何燦+周易+葛曦雨+曲瑞丹+嚴文娟+王文君+高紅亮+黃靜

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.044

摘要：通過對苯酚-次氯酸鹽法（試管體系）反應體系微量化，借助酶標儀動態(tài)檢測96孔板中蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶與底物產(chǎn)生氨的最大速度Δmaxv，對于不同濃度的標準PG樣品與不同酶活的發(fā)酵液，Δmaxv與酶活間呈顯著正相關（r=0.999、r=0.890），故用Δmaxv代替酶活進行快速測定。選用96孔板作為快速測量體系，標準PG樣品與發(fā)酵液在96孔板內(nèi)部60孔中Δmaxv變異系數(shù)分別為10%、18%。利用該方法進行亞硝酸鈉（nitrite，NIT）誘變初篩，0.6 mg/mL 的NIT處理109 CFU/mL菌液20 min，涂板后篩選400株菌株樣本，利用該方法最終得到1株是出發(fā)菌株酶活1.825倍且穩(wěn)定性良好的菌株，可繼續(xù)作為出發(fā)菌株應用于后續(xù)誘變篩選工作中。該方法可以準確、快速地提高誘變初篩的效率，為以后的育種工作奠定了基礎。

關鍵詞：苯酚-次氯酸鹽法；快速微量化；Δmaxv；蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶

中圖分類號： TS201.3文獻標志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0153-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-01-28

基金項目：國家自然科學基金（編號：31170920）；大夏大學生科研基金項目（編號：2014DX-333）。

作者簡介：何燦（1992—），女，安徽六安人，碩士研究生，主要從事食品微生物研究。E-mail：hc13524170366@163.com。

通信作者：黃靜，博士，副教授，主要從事食品微生物研究。E-mail：jhuang@ecnu.bio.edu.cn。

[ZK）]

植物蛋白如大豆蛋白、小麥蛋白和玉米蛋白等在食品工業(yè)中應用非常廣泛。但由于大部分植物蛋白在弱酸性環(huán)境中（大多數(shù)食品系統(tǒng)的pH范圍）存在溶解性差、穩(wěn)定性低的問題，造成其應用范圍受到了限制[1]。采用蛋白質(zhì)脫酰胺法對植物蛋白進行改性，增強其相關功能特性，擴大其在食品領域的應用是目前熱門的研究方向[1-3]。蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶（protein-glutaminase，PG）是一種能夠催化L-β-谷氨酰胺殘基，生成L-谷氨酸和氨的酶，并且對于天冬酰胺殘基以及游離的谷氨酰胺殘基的酰胺鍵沒有作用[4]，相比較于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶以及肽谷氨酰胺酶具有無蛋白交聯(lián)、無副作用等優(yōu)點[5]。目前PG已應用到小麥蛋白、米谷蛋白、麥麩蛋白等多種蛋白的改性試驗中，試驗結果證明其可明顯地增強蛋白質(zhì)脫酰胺程度[6]。

2000年Yamaguchi等從解朊金黃桿菌（Chryseobacterium proteolyticum）9670T中首次發(fā)現(xiàn)了PG[7]。由于產(chǎn)PG的菌株稀少，世界上對PG的研究主要為該酶的結構和應用[8]。近年來，華東師范大學微生物實驗室致力于產(chǎn)PG菌種研究，從全國各地土壤中一共篩選到9株產(chǎn)PG的細菌，經(jīng)鑒定，其中7株為產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes），1株為解朊金黃桿菌（C.proteolyticum），1株為黏金黃桿菌（C.gleum），其酶活大小在0.10～0.72 U/mL之間，其中2013年從四川省土樣中篩選分離到的1株能夠產(chǎn)生PG的解朊金黃桿菌Y8-10-1，經(jīng)鑒定與已被批準可用于食品工業(yè)生產(chǎn)的菌株9670T為同一來源菌株，兩者酶活均為0.40 U/mL左右[9]，低酶活限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的大規(guī)模應用。

筆者實驗室欲通過化學誘變、紫外誘變等傳統(tǒng)育種方法，以Y8-10-1作為出發(fā)菌株得到高產(chǎn)PG菌株，但由于傳統(tǒng)誘變方法操作復雜、篩選樣本量大，并且由于國際通用的測定PG酶活的苯酚-次氯酸鹽方法[10-11]試管用量大、操作復雜、耗時長等缺點難以在初篩過程中大規(guī)模應用。因此，準確、快速微量化測定PG酶活方法的建立在高通量篩選高產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶過程中有著重要的意義。

本試驗基于苯酚-次氯酸鹽方法，借助酶標儀快速檢測功能，利用PG與底物反應過程中產(chǎn)生氨的顯色反應最大速率Δmaxv代替酶活，建立適合高通量篩選的96孔微孔板反應體系，30 min可檢測60個以上的反應，完全達到高通量篩選的要求[12]，并與苯酚-次氯酸鹽方法進行比較以驗證該方法的可行性。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種產(chǎn)PG的解阮金黃桿菌Y8-10-1，由華東師范大學微生物實驗室保藏。

1.1.2培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基（1 000 mL）：10 g多聚蛋白胨，2 g 酵母提取物，1 g MgSO4·7H2O，加ddH2O至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基（1 000 mL）：5 g乳糖，10 g多聚蛋白胨，1.7 g NaH2PO4·H2O，0.25 g K2HPO4，0.25 g MgSO4·7H2O，0.05 g FeSO4·7H2O，加ddH2O至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2。

1.1.3試劑與儀器

主要試劑：176 mmol/L PBS （pH值為 6.5）：（1）0.2 mol/L Na2HPO4溶液：稱取 71.6 g Na2HPO4·12H2O，用ddH2O定容到1 000 mL；（2）0.2 mol/L NaH2PO4溶液：稱取31.2 g NaH2PO4·2H2O，用ddH2O定容到 1 000 mL。取31.5 mL（1）溶液、68.5 mL（2）溶液，以及11364 mL ddH2O，混合均勻。

底物溶液（反應液）：稱取0.337 g二肽Cbz-Gln-Gly，用176 mmol/L PBS（pH值為6.5）定容至100 mL。400 mmol/L CCl3COOH溶液（終止液）：稱取6.536 g CCl3COOH，用ddH2O定容至100 mL。顯色劑A：稱取 40.46 g 苯酚和0.15 g Na2Fe（CN）5NO2·H2O，用ddH2O定容至 1 000 mL。顯色劑B：稱取49.94 g KOH，用ddH2O定容至 1 000 mL。顯色劑C：稱取200.40 g K2CO3，加適量ddH2O溶解，待冷卻后加8.33 mL NaClO溶液，ddH2O定容至 1 000 mL。醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH值為4.5）：取18 g醋酸鈉，加9.8 mL冰醋酸，再加水定容至1 000 mL。NIT母液：稱取0.1 g NIT，溶于20 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH值為45）。endprint

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：配制具有12%的分離膠和5%的濃縮膠，插10孔樣品梳，膠厚1.5 mm。標準PG樣品（50 U/g），購自Amano公司；底物Cbz-Gln-Gly，購自Sigama公司；大豆蛋白胨、多聚蛋白胨生化純，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母提取物，購自安琪酵母股份有限公司；苯酚、硝普鈉、亞硝酸鈉（NIT）等常規(guī)試劑分析純，購自上海潤捷化學試劑公司。恒溫調(diào)速回旋式搖床DKY-Ⅱ，購自上海杜科自動化設備有限公司；Synergy HT多功能酶標儀，購自BioTek公司，Labofuge 400R水平離心機，購自Thermo Scientific公司。

1.2試驗方法

1.2.1苯酚-次氯酸鹽法測定PG酶活——試管法

參照國際通用的測定氨含量的苯酚次氯酸法[10-11]進行PG酶活測定。

試驗組：取100 μL酶樣品溶液加入試管中，向其中加入1 000 μL已在37 ℃水浴中預熱10 min的底物Cbz-Gln-Gly溶液，混合液在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育30 min。然后加入1 000 μL的400 mmol/L CCl3COOH溶液，終止反應。

對照組：取100 μL酶樣品溶液加入試管中，向其中加入1 000 μL已在37 ℃水浴中預熱10 min的400 mmol/L CCl3COOH溶液，混合液在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育30 min。然后加入 1 000 μL 的底物Cbz-Gln-Gly溶液，混合均勻。

從每支試管中吸取120 μL溶液加入到新試管中，再加入480 μL蒸餾水，混合均勻，然后向試管中依次加入900 μL顯色劑A、450 μL顯色劑B和900 μL顯色劑C。混合均勻后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育20 min，在酶標儀630 nm下測定吸光度。

1個酶活單位定義為1 min催化底物生成1 μmol氨需要的酶量，根據(jù)以下公式計算蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶活力。

[JZ（][HT9.，8.]蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶活力=[SX（]（試驗組氨含量-對照組氨含量）×[SX（]2.10.1[SX）]17.03×30×a[SX）][HT]。[JZ）]

式中：蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶活力單位為U/mL；[SX（]2.10.1[SX）]為反應液與酶液的體積比；17.03為氨的相對分子質(zhì)量；30為反應時間，min；a為氨標準曲線的斜率。

1.2.2基于苯酚-次氯酸法測定PG Δmaxv——96孔板體系

1.2.2.196孔板體系測定PG Δmaxv

試驗組：取10 μL酶樣品溶液加入孔中，向其中加入100 μL已在37 ℃水浴中預熱10 min的底物Cbz-Gln-Gly溶液，混合液在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育15 min。

對照組：在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，PG在80 ℃下溫育10 min后可完全失活[13]。故對照組取10 μL 80 ℃高溫失活的酶樣品溶液加入孔中，向其中加入100 μL已在37 ℃水浴中預熱10 min的底物Cbz-Gln-Gly溶液，混合液在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育15 min。

每孔中加入60 μL顯色劑A、30 μL顯色劑B和60 μL顯色劑C顯色，在酶標儀630 nm下測定顯色反應吸光度 10 min，記錄試驗組、對照組顯色反應最大速度（maxv在酶標儀中直接讀?。┑牟钪郸axv。

1.2.2.2標準PG樣品的Δmaxv曲線

用176 mmol/L PBS（pH值為6.5）稀釋標準PG樣品至不同的濃度，使其酶活分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 U/mL，按照“1.2.2.1”節(jié)中的方法測定所有樣品顯色反應的Δmaxv。

1.2.2.3Δmaxv在96孔板中變異系數(shù)的測定

將10 μL標準PG樣品與發(fā)酵液上清分別加入96孔板的所有孔中，按照“1.2.2.1”節(jié)中的方法測定所有孔中顯色反應的Δmaxv，計算標準PG樣品與發(fā)酵液上清在96孔板中Δmaxv的變異系數(shù)。變異系數(shù)（CV）=標準差/平均值×100%。

1.2.2.4同一菌株不同發(fā)酵時間發(fā)酵液的Δmaxv與酶活相關性分析

將產(chǎn)PG的Y8-10-1菌株活化后接種2%進行發(fā)酵，每隔2 h取樣，苯酚次氯酸法測定酶活并讀取發(fā)酵上清液顯色反應的Δmaxv值，計算其與酶活的對應關系。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：取不同時間發(fā)酵液，10 000 r/min 離心5 min，取上清液，添加適量5×Loading buffer，沸水浴5 min后離心吸取上清液，采用5%濃縮膠以及12%分離膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.3NIT誘變隨機誘變庫的建立

pH值為4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋NIT母液至NIT濃度為0.4、0.5、0.6、1.0 mg/mL。900 μL不同濃度的NIT溶液與100 μL Y8-10-1菌液（109 CFU/mL）充分反應20 min后涂板。致死率=（未誘變平板菌落數(shù)-誘變后平板菌落數(shù)）/未誘變平板菌落數(shù)×100%；正突變率=酶活發(fā)生正突變的菌株數(shù)/發(fā)生突變的總菌株數(shù)×100%。

1.2.4誘變菌株Δmaxv值與酶活相關性分析

將NIT誘變得到的菌株，測其發(fā)酵液上清的酶活及顯色反應的Δmaxv，并從中隨機選取菌株計算酶活與Δmaxv之間的相關系數(shù)。

2結果與分析

2.1不同濃度PG標準品的酶活與Δmaxv的關系

將PG標準品（1.5 U/mL）稀釋不同倍數(shù)，結果如表1、圖1所示，可知，用PBS稀釋標準PG樣品不同的倍數(shù)，其不同的濃度對應的酶活分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 U/mL，將不同濃度的標準酶樣品進行顯色反應Δmaxv測定。結果顯示，隨著標準酶樣品酶活的增加，Δmaxv值也在不斷增加，并在酶活0～1.0 U/mL范圍內(nèi)，兩者呈高度正相關，相關系數(shù)達到0.999，說明Δmaxv表征酶活的線性適用范圍為0～1.0 U/mL，若超過1.0 U/mL，可稀釋樣品再進行測量。endprint

2.2在96孔板中顯色反應Δmaxv變異系數(shù)的測定

96孔板在高通量菌株篩選中有著重要的地位，通過標準PG樣品與發(fā)酵液在96孔板中的顯色反應Δmaxv測定，結果如圖2、圖3、圖4所示。標準PG樣品在96孔板上的顯色反應Δmaxv變異系數(shù)為32%（圖2），并且邊緣孔對應的數(shù)值均發(fā)生較大變異，說明該方法在使用過程中，96孔板在溫育時受熱不均勻，容易產(chǎn)生邊孔效應[14]。使用96孔板內(nèi)部60孔測定相同30組標準PG樣品顯色反應Δmaxv，變異系數(shù)為10%（圖3），測定相同30組發(fā)酵液上清，其顯色反應Δmaxv的變異系數(shù)為18%（圖4），根據(jù)圖1中標準PG樣品的曲線，當Δmaxv變化18%時，酶活變化幅度為20%以上，說明不同樣品的Δmaxv變異系數(shù)均在合理的范圍內(nèi)[15]，此方法每輪可篩選中酶活高于出發(fā)菌株20%的誘變株。結果表明，利用96[JP3]孔板內(nèi)部60孔進行顯色反應Δmaxv測定，可大大提高篩選通量。

2.3不同發(fā)酵時間對Δmaxv測定的影響

由表2以及圖5可知，產(chǎn)PG的解阮金黃桿菌Y8-10-1隨[CM（25]著發(fā)酵時間的增長，其酶活、蛋白量與Δmaxv均在增長，在[CM）]

12 h時均達到最大值，這與前人研究中的試驗結果[9]一致。

在發(fā)酵初期，該菌產(chǎn)酶活性很低，從SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果說明，PG在發(fā)酵6 h時已有明顯的目的蛋白條帶出現(xiàn)，Δmaxv測得數(shù)值為0.004，比4 h時有著明顯的提高，而苯酚-次氯酸法無法對6 h的發(fā)酵液進行準確的酶活測定，說明Δmaxv測定與苯酚-次氯酸法相比有著很高的靈敏性，并由圖6可知2種方法相關性很高，r=0.991。

2.3Δmaxv測定在NIT隨機誘變庫中的檢驗

將該方法應用于NIT誘變篩選中驗證其準確性，不同NIT濃度條件下的誘變結果如表3所示。

由表3可知，隨著NIT濃度從0.4 mg/mL增加至 1.0 mg/mL時，致死率不斷增加，當NIT濃度為1.0 mg/mL時，致死率為99.99%，而正突變率的變化呈現(xiàn)了先增大后減小的趨勢。當NIT濃度為0.6 mg/mL時，正突變率最大，為30.4%，此結果與前期試驗中對產(chǎn)PG的金黃桿菌誘變基本相同。綜合考慮選擇NIT濃度為0.6 mg/mL的[JP2]條件進行NIT化學誘變，并在建立條件過程中隨機選取酶活于0～1.0 U/mL [JP]范圍內(nèi)的30株菌株進行酶活與Δmaxv相關性分析，結果如圖7所示。

將30株酶活0～1.0 U/mL范圍內(nèi)的菌株發(fā)酵液測定Δmaxv，測得的Δmaxv與苯酚次氯酸鹽反應測定酶活結果的相關系數(shù)r=0.890，兩者呈高度正相關。此方法得到驗證，可以應用于誘變初篩的階段，大大減小了工作量。

[FK（W11][TPHC7.tif][FK）]

2.4Δmaxv測定在NIT第1輪誘變中的放大應用

以Y8-10-1作為出發(fā)菌株，利用測定Δmaxv方法進行NIT第1輪誘變初篩，結果如圖8所示。

[FK（W11][TPHC8.tif][FK）]

誘變選取400株菌株進行Δmaxv值測定，對于Δmaxv大于出發(fā)菌株Δmaxv（0.038）的菌株進行苯酚-次氯酸鹽法復篩，其中得到酶活大于0.6 U/mL的菌株有3株，1505120312號菌株酶活為0.81 U/mL，增加幅度最大。將這3株菌進行4次傳代并搖瓶發(fā)酵測定酶活，結果如表4所示，3株突變菌體較原始菌株產(chǎn)酶能力均有明顯的提高，其中編號1505120312的酶活提高最大，為0.73 U/mL，是親本酶活 0.40 U/mL 的1.825倍，因此可通過本研究中建立的初篩方法在誘變初篩階段快速有效地篩選出酶活提高的突變菌株。[FL）]

[FK（W6][HT6H][JZ]表43株初篩高酶活菌株遺傳穩(wěn)定性試驗結果[HTSS][STBZ]

[HJ*5][BG（！][BHDFG3，WK9，WK8*2。6W]菌株編號初始酶活（U/mL）1次傳代酶活（U/mL）2次傳代酶活（U/mL）3次傳代酶活（U/mL）4次傳代酶活（U/mL）相對酶活

[BHDG1*2，WK9，WK8*2。6DWW]15051203120.810.75±0.030.77±0.070.73±0.050.73±0.0390.12%

[BHDW]15051204420.620.52±0.070.50±0.040.52±0.070.54±0.0287.10%

[BH]15051201290.630.59±0.060.48±0.070.47±0.060.49±0.0477.80%[HT][HJ][BG）F][FK）]

[FL（2K2]3結論

本試驗方法利用96孔板將反應微量化縮小了反應體系，并通過高溫失活酶活性，改變對照組反應條件，在酶標儀動態(tài)檢測10 min下快速測定酶與底物產(chǎn)生氨的顯色反應的Δmaxv，其與苯酚-次氯酸法測定酶活的相關系數(shù)高達0890，具有方便、快捷、通量高、試劑消耗少等優(yōu)點，將該方法運用至NIT誘變中，從400株誘變菌株中獲得1株是出發(fā)菌株酶活1.825倍且遺傳穩(wěn)定性良好的菌株，該方法在實際篩選應用中得以驗證，可大大提高初篩效率，進一步用于工業(yè)育種過程。

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