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        1株抗腫瘤銀杏內生真菌的發(fā)酵條件及活性產物穩(wěn)定性研究

        2017-09-28 08:15:32許潔周惠茹馬君千董昆明繆莉
        江蘇農業(yè)科學 2017年13期
        關鍵詞:內生真菌銀杏

        許潔+周惠茹+馬君千+董昆明+繆莉

        doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.060

        摘要:對前期研究發(fā)現(xiàn)的1株分離自銀杏樹皮組織的具有良好的抗腫瘤活性內生真菌米曲霉菌(Aspergillus oryzae)YX-5菌株的發(fā)酵條件及活性產物穩(wěn)定性進行研究。以發(fā)酵后的菌體干質量、粗提物質量和粗提物抗腫瘤活性為指標,對YX-5菌株的發(fā)酵溫度、pH值、轉速和發(fā)酵時間等條件進行優(yōu)化。結果表明,最適宜的發(fā)酵條件為溫度25 ℃、pH值7.0、搖床轉速110 r/min、發(fā)酵時間7 d。以粗提物的抗腫瘤活性為指標,比較發(fā)酵液粗提物經(jīng)熱處理、酸堿處理、紫外照射和蛋白酶處理后的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)YX-5菌株的活性產物在常溫、中性和酸性環(huán)境中穩(wěn)定性較好,對紫外線和蛋白酶有較強的抗性,但在超過100 ℃高溫條件下或pH值超過9.0的堿性環(huán)境中穩(wěn)定性較差。該菌株粗提物在自然條件下總體穩(wěn)定性較高,不易發(fā)生變化,有利于活性成分分離工作的開展。

        關鍵詞:銀杏;內生真菌;抗腫瘤活性;條件優(yōu)化;穩(wěn)定性測定

        中圖分類號: Q939.9文獻標志碼: A[HK]

        文章編號:1002-1302(2017)13-0226-03[HS)][HT9.SS]

        收稿日期:2016-03-17

        基金項目:江蘇省研究生科研創(chuàng)新計劃(編號:CXLX12_0918);揚州大學科技創(chuàng)新培育基金(編號:2015CXJ039);中國海洋大學海洋藥物教育部重點實驗室開放基金[編號:KLMD(OUC)201203]。

        作者簡介:許潔(1993—),女,江蘇宿遷人,碩士研究生,主要從事海洋微生物的多樣性及其天然產物、酶資源的開發(fā)與利用等研究。E-mail:xj930411@qq.com。

        通信作者:繆莉,博士,副教授,主要從事海洋微生物資源及生物活性物質等研究。E-mail:miaoli@yzu.edu.cn。

        [ZK)]

        銀杏樹是距今約2億年的幸存古老植物,其藥用價值早在公元前2800年《神農本草》上就有記載。銀杏中包含的萜類、黃酮類、聚異戊烯醇類等170余種化學成分,具有改善腦血管末梢和腦循環(huán)、抗菌消炎、抗病毒、抗癌、解痙抗過敏等重要的藥理作用,以及延緩衰老、美容健發(fā)等保健作用[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),銀杏提取物具有良好的抗腫瘤活性,馮小龍等的研究結果均表明,銀杏提取物對多種腫瘤細胞具有較好的抑制作用,還能提高腫瘤組織對化療的敏感性,進行天然免疫調節(jié),對癌癥治療起輔助作用[2-7]。然而,銀杏內酯含量低、分離純化困難及銀杏葉中銀杏酚酸類有毒物質不易控制等問題限制了其在工業(yè)生產中的應用[8]。許多研究表明,植物內生真菌對某些次生代謝物的合成與轉化具有與寄主共同的機制和途徑。目前已有學者利用這一特性進行銀杏內生真菌的研究,分別從其代謝產物中分離出黃酮類及內酯類抗腫瘤活性物質[9],以更好地適應工業(yè)生產。內生真菌發(fā)酵過程中,不同的培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、搖床轉速等都是十分重要的影響因素[10],真菌產出代謝產物的產量隨發(fā)酵條件變化有明顯的差異,為了節(jié)省能源、降低成本,發(fā)酵條件的優(yōu)化就顯得十分必要。本研究中所用的內生真菌 YX-5菌株分離自銀杏樹皮組織,前期的研究結果顯示其代謝產物具有顯著的抗腫瘤活性[11],采用ITS序列分析將其鑒定為米曲霉[12]。本研究對該菌株的發(fā)酵溫度、pH值、轉速和發(fā)酵時間等條件進行優(yōu)化,并對該菌株代謝產物在熱處理、酸堿處理、紫外照射以及蛋白酶處理下的穩(wěn)定性進行研究,為進一步的大規(guī)模發(fā)酵和活性物質的分離提取提供參考。

        1材料與方法

        1.1試驗材料

        米曲霉菌(Aspergillus oryzae)YX-5菌株,為筆者實驗室保存,是分離自銀杏樹皮組織的內生真菌。采用的指示腫瘤細胞為人宮頸癌HeLa細胞,購自上海復祥生物科技有限公司。

        細胞培養(yǎng)基(1 L):1袋RPMI-1640細胞培養(yǎng)基,加入10%滅活的新生牛血清和1%二抗母液,用0.24% NaHCO3、0.2%羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液(HEPES)調節(jié)pH值至 7.1~7.3,經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜過濾,濾液于4 ℃保存。

        GPY培養(yǎng)基(1 L):20.0 g葡萄糖;5.0 g蛋白胨;5.0 g酵母浸膏。

        1.2試驗方法

        1.2.1發(fā)酵條件優(yōu)化

        發(fā)酵條件優(yōu)化試驗共設置4個因素:發(fā)酵溫度、pH值、搖床轉速、發(fā)酵時間。溫度分別設置為20、25、30、35 ℃;pH值分別設置為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0;轉速分別設置為0、80、110、140、170 r/min;時間分別設置為3、5、7、9、13 d。將活化所得菌株挖塊接種于 50 mL GPY培養(yǎng)基中,在各條件下發(fā)酵培養(yǎng)后,用8層紗布過濾,收集菌絲烘干稱質量,濾液經(jīng)乙酸乙酯萃取旋轉蒸發(fā)后稱取粗提物質量,采用SRB法[13]測定粗提物的抗腫瘤細胞活性,測試濃度為12.5 μg/mL。按照生長情況和粗提物抗腫瘤細胞活性情況確定最佳發(fā)酵條件。

        1.2.2活性物質穩(wěn)定性研究

        將活化所得的YX-5菌株挖塊接種于50 mL GPY培養(yǎng)基中,于25 ℃振蕩培養(yǎng)5 d后過濾掉菌體,濾液按熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、UV穩(wěn)定性、蛋白酶穩(wěn)定性作不同的處理,采用SRB法[13]測定粗提物的抗腫瘤細胞活性,測試濃度為12.5 μg/mL。以抗腫瘤活性為指標,研究其活性物質的穩(wěn)定性。

        熱穩(wěn)定性:將濾液分別置于40、60、80、100、120 ℃下處理2 h后取出冷卻,以未經(jīng)加熱處理的發(fā)酵液為對照。

        酸堿穩(wěn)定性:分別用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH處理發(fā)酵液,使其pH值分別為酸性的3.0、4.0和堿性的10.0、11.0,靜置12 h,以未經(jīng)處理的發(fā)酵液為對照。endprint

        UV穩(wěn)定性:將濾液置于254 nm紫外分析儀下分別照射30、60、90、120、150 min,以未經(jīng)紫外照射處理的發(fā)酵液為對照。

        抗蛋白酶穩(wěn)定性:在一份濾液中加入5 mg蛋白酶K于水浴鍋中58 ℃孵育2 h,pH值調為8.0,另一份加入5 mg胰蛋白酶于水浴鍋中37 ℃孵育2 h,pH值調為8.0,以未經(jīng)蛋白酶處理的發(fā)酵液為對照。

        2結果與分析

        2.1發(fā)酵條件優(yōu)化

        2.1.1發(fā)酵溫度

        由表1可知,YX-5菌株在30 ℃時菌體生長情況最佳,其次為25 ℃,但2種情況下差別不明顯。同時,在25 ℃時粗提物質量和抗腫瘤活性均達到最大值。溫度過低(20 ℃)和過高(35 ℃)時,都對菌體的生長、代謝產物的產生以及代謝產物的抗腫瘤活性有抑制作用。因此,25 ℃為最適宜的發(fā)酵溫度。

        2.1.2培養(yǎng)基pH值

        由表2可知,YX-5菌株在pH值為5.0時菌體質量最大,達0.298 g,pH值為6.0時次之,隨著pH值降低或升高,菌體質量都有所減小,在pH值為11.0時菌體質量最小,為0.215 g。而粗提物質量隨著pH值升高呈先增加后降低的趨勢,pH值為7.0時粗提物質量為8.4 mg,pH值為8.0時粗提物質量達最大值,為8.6 mg,之后粗提物質量明顯下降,當pH值為11.0時粗提物質量只有3.0 mg。粗提物的抗腫瘤活性在pH值為3.0、7.0時最高,抗腫瘤細胞抑制率均為99.22%,酸性和中性條件對YX-5活性物質的產生都較為適宜,此時所測得的抗腫瘤細胞抑制率均高于90%,但是當pH值在9.0及以上時,其抗腫瘤細胞抑制率明顯下降。綜合菌株生長、粗提物質量與抗腫瘤活性來看,YX-5菌株發(fā)酵的最佳pH值為7.0。

        2.1.3搖床轉速

        發(fā)酵時通氣量的控制可根據(jù)搖床轉速來調節(jié),轉速越高,通氣量越大。由表3可知,YX-5菌株在所測試的各轉速下都能較好地生長和產代謝產物,其抗腫瘤活性也差別不大, 對抗腫瘤細胞的抑制率均大于90%, 表明溶解氧的含量對該菌株的生長和代謝影響較小。綜合菌體生長情況和粗提物產量來看,搖床轉速為110 r/min時相對較好。

        2.1.4發(fā)酵時間

        由表4可知,YX-5菌株的菌體質量和粗提物質量都隨著發(fā)酵時間的延長而增加,發(fā)酵前期的7 d內增長速度較快,菌體質量達到0.358 g,粗提物質量為 6.7 mg,7 d之后增長速度變慢,到后期幾乎保持不變。粗提物抗腫瘤細胞的抑制率隨發(fā)酵時間的延長呈先增加后降低的趨勢,發(fā)酵7 d時抗腫瘤細胞抑制率最高,達93.36%,發(fā)酵 7 d 后抑制率開始下降,發(fā)酵13 d時,抗腫瘤細胞抑制率下降到82.45%。綜合來看,YX-5菌株以發(fā)酵7 d最為適宜。

        2.2活性物質穩(wěn)定性研究

        2.2.1熱穩(wěn)定性測定

        以粗提物對腫瘤細胞的抑制率為試驗指標,測定活性產物的熱穩(wěn)定性。對照組(20 ℃)的發(fā)酵液粗提物對腫瘤細胞的抑制率達97.27%,經(jīng)40、60、80 ℃處理的發(fā)酵液粗提物對腫瘤細胞的抑制率沒有明顯變化,當溫度為100、120 ℃時,抑制率明顯下降(圖1)。表明YX-5菌株的活性產物在100 ℃內比較穩(wěn)定,但在100 ℃以上的高溫環(huán)境下穩(wěn)定性降低。

        2.2.2酸堿穩(wěn)定性測定

        pH值優(yōu)化試驗結果顯示,YX-5菌株在酸性和中性環(huán)境中發(fā)酵,其粗提物的抗腫瘤活性均能達到90%以上, 而在 pH 值高于 9.0時, 抗腫瘤活性明顯下

        降,粗提物的質量也相應下降(表2)。為了明確粗提物抗腫瘤活性下降的原因是活性物質的產量變少還是結構不穩(wěn)定,對自然pH值條件下發(fā)酵后的發(fā)酵液進行酸堿處理,調節(jié)發(fā)酵液的pH值為3.0、4.0、10.0、11.0,而未經(jīng)處理的對照組發(fā)酵液pH值為6.5,分別對各組發(fā)酵液的粗提物進行抗腫瘤活性測試。由圖2可知,酸處理后粗提物對腫瘤細胞的抑制率和未處理的相比并無明顯區(qū)別,而堿處理后抑制率明顯下降,pH值為11.0時抑制率降為60.99%。表明YX-5菌株的活性產物在中性和酸性環(huán)境下穩(wěn)定性較好,而在堿性環(huán)境下則穩(wěn)定性下降。

        2.2.3UV穩(wěn)定性測定

        由圖3可知,YX-5菌株的活性產物有較強的抗紫外線照射能力,不同紫外線照射時間處理的粗提物對腫瘤細胞的抑制率都維持在97%~99%之間,變化范圍較小,且與未經(jīng)紫外照射的對照組相比幾乎沒有差異。

        2.2.4抗蛋白酶穩(wěn)定性測定

        YX-5菌株的發(fā)酵液分別經(jīng)100 μg/mL蛋白酶K、100 μg/mL胰蛋白酶處理,測試其粗提物的抗腫瘤活性。由圖4可知,經(jīng)胰蛋白酶處理的粗提物對腫瘤細胞的抑制率下降到85.69%,降幅為11.58%,而經(jīng)蛋白酶K處理的僅下降了5.14%。表明真菌YX-5菌株的活性物質抗蛋白酶活性較好。

        3討論與結論

        對于不同的菌株來說,其發(fā)酵條件不盡相同,選擇合適的發(fā)酵條件,可以在后期的大規(guī)模發(fā)酵中降低成本,減少工作量。銀杏內生真菌球毛殼菌SG0016菌株液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度23 ℃、培養(yǎng)時間7 d、裝液量 100 mL/250 mL、接種量10%[14],而另一株銀杏內生真菌G10適宜的發(fā)酵溫度為24.5 ℃,pH值為7.5,轉速為 180 r/min[15]。本研究結果顯示,YX-5菌株的生長和活性物質的產生對培養(yǎng)溫度、轉速、pH值的要求不高,一般的發(fā)酵條件均能滿足其生長和代謝。

        內生真菌代謝產物的穩(wěn)定性隨菌株不同而各有差異,在郝雙紅等的研究中發(fā)現(xiàn),一般內生真菌活性產物均不耐酸堿與高溫[16-17]。而對YX-5菌株的提取物進行穩(wěn)定性測試,結果表明,無論是高溫、酸處理、紫外線照射還是蛋白酶處理,對其抗腫瘤活性的影響都不大,僅在堿性條件(pH值>9.0)下其活性會發(fā)生較大幅度的下降,因此,只需盡量避免強堿就可保持其活性產物的穩(wěn)定性。該菌株粗提物總體穩(wěn)定性較高,在自然條件下不易發(fā)生變化,這對后期的活性成分分離工作十分有利。endprint

        本研究中以銀杏內生真菌YX-5菌株的生長情況及其活性物質的產量和抗腫瘤活性為指標,對其發(fā)酵條件及提取物的穩(wěn)定性進行了研究,確定了YX-5菌株的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度25 ℃、pH值7.0、搖床轉速110 r/min、發(fā)酵時間7 d,此時提取物的抗腫瘤活性具有較高的穩(wěn)定性。

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