許潔+周惠茹+馬君千+董昆明+繆莉

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.060

摘要：對前期研究發(fā)現(xiàn)的1株分離自銀杏樹皮組織的具有良好的抗腫瘤活性內(nèi)生真菌米曲霉菌（Aspergillus oryzae）YX-5菌株的發(fā)酵條件及活性產(chǎn)物穩(wěn)定性進行研究。以發(fā)酵后的菌體干質(zhì)量、粗提物質(zhì)量和粗提物抗腫瘤活性為指標，對YX-5菌株的發(fā)酵溫度、pH值、轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時間等條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最適宜的發(fā)酵條件為溫度25 ℃、pH值7.0、搖床轉(zhuǎn)速110 r/min、發(fā)酵時間7 d。以粗提物的抗腫瘤活性為指標，比較發(fā)酵液粗提物經(jīng)熱處理、酸堿處理、紫外照射和蛋白酶處理后的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)YX-5菌株的活性產(chǎn)物在常溫、中性和酸性環(huán)境中穩(wěn)定性較好，對紫外線和蛋白酶有較強的抗性，但在超過100 ℃高溫條件下或pH值超過9.0的堿性環(huán)境中穩(wěn)定性較差。該菌株粗提物在自然條件下總體穩(wěn)定性較高，不易發(fā)生變化，有利于活性成分分離工作的開展。

關(guān)鍵詞：銀杏；內(nèi)生真菌；抗腫瘤活性；條件優(yōu)化；穩(wěn)定性測定

中圖分類號： Q939.9文獻標志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0226-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-03-17

基金項目：江蘇省研究生科研創(chuàng)新計劃（編號：CXLX12_0918）；揚州大學科技創(chuàng)新培育基金（編號：2015CXJ039）；中國海洋大學海洋藥物教育部重點實驗室開放基金[編號：KLMD（OUC）201203]。

作者簡介：許潔（1993—），女，江蘇宿遷人，碩士研究生，主要從事海洋微生物的多樣性及其天然產(chǎn)物、酶資源的開發(fā)與利用等研究。E-mail：xj930411@qq.com。

通信作者：繆莉，博士，副教授，主要從事海洋微生物資源及生物活性物質(zhì)等研究。E-mail：miaoli@yzu.edu.cn。

[ZK）]

銀杏樹是距今約2億年的幸存古老植物，其藥用價值早在公元前2800年《神農(nóng)本草》上就有記載。銀杏中包含的萜類、黃酮類、聚異戊烯醇類等170余種化學成分，具有改善腦血管末梢和腦循環(huán)、抗菌消炎、抗病毒、抗癌、解痙抗過敏等重要的藥理作用，以及延緩衰老、美容健發(fā)等保健作用[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，銀杏提取物具有良好的抗腫瘤活性，馮小龍等的研究結(jié)果均表明，銀杏提取物對多種腫瘤細胞具有較好的抑制作用，還能提高腫瘤組織對化療的敏感性，進行天然免疫調(diào)節(jié)，對癌癥治療起輔助作用[2-7]。然而，銀杏內(nèi)酯含量低、分離純化困難及銀杏葉中銀杏酚酸類有毒物質(zhì)不易控制等問題限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應用[8]。許多研究表明，植物內(nèi)生真菌對某些次生代謝物的合成與轉(zhuǎn)化具有與寄主共同的機制和途徑。目前已有學者利用這一特性進行銀杏內(nèi)生真菌的研究，分別從其代謝產(chǎn)物中分離出黃酮類及內(nèi)酯類抗腫瘤活性物質(zhì)[9]，以更好地適應工業(yè)生產(chǎn)。內(nèi)生真菌發(fā)酵過程中，不同的培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速等都是十分重要的影響因素[10]，真菌產(chǎn)出代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量隨發(fā)酵條件變化有明顯的差異，為了節(jié)省能源、降低成本，發(fā)酵條件的優(yōu)化就顯得十分必要。本研究中所用的內(nèi)生真菌 YX-5菌株分離自銀杏樹皮組織，前期的研究結(jié)果顯示其代謝產(chǎn)物具有顯著的抗腫瘤活性[11]，采用ITS序列分析將其鑒定為米曲霉[12]。本研究對該菌株的發(fā)酵溫度、pH值、轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時間等條件進行優(yōu)化，并對該菌株代謝產(chǎn)物在熱處理、酸堿處理、紫外照射以及蛋白酶處理下的穩(wěn)定性進行研究，為進一步的大規(guī)模發(fā)酵和活性物質(zhì)的分離提取提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

米曲霉菌（Aspergillus oryzae）YX-5菌株，為筆者實驗室保存，是分離自銀杏樹皮組織的內(nèi)生真菌。采用的指示腫瘤細胞為人宮頸癌HeLa細胞，購自上海復祥生物科技有限公司。

細胞培養(yǎng)基（1 L）：1袋RPMI-1640細胞培養(yǎng)基，加入10%滅活的新生牛血清和1%二抗母液，用0.24% NaHCO3、0.2%羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液（HEPES）調(diào)節(jié)pH值至 7.1～7.3，經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜過濾，濾液于4 ℃保存。

GPY培養(yǎng)基（1 L）：20.0 g葡萄糖；5.0 g蛋白胨；5.0 g酵母浸膏。

1.2試驗方法

1.2.1發(fā)酵條件優(yōu)化

發(fā)酵條件優(yōu)化試驗共設(shè)置4個因素：發(fā)酵溫度、pH值、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時間。溫度分別設(shè)置為20、25、30、35 ℃；pH值分別設(shè)置為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0；轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為0、80、110、140、170 r/min；時間分別設(shè)置為3、5、7、9、13 d。將活化所得菌株挖塊接種于 50 mL GPY培養(yǎng)基中，在各條件下發(fā)酵培養(yǎng)后，用8層紗布過濾，收集菌絲烘干稱質(zhì)量，濾液經(jīng)乙酸乙酯萃取旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后稱取粗提物質(zhì)量，采用SRB法[13]測定粗提物的抗腫瘤細胞活性，測試濃度為12.5 μg/mL。按照生長情況和粗提物抗腫瘤細胞活性情況確定最佳發(fā)酵條件。

1.2.2活性物質(zhì)穩(wěn)定性研究

將活化所得的YX-5菌株挖塊接種于50 mL GPY培養(yǎng)基中，于25 ℃振蕩培養(yǎng)5 d后過濾掉菌體，濾液按熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、UV穩(wěn)定性、蛋白酶穩(wěn)定性作不同的處理，采用SRB法[13]測定粗提物的抗腫瘤細胞活性，測試濃度為12.5 μg/mL。以抗腫瘤活性為指標，研究其活性物質(zhì)的穩(wěn)定性。

熱穩(wěn)定性：將濾液分別置于40、60、80、100、120 ℃下處理2 h后取出冷卻，以未經(jīng)加熱處理的發(fā)酵液為對照。

酸堿穩(wěn)定性：分別用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH處理發(fā)酵液，使其pH值分別為酸性的3.0、4.0和堿性的10.0、11.0，靜置12 h，以未經(jīng)處理的發(fā)酵液為對照。endprint

UV穩(wěn)定性：將濾液置于254 nm紫外分析儀下分別照射30、60、90、120、150 min，以未經(jīng)紫外照射處理的發(fā)酵液為對照。

抗蛋白酶穩(wěn)定性：在一份濾液中加入5 mg蛋白酶K于水浴鍋中58 ℃孵育2 h，pH值調(diào)為8.0，另一份加入5 mg胰蛋白酶于水浴鍋中37 ℃孵育2 h，pH值調(diào)為8.0，以未經(jīng)蛋白酶處理的發(fā)酵液為對照。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1發(fā)酵溫度

由表1可知，YX-5菌株在30 ℃時菌體生長情況最佳，其次為25 ℃，但2種情況下差別不明顯。同時，在25 ℃時粗提物質(zhì)量和抗腫瘤活性均達到最大值。溫度過低（20 ℃）和過高（35 ℃）時，都對菌體的生長、代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生以及代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性有抑制作用。因此，25 ℃為最適宜的發(fā)酵溫度。

2.1.2培養(yǎng)基pH值

由表2可知，YX-5菌株在pH值為5.0時菌體質(zhì)量最大，達0.298 g，pH值為6.0時次之，隨著pH值降低或升高，菌體質(zhì)量都有所減小，在pH值為11.0時菌體質(zhì)量最小，為0.215 g。而粗提物質(zhì)量隨著pH值升高呈先增加后降低的趨勢，pH值為7.0時粗提物質(zhì)量為8.4 mg，pH值為8.0時粗提物質(zhì)量達最大值，為8.6 mg，之后粗提物質(zhì)量明顯下降，當pH值為11.0時粗提物質(zhì)量只有3.0 mg。粗提物的抗腫瘤活性在pH值為3.0、7.0時最高，抗腫瘤細胞抑制率均為99.22%，酸性和中性條件對YX-5活性物質(zhì)的產(chǎn)生都較為適宜，此時所測得的抗腫瘤細胞抑制率均高于90%，但是當pH值在9.0及以上時，其抗腫瘤細胞抑制率明顯下降。綜合菌株生長、粗提物質(zhì)量與抗腫瘤活性來看，YX-5菌株發(fā)酵的最佳pH值為7.0。

2.1.3搖床轉(zhuǎn)速

發(fā)酵時通氣量的控制可根據(jù)搖床轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)速越高，通氣量越大。由表3可知，YX-5菌株在所測試的各轉(zhuǎn)速下都能較好地生長和產(chǎn)代謝產(chǎn)物，其抗腫瘤活性也差別不大， 對抗腫瘤細胞的抑制率均大于90%， 表明溶解氧的含量對該菌株的生長和代謝影響較小。綜合菌體生長情況和粗提物產(chǎn)量來看，搖床轉(zhuǎn)速為110 r/min時相對較好。

2.1.4發(fā)酵時間

由表4可知，YX-5菌株的菌體質(zhì)量和粗提物質(zhì)量都隨著發(fā)酵時間的延長而增加，發(fā)酵前期的7 d內(nèi)增長速度較快，菌體質(zhì)量達到0.358 g，粗提物質(zhì)量為 6.7 mg，7 d之后增長速度變慢，到后期幾乎保持不變。粗提物抗腫瘤細胞的抑制率隨發(fā)酵時間的延長呈先增加后降低的趨勢，發(fā)酵7 d時抗腫瘤細胞抑制率最高，達93.36%，發(fā)酵 7 d 后抑制率開始下降，發(fā)酵13 d時，抗腫瘤細胞抑制率下降到82.45%。綜合來看，YX-5菌株以發(fā)酵7 d最為適宜。

2.2活性物質(zhì)穩(wěn)定性研究

2.2.1熱穩(wěn)定性測定

以粗提物對腫瘤細胞的抑制率為試驗指標，測定活性產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性。對照組（20 ℃）的發(fā)酵液粗提物對腫瘤細胞的抑制率達97.27%，經(jīng)40、60、80 ℃處理的發(fā)酵液粗提物對腫瘤細胞的抑制率沒有明顯變化，當溫度為100、120 ℃時，抑制率明顯下降（圖1）。表明YX-5菌株的活性產(chǎn)物在100 ℃內(nèi)比較穩(wěn)定，但在100 ℃以上的高溫環(huán)境下穩(wěn)定性降低。

2.2.2酸堿穩(wěn)定性測定

pH值優(yōu)化試驗結(jié)果顯示，YX-5菌株在酸性和中性環(huán)境中發(fā)酵，其粗提物的抗腫瘤活性均能達到90%以上， 而在 pH 值高于 9.0時， 抗腫瘤活性明顯下

降，粗提物的質(zhì)量也相應下降（表2）。為了明確粗提物抗腫瘤活性下降的原因是活性物質(zhì)的產(chǎn)量變少還是結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，對自然pH值條件下發(fā)酵后的發(fā)酵液進行酸堿處理，調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值為3.0、4.0、10.0、11.0，而未經(jīng)處理的對照組發(fā)酵液pH值為6.5，分別對各組發(fā)酵液的粗提物進行抗腫瘤活性測試。由圖2可知，酸處理后粗提物對腫瘤細胞的抑制率和未處理的相比并無明顯區(qū)別，而堿處理后抑制率明顯下降，pH值為11.0時抑制率降為60.99%。表明YX-5菌株的活性產(chǎn)物在中性和酸性環(huán)境下穩(wěn)定性較好，而在堿性環(huán)境下則穩(wěn)定性下降。

2.2.3UV穩(wěn)定性測定

由圖3可知，YX-5菌株的活性產(chǎn)物有較強的抗紫外線照射能力，不同紫外線照射時間處理的粗提物對腫瘤細胞的抑制率都維持在97%～99%之間，變化范圍較小，且與未經(jīng)紫外照射的對照組相比幾乎沒有差異。

2.2.4抗蛋白酶穩(wěn)定性測定

YX-5菌株的發(fā)酵液分別經(jīng)100 μg/mL蛋白酶K、100 μg/mL胰蛋白酶處理，測試其粗提物的抗腫瘤活性。由圖4可知，經(jīng)胰蛋白酶處理的粗提物對腫瘤細胞的抑制率下降到85.69%，降幅為11.58%，而經(jīng)蛋白酶K處理的僅下降了5.14%。表明真菌YX-5菌株的活性物質(zhì)抗蛋白酶活性較好。

3討論與結(jié)論

對于不同的菌株來說，其發(fā)酵條件不盡相同，選擇合適的發(fā)酵條件，可以在后期的大規(guī)模發(fā)酵中降低成本，減少工作量。銀杏內(nèi)生真菌球毛殼菌SG0016菌株液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度23 ℃、培養(yǎng)時間7 d、裝液量 100 mL/250 mL、接種量10%[14]，而另一株銀杏內(nèi)生真菌G10適宜的發(fā)酵溫度為24.5 ℃，pH值為7.5，轉(zhuǎn)速為 180 r/min[15]。本研究結(jié)果顯示，YX-5菌株的生長和活性物質(zhì)的產(chǎn)生對培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、pH值的要求不高，一般的發(fā)酵條件均能滿足其生長和代謝。

內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性隨菌株不同而各有差異，在郝雙紅等的研究中發(fā)現(xiàn)，一般內(nèi)生真菌活性產(chǎn)物均不耐酸堿與高溫[16-17]。而對YX-5菌株的提取物進行穩(wěn)定性測試，結(jié)果表明，無論是高溫、酸處理、紫外線照射還是蛋白酶處理，對其抗腫瘤活性的影響都不大，僅在堿性條件（pH值>9.0）下其活性會發(fā)生較大幅度的下降，因此，只需盡量避免強堿就可保持其活性產(chǎn)物的穩(wěn)定性。該菌株粗提物總體穩(wěn)定性較高，在自然條件下不易發(fā)生變化，這對后期的活性成分分離工作十分有利。endprint

本研究中以銀杏內(nèi)生真菌YX-5菌株的生長情況及其活性物質(zhì)的產(chǎn)量和抗腫瘤活性為指標，對其發(fā)酵條件及提取物的穩(wěn)定性進行了研究，確定了YX-5菌株的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度25 ℃、pH值7.0、搖床轉(zhuǎn)速110 r/min、發(fā)酵時間7 d，此時提取物的抗腫瘤活性具有較高的穩(wěn)定性。

[HS2]參考文獻：

[1][ZK（#]杜文明，徐克涵. 銀杏的營養(yǎng)和藥用價值[J]. 河北林業(yè)科技，2002（3）：48.

[2]馮小龍. 銀杏葉總黃酮抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與藥代動力學研究[D]. 石家莊：河北醫(yī)科大學，2009.

[3]王秀鋒，馬瑞陽，景作乾，等. 銀杏葉提取物抗腫瘤機制研究進展[J]. 微生物學雜志，2011，31（6）：76-79.

[4]蔣曉蕓，錢立平，孫大裕. 銀杏提取物抗腫瘤作用的研究進展[J]. 胃腸病學和肝病學雜志，2009，18（8）：773-776.

[5]Koltermann A，Liebl J，F(xiàn)ürst R，et al. Ginkgo biloba extract EGb 761 exerts anti-angiogenic effects via activation of tyrosine phosphatases[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine，2009，13（8B）：2122-2130.[ZK）][HT][HJ][HT][FL）]

[KH*4D]

[HT8.]

[6][ZK（#]Kim K S，Rhee K H，Yoon J H，et al. Ginkgo biloba extract （EGb 761） induces apoptosis by the activation of caspase-3 in oral cavity cancer cells[J]. Oral Oncology，2005，41（4）：383-389.

[7]Zhou C，Li X，Du W，et al. Antitumor effects of ginkgolic acid in human cancer cell occur via cell cycle arrest and decrease the Bcl-2/Bax ratio to induce apoptosis[J]. Chemotherapy，2010，56（5）：393-402.

[8]嚴鑄云，龐蕾，羅靜，等. 銀杏內(nèi)生真菌菌種的分離及鑒定[J]. 華西藥學雜志，2006，21（5）：425-427.

[9]王梅霞，陳雙林，霍娟. 一株銀杏內(nèi)生真菌的分離及其產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的初步研究[J]. 工業(yè)微生物，2004，34（2）：15-18.[ZK）]

[10][ZK（#]苗莉云，張鵬，周蓬蓬，等. 產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌枝狀枝孢霉MD2的發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 微生物學通報，2013，40（6）：1033-1040.

[11]繆莉，王元元，朱磊，等. 四種植物內(nèi)生真菌的分離及其抗腫瘤活性的篩選[J]. 微生物學通報，2009，36（6）：865-869.

[12]馬君千，王雪玲，繆莉，等. 共附生微生物抗腫瘤活性菌的篩選與鑒定[J]. 生物技術(shù)通報，2012（9）：137-142.

[13]黃銀久，宋寶安，金林紅，等. SRB法和MTT法抗腫瘤藥物篩選結(jié)果相關(guān)性研究[J]. 生物學雜志，2009，26（4）：13-16.

[14]葛飛，石貝杰，高櫻萍，等. 一株高抗氧化活性銀杏內(nèi)生真菌SG0016的鑒定及其培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]. 西北植物學報，2015，35（2）：403-409.

[15]包飛. 產(chǎn)銀杏內(nèi)酯B內(nèi)生真菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2008.

[16]郝雙紅，王緒昆，殷培軍，等. 側(cè)柏內(nèi)生真菌G21代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 農(nóng)藥，2015（6）：414-417.

[17]譚友莉，馬云桐，嚴鑄云，等. 三角葉黃連內(nèi)生真菌產(chǎn)物紅色色素的穩(wěn)定性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25（8）：1101-1106.endprint