向志光，佟 巍，谷有剛，李欣悅，秦 川

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021)

經(jīng)驗交流

負壓屏障設施動物飼養(yǎng)籠具的選擇及其感染風險的識別

向志光，佟 巍，谷有剛，李欣悅，秦 川*

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021)

目的生物安全實驗室的感染性動物實驗大部分經(jīng)空氣傳播的致病因子可利用安全隔離裝置有效控制，嚙齒類動物飼養(yǎng)籠具作為一種常用設備對其要求仍不明確。本研究將測試本實驗室(負壓屏障設施)模擬感染動物實驗在使用開放和密閉2種嚙齒類動物籠具的病原暴露風險，并評價本設施的硬件條件和管理措施對于風險控制的水平。方法使用具有卡那霉素抗性的大腸桿菌(Kan+，E.coli，DH5α)作為指示微生物，測試開放籠盒飼養(yǎng)、密閉籠盒(與外界無壓力梯度)飼養(yǎng)、生物安全柜動物換籠等操作的暴露風險，并對負壓設施內(nèi)外的指示微生物進行監(jiān)測。結(jié)果動物在負壓屏障設施中使用開放籠具飼養(yǎng)存在病原暴露風險，負壓屏障設施一定程度上可以控制病原的播散；動物在無壓力梯度的密閉籠盒的飼養(yǎng)環(huán)節(jié)未能檢測到指示菌；密閉籠盒使用生物安全柜設備進行換籠操作可有效控制病原暴露風險。結(jié)論在負壓屏障設施內(nèi)使用密閉籠盒，在籠盒與外界無壓力梯度的情況下亦可保障生物安全風險的有效控制。

負壓屏障設施；動物實驗；感染風險；密閉籠盒

動物病原感染性實驗為了防止生物安全風險，需要在特定的實驗環(huán)境中進行，其中對設施最基本的要求包括實驗室與外周環(huán)境的壓力梯度等[1]。我國《實驗室生物安全通用要求》根據(jù)所操作生物因子所采取的防護措施進行分級，并根據(jù)實驗室活動差異、個體防護裝備和基礎設施水平等對實驗室進行區(qū)分，其中符合4.4.2的實驗室，可有效利用安全隔離裝置操作常規(guī)量經(jīng)空氣傳播的致病性生物因子[2]。在實驗動物飼養(yǎng)籠具的選擇上，可以利用負壓動物籠具等作為安全隔離裝置。目前嚙齒類動物的感染性研究多使用IVC(獨立送風籠架具)進行飼養(yǎng)，而業(yè)界對于此類設備的技術指標的要求以及安全性仍存在質(zhì)疑。因此本文擬使用開放籠盒和密閉籠盒對指示微生物的擴散情況進行此類測試。在感染性動物實驗過程中嚙齒類動物的飼養(yǎng)主要涉及動物籠具更換，此過程需要在生物安全柜或類似設備內(nèi)進行。因此本文對此操作存在的可能風險進行了模擬檢測。

本研究選用大腸桿菌抗性菌做指示微生物。大腸桿菌為環(huán)境中常見微生物，自然環(huán)境中生存能力較強，可以作為指示微生物[3]。為了排除自然環(huán)境中大腸桿菌等微生物對于實驗的影響，本研究采用具有卡那霉素抗性基因的基因工程菌作為指示微生物。

1 材料和方法

1.1指示微生物的制備和模擬感染材料的制備

選擇轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pET-28a的大腸桿菌E.coli的基因工程菌株DH5α為指示菌。該菌使用含有50 μg/mL卡那霉素(Kan+)的LB培養(yǎng)基進行過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)物濃度達到109/mL(稀釋法測定)，該指示菌使用固體LB平板進行計數(shù)檢測。對指示菌的Kan標記進行核酸檢測方法檢測，指示微生物使用核酸檢測方法的檢測靈敏度與固體平板培養(yǎng)計數(shù)法接近(數(shù)據(jù)未展示)，本研究選用培養(yǎng)法。

圖1 密閉籠盒示意圖Fig.1 Schematic diagram of the sealed cage

具有密閉功能的籠盒如圖1所示。該籠盒用于IVC籠架具，在脫離籠架具時送風口和排風口自然封閉。在本試驗中，使用此類IVC籠盒作為具有密閉功能的籠盒，脫離IVC系統(tǒng)使用時，打開生命窗口，該窗口打開后仍有高效過濾裝置，可以在保證籠內(nèi)動物通氣的情況下，隔離籠內(nèi)外微生物等的交換。籠內(nèi)裝入小鼠墊料，使用濕熱滅菌法進行滅菌處理。將該籠盒放入生物安全柜。將過夜培養(yǎng)的50 mL指示菌培養(yǎng)物在生物安全柜內(nèi)與籠盒內(nèi)墊料混合，模擬感染材料，籠盒內(nèi)放入2只2月齡C57BL/6J雌性小鼠。混合后密封籠盒，并作表面消毒。1.2表面消毒

使用84消毒液進行表面消毒，消毒劑的有效氯含量為0.55%，新鮮配制，在本測試中72 h內(nèi)有效。使用工作濃度84消毒液沾濕紗布，對籠盒表面和工作臺面進行消毒，擦拭3次，每次間隔2 min。

1.3負壓設施參數(shù)的測定

記錄負壓設施的環(huán)境溫度與濕度；監(jiān)測負壓設施與外界準備間的壓力梯度；測定送風口風速，并根據(jù)室內(nèi)容積計算換氣次數(shù)。使用發(fā)煙法測定負壓設施室內(nèi)的氣流走向。測定實驗室內(nèi)平均氣流速度。

1.4浮游菌及沉降菌的采集

參照GB/T 16293-2010浮游菌測試方法[4]采集室內(nèi)環(huán)境中的浮游菌，使用氣體撞擊采樣器(Microflow，意大利Aquaria公司)進行浮游菌的采集，采集的氣流流速為90 L/min，每次采集500 L，內(nèi)置含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(90 mm直徑)。參照GB/T 14925-2010采集動物實驗室室內(nèi)落下菌[5]，使用含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(90 mm直徑)采集設施和設備內(nèi)的沉降菌，采集時間為30 min。采樣點的位置見附圖。

2 結(jié)果

2.1負壓實驗室基本參數(shù)

本研究使用的設施是負壓屏障設施，實驗室與外側(cè)準備間的壓力梯度維持在-25.0～-30.0 Pa之間。實驗室溫度維持在23.2℃～23.3℃之間，濕度為53.3%。實驗室頂部有4個送風口，送風口面積為(4 × 0.372) m2(4個送風口合計)，送風口分布于實驗室中央位置。測試送風口的平均風速為0.43 m/s，室內(nèi)容積為2.3 m(層高)× 43.7 m2(設施面積)，經(jīng)計算，該實驗室的換氣次數(shù)為23次/h；在實驗室頂部有3個排風口，排風口分布于實驗室外周位置。

使用發(fā)煙法對實驗室氣流走向進行測定，接近送風口位置(30 cm內(nèi))的氣流方向指向遠離送風口的方向；接近排風口的位置(30 cm內(nèi))的氣流方向指向排風口方向；其他空間位置發(fā)煙煙塵無特定走向。該實驗室屬于亂流負壓實驗室。測定平均氣流速度為0.05 m/s。

2.2密閉籠盒飼養(yǎng)動物——指示菌無發(fā)現(xiàn)

按照如圖2所示布點位置測定實驗室浮游菌和落下菌。在進行實驗之前，所有位置均未檢測到指示菌。將裝有小鼠及污染墊料的小鼠籠以密閉狀態(tài)放置在實驗室內(nèi)，放置位置為圖2中E點所示。離地面高度為80 cm。該位置處于送風和排風之間。在此飼養(yǎng)狀態(tài)下對各位置進行浮游菌和沉降菌的采樣，各位置點檢測到指示菌計數(shù)均為0。

圖2 負壓屏障實驗室風口位置及采樣點分布圖Fig.2 Distribution map of air-outlets and sampling points in the negative-pressure barrier facility

2.3生物安全柜內(nèi)換籠操作的病原暴露風險及控制

將密閉籠盒做表面消毒后移入生物安全柜，生物安全柜內(nèi)事先放置采樣培養(yǎng)皿，采樣點分布如圖3所示。準備好鑷子用于動物的夾取。換籠操作人員坐于操作臺前，帶雙層手套，外層手套在安全柜內(nèi)做表面消毒。由助手移入新凈密閉籠盒。在安全柜內(nèi)打開新凈籠盒；打開帶有動物及污染物的籠盒，用鑷子夾取動物，并轉(zhuǎn)移到新凈籠盒內(nèi)；轉(zhuǎn)移帶有飼料的內(nèi)置籠網(wǎng)至新籠盒(手直接操作)；取一培養(yǎng)皿，將接觸籠盒的手在平板表面進行印制接種；使用含消毒液的紗布做手部消毒，封閉新凈籠盒，對籠盒表面用沾有生理鹽水的滅菌拭子擦拭新凈籠盒表面，并涂布平板。對新凈籠盒做表面消毒，由助手轉(zhuǎn)出生物安全柜。收集事先放置的培養(yǎng)皿，對生物安全柜臺面消毒，消毒后的手再次印制培養(yǎng)平板。消毒后再次對生物安全柜內(nèi)放置平板，采集落下菌。

注：PC表示污染的籠盒；CC表示清潔的籠盒。圖3 生物安全柜落下菌采樣位置圖Note. PC means polluted cage; CC means clean cage.Fig.3 Sampling points of microorganisms in the biosafety cabinet

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，放置在內(nèi)側(cè)通風處的采樣點有指示菌富集，其中B點因在轉(zhuǎn)移動物過程中有墊料混入指示菌數(shù)量較多；距離污染籠盒較近的A點落下菌的數(shù)量為24，距離較遠的C點落下菌數(shù)為1。安全柜中央位置離污染籠盒較近的D點落下菌數(shù)為25，而較遠的E點無落下菌。外側(cè)風口處F點檢測到1個落下菌。轉(zhuǎn)移籠盒內(nèi)籠網(wǎng)后手印制平板培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)類手型菌落分布，48 h長滿。新凈籠盒表面采樣未發(fā)現(xiàn)指示菌。手部消毒后再次印制平板，無指示菌生長。臺面消毒后再次采集落下菌，無指示菌生長。

上述實驗表明，生物安全柜內(nèi)由于氣體流向的控制，在排風口以及距離污染物較近的位置存在污染風險，操作人員的手部由于與籠具內(nèi)部接觸存在病原暴露風險，而有效氯濃度為0.55%的84消毒液對手部及臺面消毒可以有效控制指示菌的暴露風險。

2.4在亂流負壓屏障設施動物開放飼養(yǎng)存在病原暴露風險

將動物以及污染籠盒放置在同一飼養(yǎng)位置(圖2中E點)，打開籠蓋，開放飼養(yǎng)。開放30 min后采集各位置落下菌和H、I、J三個采樣位置的浮游菌。采集位點見圖2。結(jié)果在距離籠盒位置較近的K位置，采集到落下菌數(shù)為9，其他位置的落下菌未有指示菌生長；采集的浮游菌在H、I、J三個位點分別為35、2、0。

開放飼養(yǎng)24 h后采集各位置落下菌和浮游菌，各位點落下菌均未有指示菌生長；采集的浮游菌在H、I、J三個位點分別為11、1、1。對開放籠具附近臺面進行擦拭采樣，400 cm2的范圍內(nèi)采集到的樣品接種平板指示菌數(shù)量高于200。在負壓實驗室對動物進行開架飼養(yǎng)時，檢測實驗室外準備間的浮游菌，結(jié)果在多個位置進行檢測，未發(fā)現(xiàn)指示菌。

2.5負壓設施的自凈

將開放籠具再次密閉，并對籠具做外部表面消毒，并移出實驗室。并對籠具放置臺面做表面消毒。實驗室靜置30 min。采集室內(nèi)落下菌和浮游菌，均無指示菌生長。

3 討論

3.1生物安全柜內(nèi)動物換籠的風險因素

生物安全柜內(nèi)氣體流向是較為穩(wěn)定的，由于窗口處下降氣流流速高，形成了氣簾，對于在安全柜內(nèi)操作起到了雙向保護的作用。在生物安全柜內(nèi)的操作主要問題在于安全柜內(nèi)外物品的進出。在本實驗中可以看出，污染籠盒會對周圍局部環(huán)境造成污染，但擴散范圍不大，操作面的垂直氣流可以有效隔離污染物，但是在下風向位置的污染風險存在。因此在生物安全柜的使用過程中應注意防止排風口封堵，防止對氣流走向的干擾；同時應注意設定潔凈區(qū)和非潔凈區(qū)，動物籠具更換過程中生物安全柜的使用也應遵守這一原則。

操作人員的手的污染難以避免。動物的移動可以借助鑷子等工具，但是籠網(wǎng)等的移動還是需要手的直接接觸。因此在操作過程中要識別這一感染風險。一旦手套與感染物發(fā)生接觸，就要進行必要的處理，包括手套消毒或是更換。

3.2浮游菌可以更好地識別感染風險

在負壓屏障設施內(nèi)空氣的潔凈度較好，空氣中的浮游顆粒物較少，細菌等微生物缺少灰塵等顆粒物附著，因此也難以沉降。在本實驗中僅在籠盒開放飼養(yǎng)的狀態(tài)下，籠盒開放30 min后在近籠盒位置檢測到沉降菌。這不排除在打開籠盒時的操作帶來的氣溶膠污染；而24 h后再次采集沉降菌，沉降菌采集時間為30 min，結(jié)果各位置均為陰性。但是對動物籠盒臺面的20 cm×20 cm拭子培養(yǎng)物卻獲得較多的指示微生物樣品。而在籠盒開放飼養(yǎng)24 h后依然可以采集到浮游菌樣品。因此，浮游菌對于感染物的識別靈敏度在本實驗中高于沉降菌指標。

3.3負壓屏障設施對于感染風險的控制

在動物籠盒開放飼養(yǎng)24 h后采集負壓實驗室外準備間的浮游菌，多個位置均為陰性。此結(jié)果說明實驗設施的負壓狀態(tài)可以保證將污染物有效控制在屏障設施內(nèi)。在排除開放籠盒污染物的30 min后再次測試浮游菌，多個位置的測試結(jié)果均為陰性，這表明該設施在正常工況下具有良好的自凈能力，該設施的換氣次數(shù)達到23次/小時，滿足中國國家標準對于生物安全實驗室換氣次數(shù)的要求[6]，30 min內(nèi)基本完成了實驗室空氣的自凈。

3.4密閉籠盒可以有效保障動物感染實驗安全

本實驗使用的籠盒為某國產(chǎn)IVC籠具，其密閉狀態(tài)是在打開籠具生命窗口過濾帽外蓋的狀態(tài)下進行的。在此狀態(tài)下保證了動物的基本通氣。因此該籠盒并不存在與外界的壓力梯度。在無壓力梯度的狀態(tài)下，此籠具的密閉狀態(tài)可以較好地控制模擬感染性生物因子的空氣傳播。而IVC籠具是在此基礎上通過送排風系統(tǒng)連接籠具，理論上除了保障動物的正常換氣外，如果動物籠具不是處于正壓狀態(tài)，在負壓屏障設施內(nèi)使用微負壓IVC籠具即可對嚙齒動物飼養(yǎng)環(huán)節(jié)的感染性生物因子進行有效控制。當考慮生物安全的加量防護原則時，可適當提高對IVC籠具此類技術指標的要求。

[1] Bohannon JK, Janosko K, Holbrook MR, et al. Safety precautions and operating procedures in an (A)BSL-4 laboratory: 3.Aerobiology [J]. J Vis Exp, 2016, (116): e53602.

[2] GB 19489-2008, 實驗室生物安全通用要求 [S]. 2008.

[3] 段會勇, 柴同杰, 蔡玉梅, 等. ERIC-PCR對雞舍大腸桿菌氣溶膠向舍外環(huán)境傳播的鑒定[J]. 中國科學(C輯: 生命科學), 2008, 38(1): 74-83.

[4] GB/T 16293-2010, 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))浮游菌的測試方法 [S]. 2010.

[5] GB 14925-2010, 實驗動物環(huán)境及設施 [S]. 2010.

[6] GB 50346-2011, 生物安全實驗室建筑技術規(guī)范 [S]. 2011.

Selectionoflaboratoryanimalcagesandrecognitionofinfectionriskinthenegative-pressurebarrierfacility

XIANG Zhi-guang， TONG Wei， GU You-gang， LI Xin-yue， QIN Chuan*

(Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Comparative Medicine Center, Peking Union Medical College (PUMC), Beijing 100021, China)

ObjectiveMost of the airborne pathogens of infectious animal experiments in biosafety laboratories can be effectively controlled by barrier apparatus. However，the requirements for biosafety parameters of the rodent cages, which are commonly-used devices, are not clear yet. The purpose of this study is to estimate the risk of pathogen exposure by mimicking infectious animal experiments using open cage or sealed cage for rodents in barrier facility under negative pressure in our laboratory, and to evaluate the risk-controlling level of the hardware conditions and management measures of our facility.MethodsE.coli(DH5α, with the kanamycin-resistance gene, Kan+) was used as the indicator microorganism. The risk of pathogen exposure of the following operations were tested: mice raised in open cage or sealed cage (without pressure gradient inside and outside), and sealed-cage changing of mice in biosafety cabinet. The quantities of indicator microorganisms inside and outside the facility with negative pressure were monitored to estimate the efficiency of biosafety-control over the facility.ResultsThere was a risk of pathogen exposure when open cage was used in the barrier facility under negative pressure, and the spread of pathogens could be controlled in barrier facility under negative pressure to some extent. There was no indicator microorganism detected when animals were raised in sealed cage without pressure gradient inside and outside, and the risk of pathogen exposure during the procedure of sealed-cage changing in the biosafety cabinet could be effectively controlled.ConclusionsThe biosafety of animal experiments can be ensured using sealed cage in barrier facility under negative pressure, even without pressure gradient inside and outside of the cage.

Negative-pressure barrier facility; Animal experiments; Infection risk; Sealed cage

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0076-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.09.014

2017-01-03

衛(wèi)計委公益性行業(yè)科研專項(編號：201302006)；國家重點研發(fā)計劃(編號：2016YFD0501000)。

向志光(1980-)，男，副研究員，免疫學博士，研究方向：實驗動物質(zhì)量控制。E-mail: xiangzhg@yahoo.com

秦川，女，教授，博士生導師，醫(yī)學博士，研究方向：實驗病理。E-mail: qinchuan@pumc.edu.cn