魏艷麗, Ryder Maarten, 李紀順, 扈進冬, 李紅梅, 李金萍, 楊合同*

(1. 山東省科學院生態(tài)研究所, 山東省應用微生物重點實驗室, 濟南 250014; 2. 澳大利亞阿德萊德大學農(nóng)業(yè)食品葡萄酒學院, 阿德萊德 5064; 3. 山東省科學院, 濟南 250014)

土壤桿菌K1026對櫻桃冠癭病病原菌的抑制作用及田間防治效果

魏艷麗1, Ryder Maarten2, 李紀順1, 扈進冬1, 李紅梅1, 李金萍3, 楊合同1*

(1. 山東省科學院生態(tài)研究所, 山東省應用微生物重點實驗室, 濟南 250014; 2. 澳大利亞阿德萊德大學農(nóng)業(yè)食品葡萄酒學院, 阿德萊德 5064; 3. 山東省科學院, 濟南 250014)

由致病性根癌土壤桿菌Agrobacteriumspp.侵染引起的根癌病對櫻桃等果樹生產(chǎn)造成嚴重的影響。利用雙層平板、胡蘿卜圓盤法和接種指示植物番茄等方法驗證了澳洲生防菌株K1026對2種不同原生物型櫻桃冠癭病病原菌的抑制作用;檢測了不同接種時間對病原菌侵染產(chǎn)生瘤狀組織的影響,結果顯示提前或者在病原菌接種后20 h內(nèi)接種K1026可抑制胡蘿卜產(chǎn)生瘤狀組織;研究了K1026對大櫻桃根癌病的作用機制是產(chǎn)生土壤桿菌素和競爭附著位點;田間試驗表明K1026蘸根處理,對‘中國櫻桃’株系冠癭病的防治效果達81.61%,使發(fā)病率降低至18.13%。

冠癭病; 土壤桿菌K1026; 土壤桿菌素; 生物防治; 田間試驗

植物冠癭病又稱為根癌病,是由根癌土壤桿菌Agrobacteriumspp.引起的一種細菌性病害[1],其寄主范圍廣,達59科142屬300余種,可危害核果類、漿果類、梨果類、堅果類等果樹及觀賞植物根莖部,使植株地上部分發(fā)育受阻,直接影響果樹生產(chǎn),造成重大經(jīng)濟損失[2]。

引起植物根癌病的病原菌主要有A.tumefaciens(原生物Ⅰ型),A.rhizogenes(原生物Ⅱ型),A.vitis(原生物Ⅲ型),根據(jù)它們Ti質(zhì)粒產(chǎn)生的生物堿類型又可以分為胭脂堿型、章魚堿型和土壤桿菌素堿型等三種類型[3]。植物根癌病的生物防治與病原菌的種類和Ti質(zhì)粒類型密切相關,生防菌產(chǎn)生有抑菌活性的土壤桿菌素是它的作用機制之一,但并不是唯一的[4]。如生防菌AgrobacteriumrhizogenesK1026可產(chǎn)生土壤桿菌素A84和A434[4],可以抑制多種致病性土壤桿菌,但對引起葡萄根癌病的原生物Ⅲ型病原菌并沒有抑制作用。鑒于引起植物根癌病的病原菌復雜的致病和生防機制,目前已對重要的寄主植物,如葡萄、櫻花、樹莓[5]、櫻桃、桃樹的病原菌類型進行調(diào)查并分離獲得了相應的生防菌株。

櫻桃Cerasuspseudocerasus是山東泰安地區(qū)的主栽果樹之一,根癌病對其生長造成嚴重的影響,部分苗圃的發(fā)病率接近100%。在前期研究中,本研究室發(fā)現(xiàn)引起山東泰安地區(qū)食用大櫻桃根癌病的病原菌主要為原生物Ⅰ型和Ⅱ型,Ti質(zhì)粒類型為胭脂堿型。本文研究了遺傳工程菌A.rhizogenesK1026菌株對大櫻桃不同原生物類型病原菌的抑制作用,及存在的可能生防機制,并通過田間試驗進行驗證,為生防菌株K1026在山東泰安地區(qū)的應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 供試菌株及植物

1.1.1 供試菌株

生物防治菌株K1026由澳大利亞阿德萊德大學Ryder Maarten教授提供,屬于非致病性發(fā)根土壤桿菌Agrobacteriumrhizogenes。

病原菌C31-32由本實驗室分離自食用大櫻桃根癌組織,屬胭脂堿型Ti質(zhì)粒,原生物Ⅰ型土壤桿菌A.tumefaciens。

病原菌C31-8由本實驗室分離自食用大櫻桃根癌組織,屬胭脂堿型Ti質(zhì)粒,原生物Ⅱ型土壤桿菌A.rhizogenes。

1.1.2 供試植物

供試胡蘿卜根莖購買自菜市場,品種為‘春紅二號’;供試番茄品種為‘佳粉15號’;田間試驗所用的一年生櫻桃苗木為‘中國櫻桃’株系。

1.2 培養(yǎng)基

YMA培養(yǎng)基:K2HPO40.5 g/L、CaCl20.2 g/L、NaCl 0.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、酵母浸粉1 g/L、甘露醇10 g/L、微量元素(1 000×)2 mL,蒸餾水定容至1 000 mL,pH 7.2～7.4,瓊脂15 g,121℃滅菌 20 min后備用。其中微量元素(1 000×)的配方為:FeCl35 g/L、MnCl20.1 g/L、ZnCl20.5 g/L。

產(chǎn)素培養(yǎng)基(Stonier’s培養(yǎng)基)[6]:CaSO4·2H2O 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、NH4NO32.7 g、檸檬酸鉀10 g、谷氨酸鈉2 g、NaH2PO4·2H2O 0.3 g、K2HPO4·3H2O 1.15 g、YMA培養(yǎng)基中微量元素(1 000×)1 mL、蒸餾水定容至1 000 mL,調(diào)整pH7.2,瓊脂15 g,121℃滅菌 20 min,倒平板前加入抽濾滅菌的生物素,使終濃度達到0.2 mg/L。

1.3 方法

1.3.1 平板法檢測K1026產(chǎn)生的土壤桿菌素對櫻桃根癌病原菌的抑制作用

參照Stonier的方法[6],將活化的K1026菌株點接在產(chǎn)素培養(yǎng)基平皿中心,28℃培養(yǎng)2 d后用滅菌棉棒拭去菌苔,用三氯甲烷熏蒸5 min,殺死生長的K1026菌株。

挑取YMA平板上培養(yǎng)24 h的病原菌C31-8和C31-32,分別用無菌水制備成OD600=0.3左右的菌懸液,取1 mL與4 mL含0.6%瓊脂的0.2 mol/L磷酸緩沖液充分混勻后,傾倒至上述培養(yǎng)皿內(nèi),使覆蓋成均勻的薄層,每個病原菌重復3次,置28℃培養(yǎng)3～7 d,觀察抑制圈的出現(xiàn)情況。

1.3.2 胡蘿卜圓盤法檢測K1026對櫻桃根癌病病原菌的抑制作用

選擇新鮮、無損傷的胡蘿卜根莖,用自來水清洗干凈,用70%乙醇擦洗后火焰干燥,橫切成5 mm厚的圓片,用干凈的手術刀片切除胡蘿卜圓片外周部分,放在鋪有水瓊脂的培養(yǎng)皿內(nèi),靠近根端的一面朝上。

挑取在YMA培養(yǎng)基上生長24 h的病原菌C31-8、C31-32和生防菌K1026,分別用無菌水制備成OD600=0.3左右的菌懸液,各吸取30 μL涂于胡蘿卜圓盤上。設4個處理,分別為單獨接種病原菌,病原菌和K1026菌懸液按1∶5的體積比例混合后接種。每個處理重復接種2～3個胡蘿卜片,同時設無菌水對照,25℃保濕兩周左右觀察結果。

1.3.3 番茄接種K1026對根癌病原菌C31-8的抑制作用

取生長50 d左右的健康番茄植株,利用針刺法接種,每株番茄各取3個不同的分枝進行處理。先用75%乙醇表面消毒,用無菌注射針頭輕刺番茄莖部10針左右,造成微小創(chuàng)傷。將分別在YMA培養(yǎng)基上生長24 h的病原菌C31-8和生防菌K1026,用無菌水制備成OD600=0.3左右的菌懸液,用無菌棉蘸取菌懸浮液包裹于創(chuàng)傷處48 h,設3個處理,分別為只接種病原菌,病原菌和生防菌K1026菌懸液按1∶5的體積比例混合后接種,以及無菌水對照。每個分枝連續(xù)處理5個點作為重復, 21 d后調(diào)查創(chuàng)傷處根癌組織的產(chǎn)生情況。

1.3.4 不同接種時間對病原菌瘤狀組織產(chǎn)生的影響

利用胡蘿卜切片法檢測,挑取分別在YMA培養(yǎng)基上生長24 h的病原菌和生防菌K1026,用無菌水制備成OD600=0.3左右的菌懸液,分別于病原菌接種前2 h、接種后0、12、24、36、48、72 h接種。每片胡蘿卜接種病原菌懸液20 μL,接種新鮮制備的K1026菌懸液40 μL,每個處理設3個重復。26℃保濕培養(yǎng)2周,小心切下瘤狀組織并稱重。

1.3.5 生防菌株K1026對中國櫻桃冠癭病田間防治試驗

田間試驗于2016年3月21日至11月30日在山東省泰安市岱岳區(qū)櫻桃育苗地進行,土壤類型為棕壤,pH 6.34,經(jīng)檢測土壤中總氮、磷、鉀和有機質(zhì)的含量分別為1.35、1.24、1.9和22.4 g/kg。試驗地塊有連續(xù)5年的‘中國櫻桃’育苗史,冠癭病發(fā)病4年,試驗在嚴重發(fā)病地塊進行。用無菌水洗下在YMA培養(yǎng)基上生長24～48 h的生防菌K1026,與無菌草炭充分混勻,調(diào)整有效活菌數(shù)2×109cfu/g,制備成K1026草炭制劑。試驗設K1026草炭制劑和清水對照2種處理,小區(qū)面積4.5 m2,每小區(qū)定植15株櫻桃苗,每處理重復8次,隨機區(qū)組排列。

試驗用苗為‘中國櫻桃’一年生健康實生苗,處理前修剪根部,造成傷口利于土壤桿菌侵染,采用蘸根法。用純凈水將K1026草炭制劑100 g稀釋至5 L,將根部分別浸入K1026溶液和清水中30 s,按株行距40 cm定植于小區(qū)中,澆水,其他常規(guī)管理同大田。

11月30日調(diào)查結果時首先統(tǒng)計各小區(qū)苗木成活率,然后小心挖出完整植株,用清水清洗干凈后統(tǒng)計有根癌組織和沒有根癌組織的苗木數(shù)量,最后用鋒利的刀子取下根癌組織,再次清洗、晾干后稱量根癌組織的重量。計算無瘤植株比率、平均每株瘤重和防治效果。

防治效果(%)=(對照平均每株瘤重-處理平均每株瘤重)/對照平均每株瘤重×100。

試驗數(shù)據(jù)用DPS 6.50統(tǒng)計軟件處理,并采用LSD法檢測處理間差異顯著性。

2 結果分析

2.1 生防菌K1026產(chǎn)生的土壤桿菌素對根癌病原菌的抑制作用

K1026在產(chǎn)素培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后可產(chǎn)生大量土壤桿菌素A84[7],抑制病原菌的生長,被測2株病原菌接種后均在K1026接種點附近產(chǎn)生明顯的抑菌圈。C31-32培養(yǎng)24 h后產(chǎn)生的抑菌圈直徑范圍為55～60 mm,邊緣清晰;而C31-8抑菌圈出現(xiàn)較晚,48 h后才在K1026接種點附近觀測到兩個同心抑菌圈(圖1),一個直徑約40 mm左右,邊緣模糊,另一個直徑大于70 mm,邊緣清晰。

圖1 待測病原菌C31-32(左)和C31-8(右)對土壤桿菌素的敏感性Fig.1 Sensitivities of pathogenic agrobacteria C31-32(left)and C31-8(right)to agrocin production by K1026

2.2 K1026對病原菌侵染產(chǎn)生瘤狀組織的影響

胡蘿卜切片接種病原菌2周后,在次生木質(zhì)部周圍均可以產(chǎn)生乳黃色的瘤狀組織,而接種病原菌和生防菌K1026混合懸液的處理,則沒有瘤狀組織產(chǎn)生(圖2)。

圖2 K1026對病原菌侵染產(chǎn)生瘤狀組織的影響Fig.2 Effects of K1026 on tumor tissues caused by pathogenic agrobacteria on carrot discs

以番茄為指示植物,檢測生防菌株K1026對病原菌的抑制作用。結果顯示,番茄莖部接種病原菌C31-8,2周后針刺部位腫大產(chǎn)生不規(guī)則瘤狀組織;病原菌和生防菌K1026混合接種,針刺部位與無菌水對照相比沒有瘤狀組織產(chǎn)生(圖3)。

圖3 K1026對病原菌侵染番茄莖引起的瘤狀組織的影響Fig.3 Effects of K1026 on tumor tissues caused by pathogenic agrobacteria on tomato stems

2.3 K1026不同接種時間對病原菌侵染產(chǎn)生瘤狀組織的影響

接種K1026可顯著減少瘤狀組織的發(fā)生(表1),與只接種病原菌C31-32的處理相比,提前接種K1026對瘤狀組織減少率為95.52%;同時接種生防菌和病原菌瘤狀組織減少率為89.22%。接種病原菌后再接種生防菌K1026也可影響瘤狀組織的產(chǎn)生,但間隔時間越長胡蘿卜切片產(chǎn)生的瘤狀組織越多,即K1026對病原菌的抑制效果越低,間隔48 h后接種K1026,瘤狀組織減少率為56.90%,說明K1026對冠癭病的防治以預防為主,但也存在其他防治機制。

表1K1026不同接種時間對胡蘿卜瘤狀組織產(chǎn)生的影響1)

Table1EffectsofK1026inoculationtimeontumourtissueformationbypathogenicAgrobacteriumC31-32

處理時間/hTreatmenttime平均瘤重/gFreshweightoftumourpercarrot瘤狀組織減少率/%Reductionoftumourtissueformation-2(0．0065±0．0025)d95．520(0．0155±0．0016)d89．2212(0．0240±0．0014)c83．3524(0．0340±0．0064)bc76．3648(0．0620±0．0013)b56．90C31?32only(0．1439±0．0123)a-

1) -2表示接種病原菌前2 h接種生防菌K1026; 0、12、24和48分別表示病原菌接種后用生防菌處理的時間。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示經(jīng)LSD檢驗在0.05水平差異顯著。 -2 represents pre-inoculation of K1026, 2 h before inoculation of the pathogen; 0, 12, 24 and 48 h are different times of addition of biocontrol bacteria K1026 after pathogen inoculation. Different letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

2.4 生防菌株K1026對‘中國櫻桃’冠癭病田間防治效果

K1026對‘中國櫻桃’一年生苗的田間防治試驗分為2個處理,8個重復。結果K1026蘸根處理后定植于含有病原菌的土壤中,8個月后調(diào)查,無瘤健康植株比率提高至81.87%(見圖4),冠癭病發(fā)病率從54.29%降低至18.13%。

提前接種K1026也可減少瘤狀組織大小,從而降低植株感病程度。與清水對照相比,瘤重減少率(即防治效果)可達81.61%。

3 討論

K1026可產(chǎn)生土壤桿菌素A84和A434,對于含有胭脂堿類型Ti質(zhì)粒的土壤桿菌具有明顯的抑制作用[7]。本試驗選用的兩株病原菌分離自山東泰安大櫻桃根癌組織,分屬于原生物Ⅰ型和Ⅱ型,含有胭脂堿類型Ti質(zhì)粒。通過雙層平板、胡蘿卜切片和接種指示植物番茄等3種不同的方法檢測K1026對病原菌的抑制作用結果是一致的。證明K1026能明顯抑制兩株病原菌的生長,其抑制作用除產(chǎn)生土壤桿菌素外,還可以通過營養(yǎng)競爭和定殖侵染位點起作用。

利用Stonier的雙層平板法Pulawska等[8]測定了409株致瘤菌對土壤桿菌素A84的敏感性,發(fā)現(xiàn)約41%的菌株可產(chǎn)生不同大小的抑菌圈。本試驗的2株病原菌經(jīng)測定也可產(chǎn)生兩種不同形式的抑菌圈,C31-32與模式菌株C58相似[9],產(chǎn)生的抑菌圈直徑約55～60 mm,邊緣清晰,推測是由于土壤桿菌素A84的抑制作用;而C31-8可以產(chǎn)生兩個同心抑菌圈,一個邊緣清晰直徑大于60 mm,另一個直徑為40 mm左右,邊緣模糊,推測是由于K1026產(chǎn)生的土壤桿菌素A434的作用。

圖4 K1026制劑對‘中國櫻桃’冠癭病結瘤及根癌組織大小的影響Fig.4 Inhibitory effects of K1026 on incidence of crown gall disease and fresh weight of tumours in ‘Chinese cherry’ rootstock in the field

土壤桿菌對受傷植株產(chǎn)生的分泌物有趨化性,致病菌可以附著到植物細胞表面,在傷口部位存活超過16 h,將遺傳信息片段導入植物創(chuàng)傷中,使正常的植物細胞轉化成腫瘤細胞,進而形成冠癭瘤[10]。致病及無致病土壤桿菌互相競爭有限的附著位點,這種競爭作用是K1026的另一個生防機制。本試驗研究了接種病原菌前后不同時間用K1026處理對病原菌的抑制作用,發(fā)現(xiàn)于接種病原菌前2 h和同時接種處理,瘤重減少率分別為96.77%和82.23%,接種病原菌24 h后再接種K1026,防治效果急劇下降,其生防效果只能依靠產(chǎn)生的土壤桿菌素實現(xiàn)。

以上結果表明提前接種K1026,可較好地抑制病原菌的侵染。因此,在田間試驗過程中采取健康植株蘸根處理,通過修剪根系人為制造傷口,易于K1026進入植物組織,與致病菌競爭附著位點而達到81.61%的防治效果,降低發(fā)病率至18.13%。說明生防菌株K1026可用于櫻桃等核果類果樹根癌病的生物防治。

[1] 李淑平, 張福興, 孫慶田, 等. 櫻桃根癌病研究進展[J]. 煙臺果樹, 2010(2): 7-9.

[2] Kerr A. Biological control of crown gall [J]. Australasian Plant Pathology, 2016, 45(1): 15-18.

[3] Lindstr?m K, Young J P W. International committee on systematics of prokaryotes subcommittee on the taxonomy ofAgrobacteriumandRhizobium[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2011, 61(12): 3089-3093.

[4] Clare B G, Kerr A, Jones D A. Characteristics of the nopaline catabolic plasmid inAgrobacteriumstrains K84 and K1026 used for biological control of crown gall disease [J]. Plasmid, 1990, 23(2): 126-137.

[6] Stonier T.AgrobacteriumtumefaciensConn. Ⅱ. Production of an antibiotic substance [J]. Journal of Bacteriology, 1960, 79: 889-898.

[7] Kim J G, Park Y K, Kim S U, et al. Bases of biocontrol: sequence predicts synthesis and mode of action of agrocin 84, the Trojan Horse antibiotic that controls crown gall [J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2006,103:8846-8851.

[9] Cooksey D A. A spontaneous insertion in the agrocin sensitivity region of the Ti-plasmid ofAgrobacteriumtumefaciensC58[J]. Plasmid, 1986, 16(3): 222-224.

[10] Wang Hongyan, Wang Huimin, Wang Jianhui, et al. The pathogen of crown gall disease on flowing cherry and its sensitivity to strain K1026 [J]. European Journal of Plant Pathology， 2000, 106:475-479.

(責任編輯： 田 喆)

SuppressionofthepathogenofcherrycrowngalldiseasebyAgrobacteriumrhizogenesK1026anditscontroleffectsinthefield

Wei Yanli1, Ryder Maarten2, Li Jishun1, Hu Jindong1, Li Hongmei1, Li Jinping3, Yang Hetong1

(1.InstituteofEcology,ShandongAcademyofSciences,ShandongProvincialKeyLaboratoryofAppliedMicrobiology,Ji’nan250014,China; 2.SchoolofAgriculture,FoodandWine,UniversityofAdelaide,Adelaide5064,Australia; 3.ShandongAcademyofSciences,Ji’nan250014,China)

Crown gall, caused by pathogenicAgrobacteriumspp., is a serious problem in the production of cherry.Agrobacteriumrhizogenesstrain K1026 was introduced from Australia, and has shown a high efficiency in biocontrol of crown gall disease. This research verified the control action of K1026 against two different species (biovars) of crown gall pathogens by three different methods: double layer inhibition test on agar medium, carrot root disc bioassay and tomato stem inoculation. In addition, this study reported the effect of different K1026 inoculation times on tumour formation by pathogenic strains in the carrot disc bioassay. The results showed that K1026 could inhibit the generation of tumor tissues on carrot discs when inoculated up to 24 h after addition of the pathogen. The mechanisms of action of K1026 included the production of agrocin antibiotics (agrocin 84 and agrocin 434) and competition for adsorption and infection sites on the plant tissue. In field trials, strain K1026 demonstrated a mean inhibition of crown gall disease of cherry rootstock ‘Chinese Cherry’ of up to 81.61%, and the incidence of crown gall disease dropped substantially to 18.13%. These results suggest thatA.rhizogenesK1026 can be used for biocontrol of cherry crown gall disease in the field in China.

crown gall disease;AgrobacteriumrhizogenesK1026; agrocin; biological control; field trial

S 436.629

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2017.05.007

2017-02-06

： 2017-03-08

山東省重點研發(fā)計劃(2016GNC113010);山東省外專局“智惠山東”外國專家項目

* 通信作者 E-mail: yanght@sdas.org