夏天保，馮 凱，米 霞，劉建軍，劉軍連，陳 娓，呂世超

北京地區(qū)某醫(yī)院水痘帶狀皰疹病毒基因型的測定

夏天保，馮 凱，米 霞，劉建軍，劉軍連，陳 娓，呂世超

目的 測定北京地區(qū)帶狀皰疹患者水痘帶狀皰疹病毒的基因型。方法 采用測序的方法測定帶狀皰疹患者水痘-帶狀皰疹病毒ORF22、ORF38、ORF54基因序列。結(jié)果 基因分析結(jié)果顯示：北京地區(qū)306醫(yī)院8株水痘帶狀皰疹病毒臨床分離株中基因型均為J型，其中ORF22 序列中37990位點(diǎn)有1例存在A-G的突變。結(jié)論 北京地區(qū)306醫(yī)院的水痘帶狀皰疹病毒臨床分離株中基因型均為J型，其中ORF22 序列中37990位點(diǎn)存在1例A-G的突變。

帶狀皰疹；水痘-帶狀皰疹病毒；泛昔洛韋；帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛；基因型

[J Pract Dermatol, 2017, 10(4):197-200]

水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）是一種人類皰疹病毒，在幼兒通常引起水痘。原發(fā)感染后病毒潛伏終身，并經(jīng)常在成年人或老年人引起帶狀皰疹。VZV基因組包含125 kb的線性雙鏈DNA，包括一長一短獨(dú)特的區(qū)域，每個(gè)兩側(cè)的反向重復(fù)序列[1]，和5個(gè)內(nèi)部重復(fù)區(qū)域（R1～R5）已經(jīng)確定。VZV基因組中至少含有71個(gè)開放閱讀框（ORF），編碼許多有功能的蛋白。Loparev 等[2]報(bào)道一個(gè)簡單的分類方法，就是把野生型VZV菌株分成3個(gè)主要的亞型， E（歐洲），J（日本），和M（嵌合型），使用SNP識(shí)別ORF22讀碼框的447 bp的區(qū)域。Loparev 等[2]從最近的臨床感染中得到的323株分布在全球各地的病毒株代表目前循環(huán)菌株（歐洲、亞洲、非洲、大洋洲和美洲），可以很容易地被分配到3個(gè)基因型中的一個(gè)。此外，從這一分析中每個(gè)基因型的區(qū)域特異性是顯而易見的，這些數(shù)據(jù)揭示了主要基因型及其地理分布之間的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果將有助于預(yù)測未來的進(jìn)化模式和跟蹤病毒流行病學(xué)的變化，這必然伴隨著活躍的疫苗接種計(jì)劃。

中國關(guān)于VZV分離株基因型的報(bào)道也逐漸增多，楊吉星等[3]2008年報(bào)道上海地區(qū)VZV的基因型是J型。馬瑞等[4]2012年報(bào)道寧波市的15株VZV基因型中，J型13株，M1型2株，而北京地區(qū)的VZV分型文獻(xiàn)較少。因此，筆者擬測定北京地區(qū)306醫(yī)院帶狀皰疹患者VZV的基因型，對(duì)該院的12例水痘和帶狀皰疹患者的皰液進(jìn)行檢測和分析。

1 病例與方法

1.1 病例

1.1.1 臨床資料 選擇2014年12月1日—2015年1月10日至解放軍306醫(yī)院就診的水痘和帶狀皰疹患者，且能在水皰皮損中收集到皰液。共收集符合條件的患者12例，其中男8例，女4例；年齡18～75歲。均為漢族（無血緣關(guān)系），血常規(guī)、肝功能、血脂均正常。

1.1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) ①臨床明確診斷的水痘或帶狀皰疹，患者的皮損時(shí)間為3 d以內(nèi)；②年齡18～75歲；③性別不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：①惡性腫瘤患者；②患有影響免疫功能的系統(tǒng)性疾病患者（甲亢或甲減或糖尿?。虎劢趦?nèi)應(yīng)用過糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑患者；④妊娠期和哺乳期婦女；⑤腎功能損害者；⑥人免疫缺陷病毒（HIV）陽性患者。所有入選患者均簽署知情同意書，并經(jīng)過醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本處理 采集患者早期的皰液100 μl，置于-20℃低溫冰箱保存待檢。試劑儀器、全血直接聚合酶鏈反應(yīng) （PCR）試劑盒、DNA Marker DL2000，瓊脂糖、PCR管、凝膠成像系統(tǒng)，PCR VZV DNA，試劑和儀器由北京百奧森泰生物技術(shù)有限公司提供。

1.2.2 檢測方法 對(duì)ORF22讀碼框的447 bp的PCR目標(biāo)區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，采用5 μl的DNA提取液（來自水痘或帶狀皰疹患者皮損的DNA提取液）。反應(yīng)物：每20個(gè)堿基的引物100 pmol和2.5 U Taq DNA聚合酶（Applied Biosystems）。運(yùn)行條件：95℃ 3 min, 95℃ 1 min，25個(gè)循環(huán),50℃ 1 min，72℃ 3 min，72℃ 10 min。

1.2.3 PCR引物 ORF22引物：p22r1f（5 -GGG TTT TGT ATG AGC GTT GG-3 ；positions 37837 to 37856），反 向 引 物 p22r1r（5 -CCC CCG AGG TTC GTA ATA TC-3；positions 38383 to 38356）被設(shè)計(jì)出來擴(kuò)增出447 bp的片段（位置37837～38264）。ORF38引物：上游AAG TTT CAG CCA ACG TGC CAA TAA A，下游 AGA CGC GCT TAA CGG AAG TAA CG。ORF54引物：上游（F） CGT AAT GCA TAA CAG GCC AAC AC，下游 (R)GAA ACC TGG CGT CAA ACA TTA CA。

1.2.4 測序與分析 PCR產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳（含EB）（Invitrogen）在紫外線下拍照。對(duì)分離的產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序的結(jié)果與GeneBank中VZV參考株Dumas進(jìn)行序列比較，并分析其中的單核苷酸多態(tài)性，判斷北京地區(qū)306醫(yī)院VZV的基因型。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖凝膠水平電泳

PCR 產(chǎn)物 5 μl，6×Loading Buffer 1 μl混勻后加入泳道；Takara DNA Marker DL2000作為標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照； 5 V/cm電壓電泳30 min。DNA marker DL 2000（TAKARA）作參照，紫外燈下觀察結(jié)果并攝像（圖1-3）（該DNA marker為DL 2000，分別為100、250、500、750、1 000、2 000 bp）。

2.2 經(jīng)PCR對(duì)所有產(chǎn)物進(jìn)行測序。

從臨床采集的12份標(biāo)本中經(jīng)鑒定得到8株VZV臨床分離株，病毒分離陽性率為66.7%。Loparev等[2]利用ORF22的 37902、38019、38055、38081、38177、38229位這6個(gè)位點(diǎn)的核苷酸序列的不同將VZV分為E、J、M 3個(gè)基因型。基因分析結(jié)果顯示北京地區(qū)306醫(yī)院8株VZV臨床分離株中基因型均為J型，其中ORF22 序列中37990位點(diǎn)存在1例A-G的突變（表1，圖4）。對(duì)北京市VZV分離株ORF38、 ORF54測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其ORF38 Pstl+，ORF54Bgll+，而Dumas分離株ORF38 Pstl+，ORF54 Bgll-。

圖1 水痘-帶狀皰疹病毒ORF22 PCR電泳圖 （PCR產(chǎn)物為418 bp）

圖2 水痘-帶狀皰疹病毒ORF38 PCR電泳圖（PCR產(chǎn)物為602 bp）

圖3 水痘-帶狀皰疹病毒ORF54 PCR電泳圖（PCR產(chǎn)物為468 bp）

表1 北京市VZV分離株ORF22的SNPs位點(diǎn)差異

3 討論

圖4 水痘帶狀皰疹病毒臨床分離株ORF22 序列測序圖

VZV基因組具有很好的遺傳穩(wěn)定性，在不同毒株間其基因組變異率僅為0.05%～0.06%，比人類其他皰疹病毒基因組變異率低5～10倍，這種情況給VZV的基因分型帶來了巨大的挑戰(zhàn)。Loparev等[2]報(bào)道一個(gè)簡單的分類方法，就是把野生型VZV菌株分成3個(gè)主要的亞型，E（歐洲），J（日本），和M（嵌合型），使用SNP識(shí)別ORF22讀碼框的447 bp的區(qū)域，ORF22讀碼框這部分能夠滿足用于檢測低滴度的臨床標(biāo)本和可靠地識(shí)別病毒DNA的3個(gè)主要基因型。無論是多個(gè)開放讀碼框的基因單核苷酸多態(tài)性分析和ORF22讀碼框的SNP分析，均能準(zhǔn)確無誤地解決VZV基因分型，在高度傳代的歐洲和日本菌株，ORF22對(duì)于基因型的區(qū)域高度選擇是穩(wěn)定的。

在全球各地的VZV分離株中評(píng)價(jià)ORF38（PstI）和ORF54（BglI）單核苷酸多態(tài)性的分布。直接的測序分析是最準(zhǔn)確的和最信息化的方法，它可識(shí)別單核苷酸多態(tài)性，單核苷酸多態(tài)性對(duì)病毒株的分類是有用的。Loparev等[2]采用這種方法在臨床樣本選定區(qū)域直接測序進(jìn)行研究。在RFLP分析數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，對(duì)主要目標(biāo)進(jìn)行排序；最不同的模式被推定為準(zhǔn)確地反映菌株的變化。該作者對(duì)全球各地的菌株進(jìn)行了目標(biāo)ORF測序，與已發(fā)表的ORF38 PstI位點(diǎn)和ORF54 BglI位點(diǎn)進(jìn)行比較。

大多數(shù)在美國收集的VZV菌株參照歐洲的Dumas 菌株具有最大的整體相似性，同樣所有日本的菌株與其他日本菌株表現(xiàn)出最大的相似性，而與Dumas和美國大多數(shù)菌株具有最大的不同。

本研究采用已經(jīng)建立的SNP分析方法對(duì)VZV ORF22、38、54中的SNP位點(diǎn)進(jìn)行了序列分析。依據(jù)Loparev的分類方法，將野生型VZV菌株分成3個(gè)主要的亞型， E（歐洲），J（日本），和M（嵌合型）。筆者從臨床采集的12份標(biāo)本中經(jīng)鑒定得到8株VZV臨床分離株，病毒分離陽性率為66.7%。基因分析結(jié)果顯示北京地區(qū)8株水痘帶狀皰疹病毒臨床分離株中基因型均為J型，其中ORF22 序列中37990位點(diǎn)存在1例A-G的突變。

Loparev等也證實(shí)了以前的報(bào)告[4,6]，大多數(shù)現(xiàn)代日本菌株的酶切位點(diǎn)有PstI +BglI+限制性酶切位點(diǎn)（檢查的20株100%）。有趣的是，3種具有PstI - BglI+野生型菌株VZV 2002年在夏威夷被分離出來。所有的PstI / BglI基因分型同時(shí)進(jìn)行RFLP分析和用FRET探針熔點(diǎn)進(jìn)行分析，兩種方法觀察完全一致。對(duì)326份來自不同區(qū)域的菌株進(jìn)行評(píng)估，這項(xiàng)研究證實(shí)了使用的LightCycler FRET分析方法來識(shí)別單核苷酸多態(tài)性是有效的。

306醫(yī)院VZV基因分型的意義主要體現(xiàn)在水痘和帶狀皰疹的流行病學(xué)和疫苗研制方面。雖然北京地區(qū)現(xiàn)在水痘疫情已經(jīng)大大減少，但有些區(qū)域偶有水痘暴發(fā)，且北京地區(qū)人口密集，外來人口較多，因此水痘暴發(fā)的原因很復(fù)雜且很難控制。而VZV的基因分型則可以幫助掌握VZV的流行病學(xué)特征，快速查明VZV毒株的來源，追蹤VZV在好發(fā)人群的傳播情況，切斷傳播的路線，及時(shí)控制疫情的發(fā)展及蔓延。為了更全面地掌握北京地區(qū)VZV基因型的分布，作者下一步應(yīng)當(dāng)擴(kuò)大標(biāo)本量，同時(shí)記錄VZV患者的臨床特征和相關(guān)的一些信息，深入探索VZV基因型與病毒感染和疫苗防疫之間以及和地理位置之間的關(guān)系。

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[2] Loparev VN, Gonzalez A, Deleon-Carnes M, et al. Global identification of three major genotypes of varicella-zoster virus:longitudinal clustering and strategies for genotyping [J]. J Virol,2004,78(15):8349-8358.

[3] 楊吉星, 居麗雯, 施強(qiáng), 等. 上海地區(qū)水痘-帶狀皰疹病毒基因型研究 [J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2008, 2(18):223-224.

[4] LaRussa P, Lungu O, Hardy I, et al. Restriction fragment length polymorpHism of polymerase chain reaction products from vaccine and wild-type varicella-zoster virus isolates [J]. J Virol, 1992,66(2):1016-1020.

[5] 馬瑞, 徐國章, 李翔, 等. 寧波市水痘-帶狀皰疹病毒株臨床流行株基因分型 [J]. 中國公共衛(wèi)生, 2012, 28(5):659-660.

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（本文編輯 耿建麗）

書 訊

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Determination of varicella zoster virus genotype in a hospital in Beijing region

XIA Tian-bao，F(xiàn)ENG Kai，MI Xia，et al
Department of Dermatology &Venereology,306th Hospital of PLA, Beijing 100101, China

Objective To detect the genotype of varicella zoster virus(VZV) genotype in 306 hospital in Beijing region.Methods VZV ORF22, ORF38, ORF54 gene sequence were detected by sequencing method. Results The results of gene analysis showed that the genotypes of the clinical isolates of 8 strains of VZV in Beijing region were J. There was a case of A-G mutation in the 37990 site of ORF22 fragement. Conclusion The genotype of the clinical isolates of VZV in 306 hospital in Beijing region was J. There was a case of A-G mutation in the 37990 site of ORF22 fragement.

Herpes zoster；Varicella zoster virus(VZV)； Famciclovir； Postherpetic neuralgia；Genotype

R752.12

A

1674-1293(2017)04-0197-04

夏天保

2016-11-20

2017-05-14）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20170402

100101北京，解放軍306醫(yī)院皮膚性病科（夏天保，米霞，劉建軍，劉軍連，陳娓，呂世超）；解放軍306醫(yī)院病理科（馮凱）

夏天保，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，研究方向：帶狀皰疹及皮膚激光美容，E-mail: xtb78@163.com

呂世超，E-mail: lvshichao@sina.com