虞 冰，劉 莉，汪志威，齊沛沛，王新全，徐霞紅，王祥云(.金華市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量綜合監(jiān)督檢測中心，浙江 金華 3000； .省部共建國家重點實驗室培育基地浙江省植物有害生物防控重點實驗室農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥殘留檢測重點實驗室 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 300)

QuEChERS- 超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定草莓中2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯殘留量

虞 冰1，劉 莉1，汪志威2*，齊沛沛2，王新全2，徐霞紅2，王祥云2
(1.金華市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量綜合監(jiān)督檢測中心，浙江 金華 321000； 2.省部共建國家重點實驗室培育基地浙江省植物有害生物防控重點實驗室農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥殘留檢測重點實驗室 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

建立了超高效液相色譜- 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜測定草莓中2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯殘留量的方法?；赒uEChERS方法進行了凈化材料及其配比的優(yōu)化，最終采用40 mg PSA 和40 mg C18的組合進行凈化。試驗結(jié)果表明，2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯在2.5～1 000 μg·L-1內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999，其最低檢出限為5 μg·kg-1，定量限為20 μg·kg-1。在20、50、100和200 μg·kg-1添加水平下，對草莓空白樣品添加2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯，方法回收率為98.1%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%～5.4%，滿足農(nóng)藥殘留分析方法的要求。應(yīng)用本方法對市售的47個草莓樣品進行檢測，均為未檢出2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯殘留。

2,4- 表蕓苔素內(nèi)酯； 超高效液相色譜- 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜； 草莓； 植物生長調(diào)節(jié)劑

1970年，Mitchell[1]首先從油菜花粉中提取到可促進植物生長的活性物質(zhì)，命名為Brassins(蕓苔素內(nèi)酯)，之后又有50余種天然蕓苔素內(nèi)酯類化合物(brassinolide)及其類似物激素從大量物種的花、種子、根莖和葉中被分離出來，被統(tǒng)稱為蕓苔素甾醇(brassinosteroids，BRs)。在蕓苔素甾醇植物激素中，蕓苔素內(nèi)酯類化合物因其活性最高而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[2]。目前我國已登記的蕓苔素內(nèi)酯主要有4種[3]，分別為2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯、22，23，24- 表蕓苔素內(nèi)酯、28- 高蕓苔素內(nèi)酯和28- 表高蕓苔素內(nèi)酯。其中，2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯由于合成所需工業(yè)原料麥角甾醇易得，因此應(yīng)用更為廣泛[4]。

草莓以其香味誘人、口感甜美、具有藥用價值以及高經(jīng)濟價值的特點而廣受青睞[5]。2，4- 蕓苔素內(nèi)酯的使用有助于提高草莓產(chǎn)量[6]，現(xiàn)已有相關(guān)產(chǎn)品獲得登記[7]。目前對蕓苔素內(nèi)酯類化合物報道的檢測方法包括氣相色譜- 質(zhì)譜法[8- 9]、高效液相色譜- 電化學(xué)檢測器[10]/熒光[11]/質(zhì)譜法[12]。其中，氣相色譜- 質(zhì)譜法主要用于鑒定，其靈敏度較差；而高效液相色譜- 電化學(xué)檢測器/熒光/質(zhì)譜法主要采用苯硼酸、菲硼酸、萘硼酸、二茂鐵硼酸、9- 菲硼酸和2- 溴吡啶- 5- 硼酸等硼酸衍生試劑[11- 14]提高蕓苔素內(nèi)酯的儀器響應(yīng)值，確保靈敏度，但衍生過程前處理方法較為繁瑣，且衍生試劑通?；钚暂^高難以長期保存。本試驗擬基于QuEChERs方法，結(jié)合超高效液相色譜- 三重四極桿質(zhì)譜建立草莓中2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯殘留量的快速檢測方法，并對實際樣品進行檢測驗證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

采用超高效液相色譜儀LC- 30A(日本Shimadzu公司)和三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀AB- SCIEX 4500(美國AB公司)；Masslynx 4.1軟件用于儀器控制、數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析。色譜柱為Waters T3柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；臺式離心機(美國Thermo公司)；Filter Unit濾膜(0.22 μm，Agela Technologies公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，美國Merck公司)；乙酸銨、甲酸(HPLC級，美國Tedia公司)；氯化鈉、無水硫酸鎂等均為分析純，購自華東醫(yī)藥有限公司；PSA、C18、GCB凈化材料均購于Agela Technologies公司。

1.2 樣品前處理方法

萃取。稱取草莓樣品10.00 g(0.01 g)于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL乙腈，渦旋1 min。加入1 g氯化鈉和4 g無水硫酸鎂，渦旋1 min，在7 000 r·min-1條件下離心3 min，取上清液待凈化。

凈化。移取上清液1.5 mL于2 mL離心管中，加入40 mg PSA+40 mg C18，劇烈震蕩1 min后，在7 000 r·min-1條件下離心3 min，準(zhǔn)確吸取上清液0.5 mL至裝有0.5 mL水的2 mL離心管中，混勻，以0.22 μm濾膜過濾，待超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC- MS/MS)測定。

1.3 儀器分析方法

采用UPLC- MS/MS進行樣品中2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯的分析測定。色譜柱為Waters T3柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相為水和甲醇(1∶9，V/V)，其中水相含2 mmol·L-1乙酸銨和甲醇中含0.1%甲酸；流速為0.25 mL·min-1，柱溫35 ℃，進樣量5 μL。

質(zhì)譜條件。采用電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，加熱溫度500 ℃，噴霧電壓5 500 V。該化合物的特征離子對有4對，其母離子- 子離子對及相應(yīng)的碰撞能量和去簇電壓經(jīng)方法優(yōu)化后條件見表1，表中標(biāo)注*子離子為定量離子。

表1 2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯的UPLC- MS/MS離子對及碰撞能量、去簇電壓

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

本試驗基于三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀確立2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯的質(zhì)譜條件，主要包括離子對選擇、碰撞能量和去簇電壓等參數(shù)優(yōu)化。配制1.0 mg·L-12，4- 表蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過蠕動泵以7 μL·min-1的流速直接進入質(zhì)譜進行分析。首先，在Q1 MS模式下，m/z為300～600的質(zhì)量范圍內(nèi)進行全掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其母離子[M+H]+的質(zhì)核比m/z為481.4。然后，在Product模式下，以481.4為母離子篩選子離子，在0～40 eV內(nèi)，改變碰撞電壓獲得響應(yīng)值較高的子離子依次為315.2，349.3，445.2和113.0。最后，在MRM模式下優(yōu)化每對離子對的碰撞能量和去簇電壓(表1)。圖1展示了50 μg·L-12，4- 表蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)色譜- 質(zhì)譜分析后得到的4對離子對的提取離子流色譜圖，響應(yīng)值較高的離子對依次為481.4>315.2和481.4>445.2。通過分析草莓基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液也驗證這兩對離子對具有最高的響應(yīng)值和較低的干擾，確定以481.4>315.2為定量離子，481.4>445.2為定性離子。

圖1 50 μg·L-1蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液4組離子對的特征

2.2 樣品凈化材料的選擇和優(yōu)化

QuEChERS[15]方法是近年來發(fā)展十分迅速的一種前處理方法，該方法的重要環(huán)節(jié)在于除雜吸附劑的選擇。本試驗首先開展了4種吸附劑組合，即PSA+C18、PSA+GCB、PSA+GCB+C18和GCB+C18，對草莓提取液凈化效果的比較。結(jié)果表明，當(dāng)吸附劑使用量各40 mg時，對樣品色素的去除效果依次為PSA+C18≈PSA+GCB>PSA+GCB+C18>GCB+C18。同時在空白草莓樣品中添加200 μg·kg-1蕓苔素內(nèi)酯后，比較4種吸附劑組合的回收率，結(jié)果表明，40 mg PSA+40 mg C18的填料組合凈化后蕓苔素內(nèi)酯的回收率最高為103.8%，其余填料組合凈化后對蕓苔素內(nèi)酯損失較大，其回收率僅為51.2%～63.7%，故選擇以PSA+C18的填料組合作為凈化材料。

在選定以PSA和C18組合作為凈化材料后，本試驗又比較了20、40、60和80 mg等4種不同用量對草莓提取液的凈化效果(表2)，20 mg添加水平草莓萃取樣品的顏色較紅，40、60和80 mg添加量凈化效果明顯優(yōu)于20 mg；添加比例為40 mg時，繼續(xù)增加凈化材料比例對樣品去色效果不明顯。

同時，評價了4檔凈化材料添加后草莓中2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯在200 μg·kg-1的添加回收率，結(jié)果顯示，回收率在95.3%～111.0%，能滿足檢測要求。本方法最終以40 mg PSA+40 mg C18作為草莓樣品提取液的凈化材料。

表2 2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯各前處理方法的回收率

2.3 線性、靈敏度、基質(zhì)效應(yīng)和方法回收率

配置2.5、5、10、25、50、100、250、500和1 000 μg·L-12，4- 表蕓苔素內(nèi)酯的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和草莓基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，以定量離子對481.4>315.2響應(yīng)值對標(biāo)樣濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗結(jié)果表明，在2.5～1 000 μg·L-1，溶劑標(biāo)線性擬合方程為Y=2423.8X+10 250，相關(guān)系數(shù)r為0.999，其中Y為峰面積，X為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度；在2.5～1 000 μg·L-1，基質(zhì)標(biāo)線性擬合方程Y=1 866.1X+16 545，相關(guān)系數(shù)r為0.999。以兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方法的斜率比值作為基質(zhì)效應(yīng)判定的依據(jù)，結(jié)果表明，草莓萃取樣品經(jīng)本方法凈化后的基質(zhì)效應(yīng)為0.77，基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為抑制，因此采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法進行定量。

該方法對2，4表蕓苔素內(nèi)酯在草莓樣品中的最低檢出限以3倍信噪比計為5 μg·kg-1，最低定量限以10倍信噪比為20 μg·kg-1。在草莓空白樣品中添加適當(dāng)體積的2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中添加濃度分別為20、50、100和200 μg·kg-1，靜置30 min，使藥液被草莓樣品充分吸附，隨后按照1.2節(jié)的前處理方法和1.3節(jié)的儀器條件進行方法驗證，回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。結(jié)果表明，本方法對草莓中蕓苔素內(nèi)酯在定量限濃度(20 μg·kg-1)，中等濃度(50和100 μg·kg-1)和高濃度(200 μg·kg-1)的加標(biāo)回收率在98%～110%，完全滿足方法檢測需要。

表3 不同添加水平下草莓中2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4 實際樣品驗證

以本方法對47個市售草莓樣品進行檢測，均未檢出2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯殘留。

3 小結(jié)

本研究建立了草莓樣品中2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯殘留量的QuEChERs- 超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜的快速檢測方法。對PSA、C18和GCB等凈化材料組合和用量進行了比較優(yōu)化，最終采用40 mg PSA和40 mg C18作為凈化材料組合。本方法前處理簡單、靈敏度高，線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度均可滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求。

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(責(zé)任編輯：張瑞麟)

S668.4

：B

：0528- 9017(2017)09- 1538- 03

2017- 06- 18

國家自然科學(xué)基金(21607133)；浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究(2016C32G4010122)

虞 冰(1986—)，女，浙江金華人，助理工程師，本科，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測研究工作，E- mail：563640286@qq.com。

汪志威，助理研究員，博士，從事農(nóng)藥環(huán)境行為和殘留分析工作，E- mail：wangzhiwei1106@126.com。

文獻著錄格式：虞冰，劉莉，汪志威，等. QuEChERS- 超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定草莓中2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯殘留量[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(9)：1538- 1540，1545.

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170912