劉助紅，王 靜，李秀珍，尹雪琴，張 鈺，郭鵬舉，黃 韌

(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510663)

研究報(bào)告

猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒p27基因的原核表達(dá)及流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)的建立

劉助紅，王 靜，李秀珍，尹雪琴，張 鈺，郭鵬舉，黃 韌*

(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510663)

目的構(gòu)建猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒的p27蛋白，并建立流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)用于猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測(cè)。方法通過PCR擴(kuò)增p27基因片段，與pGEX-4T-1表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)。通過SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)的形式及最佳誘導(dǎo)時(shí)間。采取GST樹脂純化目標(biāo)蛋白，包被磁珠，建立流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)，用于臨床樣本的檢測(cè)。結(jié)果重組蛋白以可溶的上清液進(jìn)行表達(dá)，誘導(dǎo)的最佳時(shí)間為4 h。包被磁珠后，成功建立流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)，對(duì)陽性血清稀釋81倍仍可檢測(cè)為陽性，對(duì)猴類其他病原的陽性血清無交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)，與ELISA法同時(shí)對(duì)24份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，其中3份樣品的流式免疫熒光微球檢測(cè)結(jié)果為陽性，ELISA檢測(cè)結(jié)果為2份陽性，1份陰性，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果符合率為96%。結(jié)論成功表達(dá)猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒p27蛋白，并運(yùn)用該蛋白建立了靈敏度高，特異性強(qiáng)，樣本需求少的流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)，為后續(xù)推廣應(yīng)用多重流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒；p27基因；原核表達(dá)；流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)

猴逆轉(zhuǎn)錄病毒(simian retrovirus，SRV)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科、腫瘤病毒亞科的D型病毒[1]，感染的宿主主要是獼猴屬的動(dòng)物，如恒河猴、食蟹猴和豚尾猴等[2, 3]。該病毒在猴群中往往會(huì)引起較高的致病率和死亡率[4]。自1983年從英國(guó)發(fā)現(xiàn)第一例以來，目前已經(jīng)被鑒定的SRV有7個(gè)血清型，其中SRV-1、SRV-2、SRV-3型已經(jīng)成功進(jìn)行分子克隆和基因組測(cè)序分析[5, 6]。

由于猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)感染獼猴后，引起的全身性淋巴腺病、脾腫大、腹膜后纖維瘤病等一系列癥狀與人感染HIV后極其相似[7-9]，因此，獼猴往往被用于HIV致病機(jī)理研究和相關(guān)疫苗及藥物開發(fā)與評(píng)估的動(dòng)物模型[10]。而SRV的存在會(huì)給實(shí)驗(yàn)效果造成不可預(yù)料的影響。同時(shí)，當(dāng)人被感染SRV的猴抓傷或咬傷后，會(huì)引起人感染SRV[11]。因此，在建立SIV感染模型之前，需要對(duì)SRV病原進(jìn)行篩查，在猴的飼養(yǎng)過程中，也需要對(duì)該病原進(jìn)行日常監(jiān)測(cè)。目前，常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有PCR法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法、間接免疫熒光(IFA)法、免疫印跡(WB)法、病毒分離法等[12-16]。但是ELISA法和IFA法存在較高的假陽性率，而WB法操作程序復(fù)雜，且需要特定的專業(yè)技術(shù)人員，在一定程度上限制了這些方法的應(yīng)用。因此，不論是為了保障整個(gè)猴群的健康，為科研實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的動(dòng)物模型，還是為了保證飼養(yǎng)人員、科研人員的人身安全，都有必要建立一種方便、快捷、靈敏、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法。

1 材料和方法

1.1毒株、菌種和載體

SRV-1血清型毒株、Raji細(xì)胞、DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，克隆載體pMD19-T購(gòu)自大連寶生物有限公司，表達(dá)載體pGEX-4T-1購(gòu)自GE醫(yī)療集團(tuán)有限公司。

1.2主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑

TRIzol?試劑、Premix TaqTMHot Start Version、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、EcoR I與XhoI限制性內(nèi)切酶、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自大連寶生物有限公司，LB培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物有限公司，Universal DNA純化回收試劑盒、氨芐青霉素購(gòu)自天根生化科技有限公司，GST融合蛋白純化試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，Magplex磁珠包被試劑盒購(gòu)自Luminex公司，IPTG購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，SRV ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自蘇州西山生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 主要儀器

冷凍離心機(jī)(Micro 21R，美國(guó)Thermo Scientific公司)；PCR擴(kuò)增儀(TGradient，德國(guó)Biometra公司)；超微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000，美國(guó)Thermo Scientific公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad GelDoc XR，美國(guó)Bio-Rad公司);電泳儀(DYCP-32A，北京六一儀器廠);移液器(0.5～10 μL，10～100 μL，100～1000 μL，德國(guó)Eppendorf公司);超凈工作臺(tái)等。1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SRV基因組RNA的提取及cDNA合成

采用Raji細(xì)胞對(duì)SRV-1毒株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)出現(xiàn)80%的致細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)后，離心收取上清，用TRIzol?試劑進(jìn)行病毒RNA的提取，然后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA用于后續(xù)分析。

1.3.2 SRVp27目標(biāo)基因的克隆

根據(jù)SRV-1的p27基因序列，設(shè)計(jì)引物，上游引物SRVF：GAATTCCCAGTAACTGAAACTGTCGA，下游引物SRVR：CTCGAGCATGGCTAAGCCCTGTTGA T，上游引物攜帶EcoR I位點(diǎn)，下游引物攜帶XhoI位點(diǎn)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以1.3.1中cDNA為模板，按如下體系和程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：2 × Premix TaqTM12.5 μL，SRVF(10 μmol/L)1.0 μL，SRVR(10 μmol/L)1.0 μL，cDNA 5.0 μL，補(bǔ)水至25.0 μL。按如下PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，循環(huán)擴(kuò)增35次，72℃終延伸5 min。擴(kuò)增完后，電泳回收目標(biāo)條帶，與pMD19-T載體連接成pMD19-T-SRV p27，然后轉(zhuǎn)化至DH5α中，挑取陽性克隆進(jìn)行保存，同時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。

1.3.3 pGEX-4T-1-SRV p27重組質(zhì)粒的構(gòu)建

分別用EcoR I與XhoI限制性內(nèi)切酶對(duì)pMD19-T-SRVp27載體和pGEX-4T-1進(jìn)行雙酶切，然后切膠回收pMD19-T-SRV p27中的SRVp27片段和pGEX-4T-1 中的大片段，通過連接酶構(gòu)建pGEX-4T-1-SRV p27重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后挑取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序分析，確認(rèn)SRVp27基因片段序列的正確性，同時(shí)保存菌種。

1.3.4 重組蛋白的表達(dá)

挑取保存菌種涂布于含有氨芐青霉素的固體LB上培養(yǎng)12～16 h，挑取單克隆于37℃，220 r/min搖床培養(yǎng)至A600值約為0.6時(shí)添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，分別于37℃誘導(dǎo)4 h、6 h、8 h、12 h、24 h，未加IPTG誘導(dǎo)劑的菌液作為陰性對(duì)照。離心收集菌體細(xì)胞，用PBS緩沖液重懸和洗滌兩次，加入裂解液于冰浴中超聲破碎菌體，分別離心收集上清和沉淀，沉淀用500 μL包涵體溶解液(8 mol/L尿素，50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 8.0)溶解，分別用于SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物，確認(rèn)最佳的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間和蛋白表達(dá)形式。

1.3.5 重組蛋白的純化

由于在上清和沉淀中均能發(fā)現(xiàn)表達(dá)的目標(biāo)蛋白，為了后續(xù)純化的方便，離心收集裂解后的上清GST純化樹脂進(jìn)行目標(biāo)蛋白純化，對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析蛋白純度和測(cè)量重組蛋白的濃度。

1.3.6 流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)建立

按照Antibody-Coupling試劑盒說明用純化的蛋白對(duì)Magplex磁珠進(jìn)行包被，最終包被成1000個(gè)磁珠/μL，然后稀釋成50個(gè)/μL，移取50 μL加入96孔板中，加入50 μL血清，振動(dòng)孵育60 min，用含有1% BSA的PBS溶液洗滌兩次，加入100 μL生物素標(biāo)記的兔抗猴二抗(濃度為10 μg/mL)，振動(dòng)孵育30 min，用含有1% BSA的PBS溶液洗滌兩次，加入100 μL SAPE溶液(15 μg/mL)，振動(dòng)孵育30 min，用含有1% BSA的PBS溶液洗滌兩次，加入100 μL的含1% BSA的PBS溶液，通過Luminex 200儀器進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)MFI值判定檢測(cè)結(jié)果。

1.3.7 靈敏度分析

將制備的SRV陽性血清進(jìn)行3倍的梯度稀釋，根據(jù)1.3.6中建立的流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行靈敏度的驗(yàn)證。

1.3.8 特異性分析

采用猴免疫缺陷病毒(SIV)陽性血清、猴B病毒(BV)陽性血清、猴嗜T淋巴細(xì)胞趨向性病毒(STLV)陽性血清對(duì)包被有SRV p27蛋白的磁珠進(jìn)行流式免疫熒光微球檢測(cè)分析，以進(jìn)行特異性驗(yàn)證。

1.3.9 臨床樣本分析

收集來自臨床樣本的血清24份，通過ELISA法和建立的流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)兩種檢測(cè)方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1SRVp27蛋白的結(jié)構(gòu)分析

通過http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred和http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl在線對(duì)SRV p27序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和抗原位點(diǎn)分析，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白主要為螺旋結(jié)構(gòu)(helix)和卷曲結(jié)構(gòu)(coil)，其中helix結(jié)構(gòu)11個(gè)，coil結(jié)構(gòu)12個(gè)(圖1)。通過抗原位點(diǎn)預(yù)測(cè)，抗原傾向性系數(shù)為1.017，整個(gè)序列含有10個(gè)抗原位點(diǎn)(圖2和表1)。

2.2PCR對(duì)SRVp27基因的擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得大小約為750 bp的特異性片斷(圖3)，與預(yù)期大小相符，連接pMD19-T載體測(cè)序，結(jié)果證實(shí)擴(kuò)增片斷723 bp，包含SRV-1p27的完整開放閱讀框(open reading frame，ORF)共678 bp，編碼226個(gè)氨基酸，通過雙酶切后連接，成功構(gòu)建pGEX-4T-1SRV p27重組質(zhì)粒。

2.3原核表達(dá)條件的優(yōu)化

pGEX-4T-1-SRV p27重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，在37℃和0.5 mmol/L IPTG條件下，誘導(dǎo)4 h、6 h、8 h后的表達(dá)量基本沒有差異。表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果表明，重組蛋白主要以上清形式表達(dá)，目標(biāo)蛋白分子量加上載體蛋白的分子量約45×103，與預(yù)期相符(圖4)。

注：1：直鏈結(jié)構(gòu)；2：卷曲結(jié)構(gòu)；3：螺旋結(jié)構(gòu)；Conf：預(yù)測(cè)結(jié)果的可信度；Pred：預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；AA：氨基酸序列。圖1 SRV p27蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Note. 1: Strand; 2: Coil; 3: Helix; Conf: Confidence of prediction; Pred: Predicted secondary structure; AA: Amino acid sequence.Fig.1 Secondary structure prediction of the SRV p27 protein

圖2 SRV p27蛋白抗原位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.2 Antigenic propensity of the SRV p27 protein

編號(hào)No．起始位置Startposition序列Sequence終點(diǎn)位置Endposition120DFTVIKE26228KTAASQYGATAPYTLAIVES47360TLVRAVLSGGDHLLWK754116YDPGLFAQIQAA1275132WRKLPVKG1396141PGASLTGVK1497156FADFVHRLIT1658174AEAGVDYVKQLA1859189ANPACQAAIR19810206LTGYIRLCSDIGPSYQ221

注：1，2：SRV p27基因擴(kuò)增產(chǎn)物；3，4：陰性對(duì)照；M：DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖3 PCR擴(kuò)增SRV p27基因結(jié)果Note. 1, 2: PCR products of SRV p27; 3, 4: Negative control; M: DL2000 DNA marker.Fig.3 Amplification of SRV p27 gene

注：M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：未加IPTG；2，4，6:4、6、8 h誘導(dǎo)后上清；3，5，7:4、6、8 h誘導(dǎo)后沉淀。圖4 不同誘導(dǎo)時(shí)間蛋白表達(dá)SDS-PAGE分析結(jié)果Note.M: Protein marker; 1: Without IPTG induction; 2, 4, 6: Supernatant after induction for 4 h, 6 h and 8 h, respectively; 3, 5, 7: Precipitation after induction for 4 h, 6 h and 8 h, respectively.Fig.4 SDS-PAGE analysis of protein expression after different periods of induction

2.4重組蛋白的純化

通過擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃和0.5 mmol/L IPTG條件下，誘導(dǎo)4 h，收集100 mL菌液，超聲破碎后收集上清，通過GST樹脂進(jìn)行掛柱、洗滌、洗脫等步驟，收集每一步過柱液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖5所示，在第二次洗脫液中，蛋白的含量和純度最高，通過BCA法，測(cè)得蛋白濃度為2.4 mg/mL。

2.5流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)的靈敏度檢測(cè)

通過3倍的梯度稀釋陽性血清，與包被有SRV p27蛋白的磁珠進(jìn)行流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)分析，結(jié)果顯示，隨著血清的不斷稀釋，檢測(cè)到的MFI值也呈梯度下降，當(dāng)血清稀釋至1∶81時(shí)，檢測(cè)的MFI值接近臨界值(陰性血清平均MFI值的3倍)(圖6)。

注：M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：未誘導(dǎo)蛋白；2：誘導(dǎo)后蛋白上清；3：誘導(dǎo)后蛋白沉淀；4：誘導(dǎo)后蛋白上清過柱后收集液；5：第一次洗滌收集液；6：第二次洗滌收集液；7：第一次洗脫液；8：第二次洗脫液。圖5 SRV p27蛋白純化后SDS-PAGE分析結(jié)果Note. M: Protein marker; 1: Without IPTG induction; 2: Supernatant after IPTG induction; 3: Precipitation after IPTG induction; 4: Supernatant collected after flowing through the column; 5: Solution collected after the first washing; 6: Solution collected after the second washing; 7: Solution collected after the first eluting; 8: Solution collected after the second eluting.Fig.5 SDS-PAGE analysis of the SRV p27 protein after purification

注：a：1∶1的血清；b：1∶3的血清；c：1∶9的血清；d：1∶27的血清；e：1∶81的血清；f：1∶243的血清；g：1∶729的血清；h：陰性血清；i：空白對(duì)照。圖6 流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)梯度稀釋血清Note. a～g: Serum with dilution of 1∶1, 1∶3, 1∶9, 1∶27, 1∶81, 1∶243, 1∶729, respectively; h: Serum of negative control; i: Blank control.Fig.6 Detection of serially 3-fold diluted serum by flow microsphere immunofluorescence assay

2.6流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)的特異性驗(yàn)證

通過猴免疫缺陷病毒(SIV)陽性血清、猴B病毒(BV)陽性血清、猴嗜T淋巴細(xì)胞趨向性病毒(STLV)陽性血清與包被有SRV p27蛋白的磁珠進(jìn)行流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)分析，SRV p27蛋白抗原對(duì)上述血清均沒有交叉反應(yīng)，特異性良好(圖7)。

注：A：SIV陽性血清；B：SRV陽性血清；C：BV陽性血清；D：STLV陽性血清；E：四種陽性血清的混合物；F：陰性血清；G：空白對(duì)照。圖7 流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)特異性驗(yàn)證結(jié)果Note. A: SIV-positive serum; B: SRV-positive serum; C: BV-positive serum; D: STLV-positive serum; E: Mixture of SIV-, SRV-, BV- and STLV-positive serum; F: Serum of negative control; G: Blank control.Fig.7 Results of specificity validation of the flow microsphere immunofluorescence assay

2.7臨床樣本檢測(cè)結(jié)果比對(duì)

收集24份臨床血清樣本，分別采用建立的流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)和ELISA法進(jìn)行檢測(cè)分析，檢測(cè)結(jié)果為，24份樣品中有3份樣品的流式免疫熒光微球檢測(cè)結(jié)果為陽性，而ELISA檢測(cè)結(jié)果為其中2份陽性，1份陰性；其余21份樣品的兩種檢測(cè)結(jié)果一致，均為陰性。兩種檢測(cè)方法的符合率為96%。

3 討論

猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒包括多個(gè)血清型，每個(gè)血清型之間的基因組DNA序列差異較大，因此，PCR等分子生物學(xué)的方法往往只能檢測(cè)到某些血清型，諸如Lisaka建立的PCR方法只能檢測(cè)到SRV-1，SRV-2，SRV-3型[5]，Winkles通過引入簡(jiǎn)并堿基而設(shè)計(jì)通用PCR引物，也只能檢測(cè)到SRV-1至SRV-5型[17]。另外，非人靈長(zhǎng)類的基因組中含有內(nèi)源性的逆轉(zhuǎn)錄病毒，這些病毒常常處于一種非感染的狀態(tài)，隨宿主的進(jìn)化而進(jìn)化，F(xiàn)ukumoto通過在日本人群中進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)源性的病毒對(duì)人是基本沒有感染力的，所以要區(qū)分內(nèi)源性的逆轉(zhuǎn)錄病毒和感染性的外源性病毒，傳統(tǒng)的PCR技術(shù)是無法做到的[1, 18]。

本研究表達(dá)的SRV p27蛋白，其序列在各個(gè)血清型中都非常保守，抗原位點(diǎn)多，非常適合用于免疫學(xué)的檢測(cè)。程昀靜和周潔等人均通過不同的原核表達(dá)載體成功對(duì)SRV p27蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，同時(shí)，周潔運(yùn)用該蛋白建立了ELISA檢測(cè)方法，證明其具有良好的診斷價(jià)值[19, 20]。

本研究建立的流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)，吸取了傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法和Luminex熒光檢測(cè)平臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)，克服傳統(tǒng)ELISA和IFA法操作復(fù)雜，樣本需求大，無法進(jìn)行多重檢測(cè)的特點(diǎn)，且檢測(cè)的靈敏度高，特異性強(qiáng)，同時(shí)，在后續(xù)的研究過程中，可建立多重流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)，達(dá)到一份微量樣本檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)的目的，這將極大的提高養(yǎng)殖猴場(chǎng)和檢測(cè)單位的效率，降低試劑與人工成本，因此，本研究建立的流式免疫熒光微球檢測(cè)技術(shù)非常適合在配備有Luminex設(shè)備的檢測(cè)單位或企業(yè)進(jìn)行推廣應(yīng)用。

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Prokaryoticexpressionofp27geneofsimiantype-Dretrovirusandestablishmentofflowmicrosphereimmunofluorescenceassay

LIU Zhu-hong， WANG Jing， LI Xiu-zhen， YIN Xue-qin， ZHANG Yu， GUO Peng-ju， HUANG Ren*

(Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Key Laboratory of Experimental Animals in Guangdong Province, Guangzhou 510663, China)

ObjectiveThep27 gene of the simian type-D retrovirus was prokaryotically expressed to establish the flow microsphere immunofluorescence assay for detection of simian type-D retrovirus in nonhuman primates.MethodsThe gene ofp27 was amplified by PCR and linked to the pGEX-4T-1 expression vector digested with the restriction enzymes ofEcoR I andXhoI, and the recombinant pGEX-4T-1-p27 plasmid was transfected into the BL21 (DE3) cells for expression of target protein. The form of expressed protein and the optimal time for induction were analyzed by SDS-PAGE. The target protein was purified with GST resin and coupled with magnetic beads to establish the flow microsphere immunofluorescence assay for detection of simian type-D retrovirus in clinical specimens.ResultsThe recombinant protein was expressed in the soluble supernatant, and the optimal time for induction was 4 h. After coupling the protein with the magnetic beads, the flow microsphere immunofluorescence assay was successfully established. Using this method, 81-fold diluted serum could still be detected as positive, and no cross-reaction was found in the positive serum of other pathogens of nonhuman primates, indicating the strong specificity of this method.A total of 24 clinical specimens were tested by this flow microsphere immunofluorescence assay as well as ELISA. Among all the 24 specimens, 3 samples were positive detected by the flow microsphere immunofluorescence assay, of which 2 were positive and 1 was negative by ELISA. The coincidence rate of these two methods was 96%.ConclusionsThe prokaryotic expression of p27 protein of the simian type-D retrovirus is successful and the flow microsphere immunofluorescence assay with high sensitivity, strong specificity and tiny samples needed is established, which lays the foundation for further application of the multi-flow microsphere immunofluorescence technique.

Simian type-D retrovirus;p27 gene; Prokaryotic expression; Flow microsphere immunofluorescence assay

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0017-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.09.004

2017-01-18

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2016A040403059，2014A040401035，2014B070706006)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2015BAI07B01)。

劉助紅(1985-)，男，助理研究員，理學(xué)碩士，研究方向：病原微生物的診斷及檢測(cè)技術(shù)研究。E-mail: 290415174@qq.com

黃韌(1959-)，男，研究員，理學(xué)博士，研究方向：比較醫(yī)學(xué)和人類疾病動(dòng)物模型。E-mail: hrlabking@126.com