楊宗渠 李長(zhǎng)看 雷志華 李玉華 曲金柱 高紅云 羅青

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.043[HT9.]

摘要：為篩選靈芝菌絲體生長(zhǎng)的適宜環(huán)境條件和基質(zhì)，以臺(tái)灣靈芝和赤芝為材料，觀察菌絲體在不同溫度、pH值、氮源、光照條件、基質(zhì)下的生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明：臺(tái)灣靈芝的最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，培養(yǎng)基最適初始pH值為5.0，最適氮源為（NH4）2SO4，在黑暗中生長(zhǎng)最好；赤芝的最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)基最適初始pH值為5.5，最適氮源為牛肉膏；臺(tái)灣靈芝和赤芝菌絲體均在小麥80%、谷子10%、蕎麥10%配方培養(yǎng)基質(zhì)上生長(zhǎng)最旺盛。

關(guān)鍵詞：靈芝；菌絲體；培養(yǎng)條件；小麥

中圖分類號(hào)： S188+.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號(hào)：1002-1302（2017）13-0150-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-08-15

基金項(xiàng)目：河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：102102110182）。

作者簡(jiǎn)介：楊宗渠（1964—），男，河南延津人，博士，教授，研究方向?yàn)樯镔Y源利用與轉(zhuǎn)化。E-mail：yangzqu@163.com。

[ZK）]

靈芝是我國(guó)傳統(tǒng)的食藥兼用真菌，是自然界珍稀的菌類。迄今為止，人們已經(jīng)從靈芝中分離出150種化合物，如多糖、腺苷、有機(jī)鍺、三萜等[1]。野生的靈芝子實(shí)體資源少，加之不合理采挖，導(dǎo)致藥源不足。靈芝子實(shí)體栽培要消耗大量木材，破壞森林資源，且靈芝子實(shí)體生產(chǎn)周期長(zhǎng)、受氣候條件影響較大、產(chǎn)量低而不穩(wěn)。研究證實(shí)，發(fā)酵菌絲體與子實(shí)體成分一致[2]，為利用發(fā)酵工程技術(shù)生產(chǎn)靈芝菌絲體提供了理論基礎(chǔ)。固體發(fā)酵生產(chǎn)靈芝菌絲體與子實(shí)體栽培相比，具有難度低、生產(chǎn)周期短、次生代謝產(chǎn)物積累時(shí)間長(zhǎng)、培養(yǎng)料來(lái)源廣泛等優(yōu)點(diǎn)。魏龍等研究了接種量、料層厚度、初始酸堿度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)靈芝固體發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性的影響[3]。張平等采用靈芝菌絲固體發(fā)酵枇杷葉，分析發(fā)酵前后枇杷葉中主要活性成分的變化[4]。曲墨等報(bào)道了以中藥渣和蓮藕渣為基質(zhì)的靈芝菌固體發(fā)酵條件[5-6]。杜亞楠等在大豆固體培養(yǎng)基中接種富硒靈芝菌種，探索固體發(fā)酵生產(chǎn)游離氨基酸的工藝條件[7]。付銘等以多糖及賴氨酸含量為指標(biāo)，研究不同大米加量、裝液量、培養(yǎng)基酸堿度和培養(yǎng)溫度對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)的影響[8]。筆者以小麥為發(fā)酵基質(zhì)，以菌絲生長(zhǎng)速度為指標(biāo)，研究不同菌株菌絲的生長(zhǎng)特性，探索以小麥為基質(zhì)的靈芝固體發(fā)酵條件，旨在為將靈芝固體發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于小麥深加工提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

供試菌株臺(tái)灣靈芝從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所引進(jìn)，赤芝由中華供銷合作總社昆明食用菌研究所提供。CP313型電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；DH-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京科偉永興儀器有限公司）；LRH-300-G型光照培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；立式高壓滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；PHSJ-5型pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基

母種采用PDA加富培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基以小麥為主要原料，添加輔料制成培養(yǎng)基質(zhì)。稱取一定量的小麥、燕麥、玉米、蕎麥、谷子、糙米、高粱，用涼水浸泡，放置冰箱12 h后煮沸，煮熟但不裂開，放涼至不黏手，按比例配制培養(yǎng)基質(zhì)。

1.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置20、25、30、35、40 ℃等5個(gè)溫度處理。將靈芝菌種接種到PDA平板加富培養(yǎng)基上，分別置于5種溫度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)溫度處理臺(tái)灣靈芝、赤芝各接種4個(gè)培養(yǎng)皿。

設(shè)置4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5等7個(gè)pH值。采用10% NaOH或10% HCl將PDA加富培養(yǎng)基分別調(diào)整為不同酸堿度，每個(gè)pH值下臺(tái)灣靈芝、赤芝各接種4個(gè)培養(yǎng)皿，放于最適溫度下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

設(shè)置奶粉、牛肉膏、蛋白胨、（NH4）2SO4 4個(gè)處理。在PDA加富培養(yǎng)基中分別添加2%的不同氮源，每個(gè)處理接種4個(gè)培養(yǎng)皿，在最適溫度下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

設(shè)置光照、黑暗條件2個(gè)處理。將菌種接種到加富PDA培養(yǎng)基上，分別置于黑暗和12 h光照的恒溫培養(yǎng)箱，在最適溫度下培養(yǎng)。每個(gè)處理接種4個(gè)培養(yǎng)皿。

培養(yǎng)期間定期觀察菌絲體生長(zhǎng)情況，測(cè)量菌落直徑。

以小麥為主要原料，添加不同比例的其他谷物，制成5種培養(yǎng)基質(zhì)：A：小麥80%、谷子10%、蕎麥10%；B：小麥70%、玉米20%、糙米10%；C：小麥70%、高粱20%、薏米10%；D：小麥60%、燕麥20%、秈米20%；E：小麥100%。將培養(yǎng)基質(zhì)裝入500 mL菌種瓶，棉塞封口，121 ℃滅菌2.5 h。每個(gè)菌株在每種培養(yǎng)基質(zhì)上接種6瓶，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后搖動(dòng)菌種瓶。觀察靈芝菌絲的生長(zhǎng)情況，并記錄菌絲體長(zhǎng)勢(shì)及長(zhǎng)滿瓶的天數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1溫度對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)的影響

從表1可以看出，9 d內(nèi)，臺(tái)灣靈芝的菌落直徑均以25 ℃最大，30 ℃次之，20、35 ℃下菌落直徑較小，40 ℃下菌絲未生長(zhǎng)。赤芝則是30 ℃下菌落直徑最大，其次分別是25、35 ℃，20 ℃菌落直徑最小，40 ℃下菌絲未生長(zhǎng)。由此可知，臺(tái)灣靈芝的最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，赤芝在30 ℃下生長(zhǎng)最快。20、25 ℃ 下臺(tái)灣靈芝菌絲生長(zhǎng)速度比赤芝快，臺(tái)灣靈芝菌絲潔白，赤芝菌絲稍微發(fā)黃；30、35 ℃下赤芝菌絲生長(zhǎng)速度比臺(tái)灣靈芝快，且赤芝菌絲發(fā)黃。

2.2培養(yǎng)基酸堿度對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)的影響

從表2可知，2個(gè)靈芝菌株的菌絲在pH值4.5～7.5之間的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。臺(tái)灣靈芝在pH值5.0～6.0之間培養(yǎng)基上的菌落直徑大于pH 值5.0以下或6.0以上的培養(yǎng)基，pH值為5.0時(shí)菌落直徑最大，且菌絲濃密，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，說(shuō)明臺(tái)灣靈芝菌絲體生長(zhǎng)的最適pH值為5.0。赤芝菌絲在同一pH值的培養(yǎng)基上菌落直徑大于臺(tái)灣靈芝，pH值為5.5時(shí)赤芝菌落直徑最大，長(zhǎng)勢(shì)好，菌絲潔白、濃密，說(shuō)明赤芝菌絲生長(zhǎng)的最適pH值為5.5。endprint

2.3氮源對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)的影響

由表3可知，氮源對(duì)臺(tái)灣靈芝菌絲生長(zhǎng)有顯著影響，在含有（NH4）2SO4的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，菌落直徑最大，生長(zhǎng)旺盛，菌絲濃密，牛肉膏、蛋白胨次之，以奶粉作為氮源時(shí)菌落直徑最小。由此可知，臺(tái)灣靈芝菌絲對(duì)無(wú)機(jī)氮源（NH4）2SO4的利用能力較強(qiáng)。赤芝菌絲的菌落直徑在牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基最大，其次為（NH4）2SO4，奶粉、蛋白胨較小，說(shuō)明赤芝菌絲生長(zhǎng)的最適氮源為牛肉膏，赤芝對(duì)奶粉、蛋白胨的利用能力較弱。在相同氮源下，赤芝菌絲的菌落直徑均大于臺(tái)灣靈芝，說(shuō)明赤芝對(duì)氮源的適應(yīng)能力強(qiáng)于臺(tái)灣靈芝。

2.4光照對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)的影響

由表4可知，2個(gè)供試菌株的菌絲在黑暗條件下的菌落直徑均大于光照條件下，且黑暗條件下，菌絲長(zhǎng)勢(shì)旺盛，濃密、潔白；光照條件下，菌絲稀疏、長(zhǎng)勢(shì)弱。說(shuō)明2個(gè)供試菌株的菌絲均適宜在黑暗環(huán)境中生長(zhǎng)。光照條件下，赤芝菌絲體生長(zhǎng)速度較臺(tái)灣靈芝緩慢，黑暗條件下，赤芝菌絲體的生長(zhǎng)速度明顯快于臺(tái)灣靈芝?？梢?，與臺(tái)灣靈芝相比，赤芝菌絲體生長(zhǎng)對(duì)光照條件更為敏感。

2.5基質(zhì)成分對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)的影響

分別在5種配方的固體培養(yǎng)基上接種臺(tái)灣靈芝和赤芝，黑暗條件下培養(yǎng)，觀察菌絲生長(zhǎng)情況，結(jié)果如表5所示。臺(tái)灣靈芝在A培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快、長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，B培養(yǎng)基次之，D、E培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最慢、長(zhǎng)勢(shì)弱。赤芝菌株在整個(gè)培養(yǎng)過程中菌絲泛黃，A基質(zhì)上的菌絲生長(zhǎng)速度最快，且菌絲濃密，B基質(zhì)上菌絲生長(zhǎng)最慢，菌絲較稀疏，C、D、E基質(zhì)上菌絲生長(zhǎng)速度相差不大，C基質(zhì)上菌絲較D、E基質(zhì)上濃密。由此可知，臺(tái)灣靈芝、赤芝的最適培養(yǎng)基配方均為A基質(zhì)。

3結(jié)論與討論

溫度是影響靈芝菌絲體生長(zhǎng)的重要因子之一。杜曾榮等報(bào)道，黑靈芝（Ganoderma atrum）菌絲體最適生長(zhǎng)溫度為 33 ℃[9]。楊德等[10]、譚才鄧等[11]、余有貴等[12]研究均發(fā)現(xiàn)，赤靈芝菌絲體的最適生長(zhǎng)溫度為27 ℃。本研究中，臺(tái)灣靈芝、赤芝菌絲的最適生長(zhǎng)溫度分別為25、30 ℃，與上述報(bào)道不一致，其原因是試驗(yàn)菌株不同、菌株的生長(zhǎng)特性差異所致。培養(yǎng)基酸堿度通過影響細(xì)胞膜的通透性和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解度來(lái)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響靈芝菌絲的生長(zhǎng)。靈芝菌絲體生長(zhǎng)適宜的pH值大多在5.5～6.5，培養(yǎng)基的初始pH值應(yīng)提高，因?yàn)榕囵B(yǎng)基在滅菌后pH值會(huì)降低，同時(shí)菌絲體在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸而使pH值減小[13]。本研究中，臺(tái)灣靈芝培養(yǎng)基最適初始pH值為5.0，赤芝最適初始pH值則為 5.5，據(jù)此認(rèn)為，菌絲體生長(zhǎng)中產(chǎn)生的有機(jī)酸和滅菌過程對(duì)培養(yǎng)基pH值影響很小，應(yīng)將固體發(fā)酵基質(zhì)初始pH值調(diào)整到 5.0～5.5。2個(gè)菌株的菌絲體在光照條件下生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，與前人報(bào)道[10，12]一致。

靈芝菌絲體對(duì)氮源的適應(yīng)能力較強(qiáng)，但對(duì)不同種類氮源的利用能力不同。與現(xiàn)有報(bào)道[13]不同，本研究中，臺(tái)灣靈芝利用無(wú)機(jī)氮（NH4）2SO4的能力大于蛋白胨、牛肉膏、奶粉等有機(jī)氮，赤芝利用（NH4）2SO4的能力大于蛋白胨和奶粉，其原因可能是2個(gè)菌株菌絲體分泌的催化無(wú)機(jī)氮合成某些必需氨基酸的酶類活性較強(qiáng)，但其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。小麥富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維、礦物質(zhì)、鈣、鐵、維生素等成分，可為靈芝菌絲體生長(zhǎng)提供必需的碳源、氮源、微量元素、微量活性物質(zhì)，2個(gè)菌株的菌絲體在以小麥為主要原料的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，說(shuō)明小麥作為靈芝固體發(fā)酵基質(zhì)是適宜的。由于靈芝固體發(fā)酵是以獲得靈芝多糖等功能成分為目的，所以還需進(jìn)一步研究培養(yǎng)條件對(duì)菌質(zhì)中靈芝多糖含量的影響。同時(shí)，發(fā)酵過程中菌絲分泌的酶類會(huì)催化淀粉、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分的水解，靈芝固體發(fā)酵菌質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)成分的變化也需要進(jìn)行深入研究。

[HTK]致謝：鄭州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)專業(yè)學(xué)生楊晶晶、王利紅、劉旭、孟翠、李巖參加部分研究工作，在此表示感謝！[HT]

[HS2]參考文獻(xiàn)：

[1][ZK（#]張麗霞，張雅君，張麗萍. 靈芝多糖的提取純化及其免疫活性[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，42（6）：168-172.

[2]李欽艷，鐘瑩瑩，陳逸湘，等. 我國(guó)靈芝種質(zhì)資源及生產(chǎn)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食用菌，2016，35（1）：8-12，20.

[3]魏龍，贠建民，艾對(duì)元，等. 提高靈芝-當(dāng)歸雙向固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)抗氧化活性的條件優(yōu)化研究[J]. 食品工業(yè)科技，2014，35（16）：160-165.

[4]張平，李曄，陳嬋，等. 靈芝菌株固體發(fā)酵對(duì)枇杷葉主要活性成分的影響[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2016，28（16）：242-246.

[5]曲墨，邱智東，王偉楠. 靈芝菌固體發(fā)酵三七藥渣工藝研究[J]. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，32（2）：263-265.

[6]Yin Y Q，Liu M Y，Wu J X，et al. Optimization of medium composition for soluble dietary fibre production by Ganoderma lucidum using lotus root pomace[J]. Indian Journal of Agricultural Sciences，2014，84（10）：1225-1230.

[7]杜亞楠，涂曉嶸，胡志斌，等. 大豆富硒靈芝菌固體發(fā)酵產(chǎn)氨基酸工藝的優(yōu)化研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（5）：1043-1048.

[8]付銘，冮潔，狄文婷，等. 大米為基質(zhì)靈芝菌絲體固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技，2014，35（2）：186-191.

[9]杜曾榮，常繼東. 黑靈芝菌絲體培養(yǎng)條件的初步研究[J]. 食用菌，2007，29（1）：4-6.[ZK）]

[10][ZK（#]楊德，周明，郭鵬，等. 靈芝發(fā)酵豆渣培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（24）：6135-6138.

[11]譚才鄧，廖延智，邱玉美，等. 利用糖蜜培養(yǎng)靈芝菌絲工藝條件優(yōu)化[J]. 中國(guó)調(diào)味品，2012，37（11）：29-31，42.

[12]余有貴，李忠海，黃國(guó)華，等. 響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化蕨渣基質(zhì)的靈芝培養(yǎng)條件[J]. 中國(guó)生物工程雜志，2009，29（12）：37-42.

[13]鄧功成，周川，王文飛，等. 靈芝菌絲體發(fā)酵條件優(yōu)化研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40（21）：96-99.endprint