李 晶，劉錦霞，李 娜，丁 品，杜文靜，武建榮，張建軍

(甘肅省科學(xué)院生物研究所,甘肅 蘭州 730000)

黃帚橐吾乙醇提取物對小鼠的急性毒性試驗

李 晶，劉錦霞，李 娜，丁 品，杜文靜，武建榮，張建軍

(甘肅省科學(xué)院生物研究所,甘肅 蘭州 730000)

黃帚橐吾(Ligulariavirgaurea)是一種在甘南草原上廣泛分布的毒雜草，但同時其乙醇提取物有很強的生物農(nóng)藥活性，具備開發(fā)成為生物農(nóng)藥的潛力。本研究通過昆明小鼠(Musmusculus)的經(jīng)皮、經(jīng)口急性毒性試驗對黃帚橐吾乙醇提取物的安全性進行評估。結(jié)果顯示，黃帚橐吾乙醇提取物對小鼠的經(jīng)皮急性毒性半致死劑量LD50>30 g·kg-1，經(jīng)口急性毒性LD50為6.983 1 g·kg-1，均符合低毒農(nóng)藥登記的毒性標(biāo)準(zhǔn)，可以按照低毒農(nóng)藥進行開發(fā)應(yīng)用。

黃帚橐吾;乙醇提取物;急性毒性試驗;農(nóng)藥;經(jīng)口;經(jīng)皮;昆明小鼠

我國是最早應(yīng)用殺蟲劑、殺菌劑防治植物病蟲害的國家之一[1]，伴隨著長期依賴和大量使用有機合成化學(xué)農(nóng)藥，環(huán)境污染、生態(tài)破壞以及食品安全等一系列問題逐漸被人們所關(guān)注[2-3]，大量研究開始積極研發(fā)更加環(huán)保、安全的生物農(nóng)藥[4]。其中，植物源農(nóng)藥憑借其在自然環(huán)境中易降解、選擇性強、無污染、對人畜安全等特點[5]，已成為生物農(nóng)藥的首選。

黃帚橐吾(Ligulariavirgaurea)為菊科橐吾屬多年生草本植物，主要分布于青藏高原東北部、云南西北部、甘肅、青海、四川等高海拔地區(qū)，生長于高寒草地、濕地、沼澤、草甸及灌叢中，是入侵草地的主要毒雜草[6-9]，常在草地中形成單優(yōu)勢種群，危害巨大[10]。近幾年黃帚橐吾的開發(fā)利用成為研究熱點。據(jù)報道，黃帚橐吾莖、葉的甲醇提取物對菜粉蝶幼蟲有較強的觸殺和拒食作用，48 h觸殺死亡率為83.33%，48 h拒食率為82.23%[11]，對常見的玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)和水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)也具有明顯的抑菌作用，抑制率分別為90.16%、77.47%[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，黃帚橐吾乙醇提取物能夠有效滅殺棉鈴蟲幼蟲，其對棉鈴蟲3齡前幼蟲有很強的拒食活性，拒食中濃度(AFC50)為2.59 mg·mL-1；濃度為10.00 mg·mL-1時，拒食率超過95%；觸殺和胃毒活性也較強，半致死劑量(LC50)約為3.00 mg·mL-1；濃度為10.00 mg·mL-1時，校正死亡率均超過80%[12]。黃帚橐吾乙醇提取物在防控鱗翅目和同翅目害蟲危害方面具有較大的開發(fā)價值。上述研究已經(jīng)證實黃帚橐吾在病蟲害防控方面具有較好的開發(fā)前景，可以將這種草原雜草變廢為寶，作為防控農(nóng)作物蟲害的生物農(nóng)藥進行開發(fā)應(yīng)用。生物農(nóng)藥最顯著的特性是選擇性強、對人畜安全[13]，因此將黃帚橐吾乙醇提取物作為生物農(nóng)藥的主要成分進行開發(fā)應(yīng)用時，對其安全性進行評價是先決條件，也是我國《農(nóng)藥管理條例》和《農(nóng)藥管理條例實施辦法》中規(guī)定的必研項目。現(xiàn)有研究中關(guān)于黃帚橐吾乙醇提取物的急性毒性尚未見相關(guān)報道，所以本研究參照《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗方法》 (GB15670-1995)，通過小鼠的經(jīng)皮、經(jīng)口急性毒性試驗對黃帚橐吾乙醇提取物安全性進行初步評估，以豐富毒理學(xué)資料，為其作為新的植物源農(nóng)藥進行應(yīng)用開發(fā)和新農(nóng)藥登記提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1試驗動物 昆明種健康小鼠(Musmusculus)，雌雄各半，體重(20±2) g，購自甘肅省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK(甘)2011-0001。

1.1.2受試藥物 黃帚橐吾乙醇提取物(黃帚橐吾葉的乙醇浸提物)，有特異氣味的深褐色浸膏，臨用前用0.5% 泊洛沙姆超聲乳化配制乳濁液或用白凡士林配制成軟膏。

1.2試驗方法

1.2.1黃帚橐吾地上部乙醇提取物的制備 8月中旬在甘南草原采黃帚橐吾的葉片，水洗除塵，于110 ℃殺青10 min，晾干，粉碎。 將粉碎物與90%乙醇按1∶1(g∶mL)置于加塞的圓底燒瓶中，常溫下浸泡24 h，45 ℃超聲提取40 min，靜置1 h后，再在相同條件下超聲提取第1次，共進行3次。過濾，收集濾液；依上述方法共提取3次，濾渣再用少量溶劑洗滌3次，過濾。合并所得所有濾液，過濾除雜。在0.08 MPa、40 ℃條件下減壓旋蒸濾液，至溶劑不再蒸出，得到有特異氣味的棕黑色浸膏樣品[14]。

1.2.2經(jīng)皮急性毒性試驗 選擇體質(zhì)量18～22 g的小鼠，每組10只，雌雄各半，隨機分為3組。給藥24 h前將小鼠背部脊柱兩側(cè)毛用8.0% 硫化鈉水溶液脫掉，硫化鈉涂于動物脊背兩側(cè)2 min后，用紗布沾清水洗凈、擦干。小鼠脫毛面積約3 cm×3 cm。分別以藥∶凡士林1∶10、1∶100、1∶1 000的劑量比例配制白凡士林軟膏。按上述濃度經(jīng)皮給藥，方法為先將小鼠固定，在略小于剃毛面積內(nèi)進行定量敷藥，然后覆蓋一個與脫毛面積相當(dāng)?shù)暮惺秸?，再用膠布固定，以防止小鼠舔食藥物(20 mL·kg-1，每天2～3次，間隔4 h)，找出受試藥物的0和100%的估計致死量。另取小鼠，每組10只，雌雄各半，隨機分為6組。脫毛，以受試藥物0和100% 估計致死量為依據(jù)，分別以0估計致死藥量的2、4、8、16倍的劑量比例配置白凡士林軟膏，再加上受試藥物的0和100%的估計致死量，共6個濃度經(jīng)皮給藥(20 mL·kg-1，每天2～3次，間隔4 h)，測定受試藥物的最小劑量(Dmin)和最大劑量(Dmax)，并計算組間劑量比值(K)。

以 Dmin作為最低劑量組，以 Dmax作為最高劑量組，按K值計算出中間劑量。按照計算結(jié)果將藥物配為6個濃度，另取小鼠，每組10只，雌雄各半，隨機分為7組，經(jīng)皮給藥后觀察并詳細記錄動物的反應(yīng)情況以及動物死亡分布結(jié)果，對照組經(jīng)皮給藥100%凡士林，其余操作同處理組。給藥后小鼠飼養(yǎng)環(huán)境不變，溫度21～25 ℃，相對濕度60%～70%，光照12 h明暗變換。

若無法測得Dmax或小鼠均無死亡，另取小鼠20只，雌雄各半，隨機分為兩組，給藥前24 h將小鼠背部脊柱兩側(cè)毛用8.0%硫化鈉水溶液脫掉，小鼠脫毛面積約3 cm×3 cm。分別以(受試藥物∶白凡士林1∶1)配制白凡士林軟膏，經(jīng)皮給藥(20 mL·kg-1，分3次，間隔6 h)測定最大耐受劑量(MTD)，并觀察各小鼠的飲食、活動、精神狀態(tài)、皮毛膚色、大小便、體重變化及死亡情況，連續(xù)觀察14 d，試驗設(shè)對照組，經(jīng)皮給藥100%凡士林，其余操作同處理組。

1.2.3經(jīng)口急性毒性試驗 選擇體重(20±2) g的小鼠，隨機分組，每組10只，雌雄各半，隨機分為3組。試驗前動物禁食不禁水12 h，將黃帚橐吾提取物分別以藥∶0.5%泊洛沙姆1∶10、1∶100、1∶1 000的比例配制乳濁液，灌胃給藥(20 mL·kg-1)，找出受試藥物的0和100% 的估計致死量。另取小鼠，以0估計致死藥量的2、4、8、16倍比例配置乳濁液，灌胃給藥(20 mL·kg-1)。根據(jù)Dmin和Dmax以及計劃分組數(shù)計算K值，并計算中間幾組劑量。按照計算結(jié)果將藥物配為6個濃度，另取小鼠，每組10只，雌雄各半，隨機分為7組，灌胃給藥(20 mL·kg-1)后觀察并詳細記錄動物的反應(yīng)情況以及動物死亡分布結(jié)果，對照以0.5%泊洛沙姆生理鹽水乳濁液灌胃，其余操作同處理組。

1.2.4一般體征觀察及急性毒性評估 經(jīng)皮給藥、經(jīng)口給藥后嚴密觀察并記錄24 h內(nèi)動物的反應(yīng)情況，并連續(xù)觀察14 d，期間重點觀察小鼠神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及皮毛等的反應(yīng)情況[15]，總結(jié)數(shù)據(jù)，做出急性毒性評估。

1.3數(shù)據(jù)分析處理

采用SPSS 22.0中機率單位加權(quán)回歸法(Bliss)計算黃帚橐吾提取物對小鼠急性毒性的LD50以及 95% 置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1經(jīng)皮急性毒性測定

受試藥物經(jīng)皮給藥后無法測得LD50，按照最高濃度(50%)單次最大給藥容量(20 mL·kg-1)給藥，持續(xù)觀察14 d，未見動物死亡。對照組小鼠未見明顯異常(表1)。按照單次最大給藥容量推測經(jīng)皮 LD50>30.0 g·kg-1，即經(jīng)皮急性毒性(MTD)為30.0 g·kg-1。參照我國現(xiàn)行農(nóng)藥經(jīng)皮急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)皮LD50>2.0 g·kg-1時屬低毒農(nóng)藥，因此，黃帚橐吾提取物經(jīng)皮毒性屬低毒。

2.2經(jīng)口急性毒性LD50測定

預(yù)試驗結(jié)果顯示，黃帚橐吾葉提取物的Dmax為15.0 g·kg-1，Dmin為 5.0 g·kg-1，K為0.75，設(shè)6個劑量組進行正式試驗(表2)。上述數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 22.0中的機率單位加權(quán)回歸法(Bliss)分析計算，得到概率單位值P；回歸方程為Y=0.834 4+4.935 3X，a=0.01時查得r為0.917 0，式中：Y為概率單位加5后的值，X為劑量的對數(shù)；最終得到LD50為6.983 1 g·kg-1，95%置信區(qū)間為5.302 3-9.196 7。參照我國急性經(jīng)口毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)LD50>500 mg·kg-1時，屬于低毒毒性，因此，黃帚橐吾提取物經(jīng)口毒性屬低毒。

表1 黃帚橐吾提取物對小鼠的經(jīng)皮急性毒性(MTD)測定結(jié)果Table 1 The results of maximum tolerated dose (MTD) of the acute percutaneous toxicity of extracts from Ligularia virgaurea in Mus musculus

表2 黃帚橐吾提取物對小鼠經(jīng)口 LD50測定結(jié)果Table 2 The results of LD50 of the acute oral toxicity of extracts from Ligularia virgaurea in Mus musculus

2.3經(jīng)皮急性毒性評價

受試藥物經(jīng)皮給藥后無法測得 LD50，按照最高濃度(50%)單次最大給藥容量(20 mL·kg-1)給藥后，10 min左右小鼠出現(xiàn)興奮、不安、躁動、跳躍、震顫等癥狀，60 min后開始減輕，90 min出現(xiàn)鎮(zhèn)靜、蜷縮，活動量明顯減少，180 min飲食、活動恢復(fù)正常，大小便未見異常，體重增加正常，持續(xù)觀察14 d，未見動物死亡。對照組小鼠未見明顯異常(表1)。

2.4經(jīng)口急性毒性評價

受試藥物灌胃給藥后，中毒小鼠在30 min內(nèi)出現(xiàn)蜷縮、張口、弓背、運動平衡失調(diào)、四肢僵硬，最后抽搐死亡。解剖后肉眼觀察，未見肺、肝、腎、腦、心臟的形態(tài)和顏色異常。生存小鼠在給藥15 min后開始進水進食，活動正常，糞便性狀正常，體重增加正常，對照組小鼠未見明顯異常。

3 討論

黃帚橐吾提取物作為潛在的植物源農(nóng)藥其作用已經(jīng)被大量研究證明[12,16]，但未見關(guān)于其安全性評價的相關(guān)研究資料。急性毒性試驗是農(nóng)藥安全性評價的第一步[17-18]，也是安全性評價的基礎(chǔ)[19-20]，決定了新農(nóng)藥的開發(fā)前景，也是農(nóng)業(yè)管理部門制定農(nóng)藥危害的防治對策和衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)[21]。

本研究按照《農(nóng)藥安全性評價程序》以及《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗方法》(GB 15670-1995)對黃帚橐吾的乙醇提取物進行了初步的毒性試驗。黃帚橐吾乙醇提取物對小鼠的經(jīng)皮急性毒性損害推測主要為皮膚直接刺激和神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，按照單次最大給藥容量得出經(jīng)皮LD50>30.0 g·kg-1，即 MTD 為30.0 g·kg-1，此閾值比另外一種人畜低毒農(nóng)藥3%甲氨基阿維菌素微乳劑(其LD50>2.0 g·kg-1[22])都要低得多，說明黃帚橐吾提取物的經(jīng)皮安全性更高。其LD50大于實際無毒劑量(15 g·kg-1)，屬實際無毒物質(zhì)[23]。經(jīng)口試驗結(jié)果表明，其主要中毒靶器官為植物神經(jīng)系統(tǒng)，以運動系統(tǒng)為主，中毒起效快，持續(xù)時間較短。其LD50為6.983 1 g·kg-1，遠低于其它幾種已商品化的低毒農(nóng)藥(天然除蟲菊酯LD50為900 mg·kg-1[24],魚藤酮LD50為34.1 mg·kg-1[25])，說明黃帚橐吾提取物的經(jīng)口安全性也較高。

結(jié)合資料[5-7]以及前期殺蟲農(nóng)藥活性試驗[12]的結(jié)果得出，黃帚橐吾的乙醇提取物對鱗翅目和同翅目害蟲的防效可以達到80%，作為新農(nóng)藥開發(fā)的先決條件，本研究通過小鼠急性經(jīng)皮、經(jīng)口試驗對黃帚橐吾乙醇提取物的安全性進行了評價，黃帚橐吾乙醇提取物完全符合低毒農(nóng)藥登記的毒性標(biāo)準(zhǔn)，可以按照低毒農(nóng)藥進行開發(fā)應(yīng)用。這為其后續(xù)開發(fā)提供了完善、可靠的依據(jù)，為后期需要進行的亞慢性、慢性和其它毒性試驗的劑量水平提供了基礎(chǔ)試驗數(shù)據(jù)和參考。經(jīng)皮、經(jīng)口急性毒性試驗是農(nóng)藥安全性評價試驗的起始步驟[26]，其試驗結(jié)果有效但不能直接推及至人類，關(guān)于其對人、畜的精確安全閾值，還需要綜合其它毒理學(xué)試驗進行進一步驗證和全面評價。

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(責(zé)任編輯 張瑾)

ToxicityofethanolextractsfromLigulariavirgaurea

Li Jing, Liu Jin-xia, Li Na, Ding Pin, Du Wen-jing, Wu Jian-rong, Zhang Jian-jun
(Gansu Provincial Academy of Sciences Institute of Biology, Gansu Lanzhou 730000)

Ligulariavirgaurea. is a widespread poisonous plant species growing in Gannan grassland. The ethanol extract ofL.virgaureais known to possess strong bioactivity. To evaluate the safety of ethanol extract from leaves ofL.virgaurea, acute toxicity studies were conducted in mice. All of the tests were based on the 《Toxicological Test Methods of Pesticides for Registration》. The results showed that LD50of the acute dermal toxicity was greater than 30 g·kg-1, while the LD50of the acute oral toxicity was 6.983 1 g·kg-1. The ethanol extracts from leaves ofL.virgaureabelonged to low-toxic compound, which conformed to the standards of low-toxicity pesticide registration. Based on these results, the ethanol extract may have a potential for exploitation and application as a low-toxicity pesticide.

Ligulariavirgaurea; ethanol extract; acute toxicity; pesticide; percutaneous toxicity; oral toxicity;Musmusculus

Liu Jin-xia E-mail:liujinx0168@163.com

S452;Q949.98

：A

：1001-0629(2017)09-1941-06

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0476

李晶，劉錦霞，李娜，丁品，杜文靜，武建榮，張建軍.黃帚橐吾乙醇提取物對小鼠的急性毒性試驗.草業(yè)科學(xué),2017,34(9)：1941-1946.

Li Jing,Liu J X,Li N,Ding P,Du W J,Wu J R,Zhang J J.Toxicity of ethanol extracts fromLigulariavirgaurea.Pratacultural Science，2017,34(9)：1941-1946.

2016-09-13接受日期：2017-02-20

甘肅省科技支撐計劃(1504JKCA074)；甘肅省科學(xué)院應(yīng)用開發(fā)計劃(2015-JK-04)

李晶(1983-)，女，河南臨潁人，助理研究員，碩士，主要從事植物源農(nóng)藥提取及相關(guān)開發(fā)方面的工作。E-mail:eyre326@163.com

劉錦霞(1974-)，女，甘肅慶陽人，高級研究員，本科，主要從事生物農(nóng)藥資源發(fā)掘及產(chǎn)品開發(fā)。E-mail:liujinx0168@163.com