙烯。Kang等［47］同樣在高產(chǎn) L-酪氨酸 E．coli菌株中過表達外源的酪氨酸解氨酶基因tal和酚酸脫羧酶基因pad，工程菌株通過搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生355 mg/L的4-羥基苯乙烯。

左旋多巴(L-多巴)是生物體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)，是治療帕金森病的主要藥物之一。Munoz等［48］在 E．coli中過表達 tktA、aroFFBR和 tyrA 以及來自于Zymomonas mobilis的環(huán)己二烯脫氫酶基因tyrC，得到高產(chǎn)L-酪氨酸菌株，進一步過表達4-羥基苯乙酸3-羥化酶基因hpaBC，實現(xiàn)L-酪氨酸向L-多巴轉(zhuǎn)化，分批補料發(fā)酵50 h產(chǎn)生1．51 g/L的 L-多巴。

咖啡酸是許多醫(yī)藥合成的重要原料和中間體。對-羥基香豆酸和L-多巴分別在4-羥基苯乙酸3-羥化酶(HpaBC)和酪氨酸解氨酶(Tal/FevV)的催化下生成咖啡酸(圖5)。Zhang等［49］在高產(chǎn)L-酪氨酸E．coli中分別通過低拷貝和高拷貝質(zhì)粒過表達tal和hpaBC，最終菌株在2 L發(fā)酵罐中以葡萄糖為碳源發(fā)酵4 d產(chǎn)生 106 mg/L咖啡酸。Kawaguchi等［50］同樣在高產(chǎn) L-酪氨酸 E．coli菌株中過表達銅綠色假單胞菌(P．a(chǎn)eruginosa)的酪氨酸解氨酶基因fevV和鏈霉菌(Streptomyces sp．)的hpaBC，工程菌采用同步糖化發(fā)酵的方式產(chǎn)生233 mg/L的咖啡酸，并證明限制葡萄糖供應(yīng)是提高咖啡酸產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。Huang等［51］在過表達 hpaBC 的 E．coli培養(yǎng)液中添加總計4 g/L對-羥基香豆酸進行全細胞轉(zhuǎn)化，獲得3．82 g/L的咖啡酸;隨后采用高產(chǎn)L-酪氨酸菌株進行從頭合成，通過搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生766．68 mg/L的咖啡酸。

除了上述的衍生物以外，L-酪氨酸還可以衍生為酪胺(tyramine)、阿魏酸(ferulic acid)和黑色素(melanin)等其他多種芳香族衍生物。

5 色氨酸及其衍生物的生物合成

5.1 色氨酸的生物合成

提高莽草酸途徑的前體物質(zhì)PEP和E4P，過表達莽草酸和色氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因，解除代謝反饋抑制，敲除色氨酸合成途徑轉(zhuǎn)錄調(diào)控抑制基因trpR，過表達絲氨酸合成基因serA，這些策略可以顯著提高 L-色氨酸的產(chǎn)量。Shen 等［52］在 E．coli K12(ΔtrpRΔtna)菌株中通過高拷貝質(zhì)粒過表達aroGFBR、trpEFBR和serA，分批補料發(fā)酵40 h 生成35．9 g/L的L-色氨酸;然后，通過低拷貝質(zhì)粒過表達tktA和ppsA，L-色氨酸產(chǎn)量進一步提高至40．2 g/L。敲除色氨酸內(nèi)吞轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因(mtr、tnaB和aroP)，過表達色氨酸外排蛋白基因yddG，可以進一步提高色氨酸產(chǎn)量。Liu等［53］在色氨酸高產(chǎn)E．coli菌株中通過質(zhì)粒過表達yddG，最終菌株TRTH-Y通過分批補料發(fā)酵36 h產(chǎn)生36．3 g/L的L-色氨酸，比對照菌株產(chǎn)量提高 12．6%。Wang等［54］在 E．coli MG1655中敲除pta-mtr，通過質(zhì)粒表達yddG，同時對色氨酸合成途徑進行改造，最終菌株以葡萄糖為碳源，在30 L的發(fā)酵罐中發(fā)酵38 h積累48．68 g/L的L-色氨酸，比對照菌株產(chǎn)量提高15．96%。

5.2 色氨酸衍生物的生物合成

L-色氨酸可以衍生為多種芳香族化合物，例如紫色桿菌素(violacein)、脫氧紫色桿菌素(deoxyviolacein)、生 長 素 (auxin)、血 清 素(serotonin)、靛紅(indirubin)、靛藍(indigo)和鹵化色氨酸等(圖6，表1)，但是衍生途徑較為復(fù)雜，導(dǎo)致衍生物產(chǎn)量一般比較低。如何進一步提高L-色氨酸衍生物產(chǎn)量是色氨酸領(lǐng)域研究需要解決的關(guān)鍵問題。

紫色桿菌素和脫氧紫色桿菌素是微生物產(chǎn)生的非水溶性的藍黑色色素，具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤和抗氧化等生理活性［55］。Rodrigues等［56］將含有脫氧紫色桿菌素合成基因vioABCE的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入高產(chǎn)L-色氨酸E．coli菌株中獲得dVio-6菌株，該菌株在搖瓶發(fā)酵條件下產(chǎn)生324．1 mg/L的脫氧紫色桿菌素;隨后在染色體上過表達vioD，最終菌株Vio-4通過分批補料發(fā)酵產(chǎn)生710 mg/L紫色桿菌素。Fang等［57］敲除 E．coli BL21(DE3)的 trpR、tnaA 和pheA，通過 2個質(zhì)粒分別過表達 trpEFBR-trpD和VioABCDE 2個模塊，最終菌株以葡萄糖為碳源，通過分批補料發(fā)酵產(chǎn)生1．75 g/L的紫色桿菌素。Sun等［55］以 C．glutamicum ATCC 21850 作為出發(fā)菌株，將帶有本身強核糖體結(jié)合位點(RBS)的PtrcvioABCDE基因簇通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)入出發(fā)菌株，最終菌株利用優(yōu)化后的分批補料發(fā)酵條件最高產(chǎn)生5．436 g/L紫色桿菌素。

生長素，學(xué)名吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid)，是最早發(fā)現(xiàn)的促進植物生長的植物激素，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。Romasi等［58］在 E．coli DH5α中通過質(zhì)粒過表達本身的氨基轉(zhuǎn)移酶基因aspC、Enterobacter cloacae的吲哚-3-丙酮酸脫羧酶基因ipdC和Ustilago maydis的吲哚-3-乙酸脫氫酶基因iad1，敲除抑制L-色氨酸分解酶基因tnaA，最終菌株IAA68在4 g/L L-色氨酸的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，吲哚-3-乙酸產(chǎn)量達3 g/L。

血清素，學(xué)名5-羥基色胺(5-hydroxytryptamine)，是一種植物源的生物堿，具有潛在的藥理作用。L-色氨酸先后在色氨酸脫羧酶(TDC)和色胺5-羥化酶(T5H)作用下生成血清素(圖 6)。Park 等［59］在E．coli將GST標簽蛋白與N末端缺失的色胺5-羥化酶基因進行融合表達，并表達色氨酸脫羧酶，然后在20℃低溫條件下誘導(dǎo)蛋白表達產(chǎn)生24 mg/L的血清素。

靛紅和靛藍是天然的藥物和還原性染料，被廣泛用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。Han等［60］在E．coli DH5α 中表達 Methylophaga aminisulfidivorans

的黃素單加氧酶基因fmo，首先催化生成2-羥基吲哚或3-羥基吲哚，然后通過自發(fā)二聚化生成靛藍或靛紅(圖6)。向5 L發(fā)酵罐中添加2 g/L的L-色氨酸底物進行發(fā)酵，產(chǎn)生920 mg/L靛藍和5．0 mg/L靛紅;向培養(yǎng)基中添加0．36 g/L的半胱氨酸，利用半胱氨酸影響黃素單加氧酶的區(qū)域選擇性，增加靛紅前體2-羥基吲哚的合成，優(yōu)化培養(yǎng)基后，靛紅的發(fā)酵產(chǎn)量達到223．6 mg/L。

表1 微生物生產(chǎn)芳香族化合物匯總Table 1 Production of aromatic chemicals by engineered microbes

有機鹵化物是一類具有特殊生理活性的化合物，已經(jīng)廣泛用于醫(yī)藥、殺菌劑和有機合成等多個領(lǐng)域。鹵化色氨酸是含鹵抗生素的重要前體物質(zhì)。L-色氨酸分別在FADH2依賴型色氨酸5-鹵化酶［61］、色氨酸 6-鹵化酶［62］和色氨酸 7-鹵化酶［63］作用下生成相應(yīng)的5、6或7位鹵化色氨酸(圖6)。蝴蝶霉素(rebeccamycin)分子結(jié)構(gòu)式中含有兩個7-氯色氨酸結(jié)構(gòu)。Hyun等［64］將 Saccharothrix aerocolonigenes中蝴蝶霉素生物合成基因簇(約35 kb)通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E．coli中，該基因簇包含色氨酸7-鹵化酶基因rebH，在工程菌株的代謝產(chǎn)物中能夠檢測到蝴蝶霉素的生成，表明色氨酸7-鹵化酶能夠在E．coli中正常表達并發(fā)揮催化活性。

圖6 L-色氨基酸衍生物的生物合成途徑Fig.6 Biosynthetic pathways of L-tryptophan derivatives

6 結(jié)論與展望

芳香族化合物廣泛用于醫(yī)藥、化工、食品、飼料和農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域，市場需求量很大。隨著化石能源儲量的急劇減少和人類生存環(huán)境的逐漸惡化，芳香族化合物依賴于化石能源產(chǎn)物“三苯”衍生轉(zhuǎn)化的傳統(tǒng)生產(chǎn)方式已經(jīng)不符合新經(jīng)濟形勢下的可持續(xù)綠色發(fā)展要求。通過理性設(shè)計和定向改造微生物的代謝途徑來實現(xiàn)芳香族化合物的微生物合成的方式具有傳統(tǒng)的誘變育種無可比擬的優(yōu)勢。因此，通過代謝工程手段構(gòu)建綠色高效的細胞工廠來生產(chǎn)目標芳香族化合物的替代合成途徑逐漸受到人們的廣泛關(guān)注，并取得了一系列重大的研究成果。近些年來，隨著各種組學(xué)研究的發(fā)展，人們對于不同生物體的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組以及細胞信號調(diào)控機理的研究越來越清晰，更加方便地從生物學(xué)原件、模塊及系統(tǒng)等不同層次設(shè)計具有特定功能的細胞工廠，從而滿足人們對發(fā)酵產(chǎn)品多樣化的生產(chǎn)需求。

芳香族化合物在生物體中的含量較低，難以滿足生產(chǎn)需求。本篇綜述在整體代謝途徑水平上概要地介紹了利用微生物代謝工程手段，以莽草酸途徑和芳香族氨基酸途徑產(chǎn)物為底物合成不同芳香族化合物的研究進展。通過理性設(shè)計，對微生物中心代謝途徑、莽草酸途徑以及芳香族氨基酸合成途徑進行優(yōu)化，同時導(dǎo)入外源所需生化反應(yīng)的酶的編碼基因，敲除代謝副產(chǎn)物途徑基因和產(chǎn)物負調(diào)控相關(guān)基因，使微生物具有更強的積累芳香族化合物的能力。

此外，大部分芳香族化合物對微生物具有不同程度的生理毒性，導(dǎo)致目標產(chǎn)物積累量很低。可以通過菌株馴化提高其耐受性，利用耐受性強的宿主菌株，提高代謝產(chǎn)物分泌能力，使目標產(chǎn)物以沉淀形式析出或膜過濾去除等多個方式降低目標產(chǎn)物毒性。盡管困難重重，相信在廣大科研工作者不遺余力的努力下，利用微生物細胞工廠來替代傳統(tǒng)化學(xué)合成途徑生產(chǎn)芳香族化合物的愿望一定能夠?qū)崿F(xiàn)，從而促進經(jīng)濟社會的可持續(xù)發(fā)展。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Advances in microbial metabolic engineering for producing aromatic chemicals

WU Fengli，PENG Yanfeng，XU Yicheng，CAO Peng，CHEN Wujiu，WANG Qinhong
(CAS Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China)

Aromatic chemicals are a large number of industrially important products with a range of applications in chemical industry．Recently，an increasing array of aromatic chemicals are produced via many engineered microbes directly from renewable feedstocks．The engineered microbes based on rational design can significantly overproduce a large variety of aromatic chemicals with wide applications．In addition，we can broaden the product spectrum via de novo biosynthetic pathways and obtain some valuable and novel aromatic chemicals．Microbial production of aromatic chemicals would greatly contribute to solving the problems to fossil energy crisis and environment sustainable development．In this review，the latest research progress on microbial production of various aromatic chemicals and the strategies for metabolic engineering were summarized，to provide basis for further research and development．

synthetic biology;metabolic engineering;shikimate pathway;aromatic chemicals;microbial production

Q939．97;TQ92

A

1672-3678(2017)05-0009-15

10．3969/j．issn．1672-3678．2017．05．002

2017-06-14

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(2011CBA00800);天津市科技計劃(14ZCZDSY00066)

吳鳳禮(1986—)，男，河北遷西人，博士后，研究方向：生物化工;王欽宏(聯(lián)系人)，研究員，E-mail：wang_qh@tib．cas．cn