何小麗，朱 義，崔心紅(1.上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院，上海 200232； 2.上海城市困難立地綠化工程技術(shù)研究中心，上海 200232)

鹽脅迫下沼澤小葉樺土壤細(xì)菌數(shù)量及種類(lèi)的變化特征

何小麗1,2，朱 義1,2，崔心紅1*
(1.上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院，上海 200232； 2.上海城市困難立地綠化工程技術(shù)研究中心，上海 200232)

采用稀釋平板法及16S rDNA序列比對(duì)法對(duì)不同NaCl濃度(0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%)脅迫下的沼澤小葉樺土壤細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和種類(lèi)鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NaCl脅迫下沼澤小葉樺土壤細(xì)菌數(shù)量增加，且隨鹽濃度提高而遞增；但土壤細(xì)菌多樣性減小，細(xì)菌種類(lèi)主要以芽胞桿菌屬(Bacillus)為主。

沼澤小葉樺； 鹽脅迫； 土壤細(xì)菌

沼澤小葉樺(Betulamicrophyllavar.paludosa)為樺木科樺木屬小喬木或灌木，原產(chǎn)地為新疆阿勒泰地區(qū)的潮濕鹽堿地及鹽沼澤附近。由于其高耐鹽堿特性，近年來(lái)被廣泛引種至濱海鹽漬地區(qū)，可用來(lái)作為濱海防護(hù)林或鹽堿土生物修復(fù)最佳植物材料之一。對(duì)沼澤小葉樺耐鹽堿、耐高溫高濕機(jī)理的研究較多[1- 3]，而對(duì)其根圍土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究則相對(duì)較少。土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤營(yíng)養(yǎng)元素轉(zhuǎn)化及植物生長(zhǎng)表現(xiàn)密切相關(guān)，本研究對(duì)不同NaCl濃度下的沼澤小葉樺根圍土壤細(xì)菌數(shù)量及種類(lèi)進(jìn)行分析，研究鹽脅迫下土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)與沼澤小葉樺生長(zhǎng)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的沼澤小葉樺樹(shù)苗由上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院提供，高度為約60 cm大小一致的1年生組培苗。栽培介質(zhì)為草炭+蛭石+珍珠巖(體積比為4∶3∶3)。

1.2 處理設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)NaCl濃度4個(gè)水平處理，即0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，以空白即鹽濃度為0的清水為對(duì)照(CK)。重復(fù)5次。以0.2%為起始濃度，以后隔天濃度遞增0.2%，使各處理于同一天達(dá)到預(yù)定濃度。

1.3 檢測(cè)項(xiàng)目

栽培30 d后采集各處理沼澤小葉樺根圍土壤混合樣品，4 ℃保存。

土壤細(xì)菌數(shù)量統(tǒng)計(jì)。準(zhǔn)確稱取土壤樣品10 g，加入到90 mL生理鹽水并裝有玻璃珠的三角瓶中混勻作為原液。原液依次按照10-1、10-2濃度梯度進(jìn)行倍比稀釋，分別接種于含有1.5%瓊脂粉的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落特征進(jìn)行初步分類(lèi)。挑取形態(tài)不同的單菌落劃線分離，反復(fù)3次獲得菌落形態(tài)完全一致的純化菌株，制備甘油管-80 ℃凍存，同時(shí)接種于牛肉膏斜面培養(yǎng)基上4 ℃保存。

細(xì)菌16S rDNA序列比對(duì)。取所分離菌株的48 h平板培養(yǎng)物作為模板，按照如下體系進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增，正向引物5′- AGAGTTTGATCCTGGCTC AG- 3′，反向引物5′- TACGGCTACCTTGTTACGACTT- 3′；50 μL體系[4- 5]為：模板2 μL，dNTP(25 mmol·L-1) 4 μL，引物(1 mmol·L-1)各2 μL，10×Taq緩沖液5 μL，Mg2+(25 mmol·L-1) 3 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.6 μL，超純水31.4 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小(1.5 kbp左右)后，將其TA克隆后進(jìn)行測(cè)序(由invitrogen公司完成)。將測(cè)序結(jié)果輸入http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/，利用BLAST軟件，將測(cè)定得到的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行相似性搜索，確定細(xì)菌的種屬類(lèi)別。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)細(xì)菌數(shù)量的影響

從表1可以看出，隨著土壤鹽濃度的增加，土壤細(xì)菌數(shù)量增加?？赏ㄟ^(guò)土壤細(xì)菌的增殖來(lái)減輕植物的鹽脅迫程度。

表1 不同NaCl濃度處理沼澤小葉樺根圍土壤細(xì)菌數(shù)量及主要種屬

注：同列數(shù)據(jù)后無(wú)相同字母者表示組間差異達(dá)顯著水平。

2.2 對(duì)細(xì)菌種類(lèi)的影響

不施任何鹽對(duì)照的沼澤小葉樺根圍土壤細(xì)菌種類(lèi)較多，有芽胞桿菌屬(Bacillus)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、鞘脂菌屬(Sphingobium)、泛菌屬(Pantoea)等4類(lèi)。4種鹽脅迫處理的沼澤小葉樺根圍土壤細(xì)菌種類(lèi)均為芽胞桿菌屬細(xì)菌。一定濃度的NaCl鹽溶液抑制了沼澤小葉樺根圍某些類(lèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)了根圍耐鹽細(xì)菌的生長(zhǎng)及數(shù)量的增加。芽胞桿菌屬細(xì)菌為一類(lèi)含有內(nèi)生孢子的桿菌或球菌，可以孢子休眠體的形式度過(guò)各種逆境和脅迫環(huán)境，為土壤有益菌群。

2.3 沼澤小葉樺的傷害癥狀

NaCl脅迫下，沼澤小葉樺生長(zhǎng)速率降低，隨著鹽濃度的升高，生長(zhǎng)速率降低越明顯。當(dāng)NaCl 濃度為0.2%與0.4%時(shí)，植株葉片鹽脅迫不明顯，葉色與對(duì)照植株無(wú)顯著差別；當(dāng)NaCl濃度達(dá)0.6%、0.8%時(shí)，歷經(jīng)18 d生長(zhǎng)期后，植株下部老葉開(kāi)始變黃萎蔫脫落，上部新生葉片較少表現(xiàn)出鹽害癥狀；第26 d，0.8%處理的植株葉片開(kāi)始大量干枯脫落，31 d后基本全部脫落完。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照植株比4種鹽脅迫處理的苗高約6 cm。

3 小結(jié)與討論

對(duì)照由于土壤鹽度低，利于多種細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖，土壤細(xì)菌種類(lèi)豐富。4個(gè)鹽脅迫處理土壤鹽分較高，抑制了土壤細(xì)菌多樣性，土壤細(xì)菌種類(lèi)迅速減少，以芽胞桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌居多。已有報(bào)道芽孢桿菌在有無(wú)鹽脅迫條件下均對(duì)植物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[6- 8]，能提高植物的耐鹽性，是一類(lèi)植物促生菌。微生物在受到高滲脅迫等刺激后，在細(xì)胞內(nèi)積累相容溶質(zhì)，以提高細(xì)胞內(nèi)的滲透壓，使細(xì)胞在高滲環(huán)境中能夠進(jìn)行正常的生理活動(dòng)。芽胞桿菌是一類(lèi)好氧和兼性厭氧、產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子的桿狀細(xì)菌，其生理特性豐富多樣，是土壤和植物微生態(tài)優(yōu)勢(shì)種群之一。芽胞桿菌以其生長(zhǎng)迅速、對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求低以及抗性強(qiáng)等特點(diǎn)，在土壤中常以較穩(wěn)定的類(lèi)群存在。由于芽胞桿菌富含蛋白酶、淀粉酶、脂酶等酶類(lèi)，部分菌還可以分解土壤中的不溶性磷酸鹽及鉀鹽，芽胞桿菌不僅有降解土壤中難溶的含磷、含鉀化合物的特性，還有報(bào)道稱芽胞桿菌具有固氮的特性，芽胞桿菌在土壤物質(zhì)循環(huán)和防治植物病害、促進(jìn)植物生長(zhǎng)中起著重要的作用[6- 7]。

綜上所述，沼澤小葉樺在較低鹽濃度處理的土壤中生長(zhǎng)良好，不僅與自身耐鹽的生理結(jié)構(gòu)與功能有關(guān)，與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化可能也存在一定的關(guān)聯(lián)。

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(責(zé)任編輯：張才德)

S68

：A

：0528- 9017(2017)09- 1600- 02

2017- 07- 12

國(guó)家林業(yè)局林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(20144119)

何小麗(1983—)，女，工程師，碩士，從事環(huán)境生態(tài)學(xué)研究工作，E- mail:xiaoliheshnu@163.com。

崔心紅，E- mail:kysxinhongcui@163.com。

文獻(xiàn)著錄格式：何小麗，朱義，崔心紅. 鹽脅迫下沼澤小葉樺土壤細(xì)菌數(shù)量及種類(lèi)的變化特征[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(9)：1600- 1601.

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170933