余 華，朱再勝，杜曉紅，張懷勤

骨化三醇對(duì)體外培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的藥理作用

余 華a，朱再勝a，杜曉紅a，張懷勤b

目的觀察骨化三醇[1,25-(OH)2D3]干預(yù)培養(yǎng)對(duì)人外周血來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)數(shù)量及功能的影響。方法采用密度梯度離心法和差速貼壁法，獲得EPCs細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行鑒定；然后分別加入不同濃度的骨化三醇10、50、100 μmol/L干預(yù)培養(yǎng)72 h，觀察EPCs的數(shù)量變化、黏附、增殖和產(chǎn)生一氧化氮(NO)的能力。結(jié)果與對(duì)照組相比,10、50、100 μmol/L組的貼壁細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為13.91±1.58、14.28±1.66、16.91±1.85，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；重貼壁細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為9.55±1.11、10.25±1.15、10.88±1.02，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；增殖能力(OD值)分別為0.285±0.005、0.301±0.009、0.321±0.006，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)液中NO含量分別為5.687 9±0.392 5、5.954 7±0.243 2、7.682 2±0.353 4 μmol/L，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論骨化三醇干預(yù)培養(yǎng)能提高人外周血來(lái)源EPCs的黏附能力，但對(duì)其增殖能力和產(chǎn)NO能力無(wú)明顯影響。

骨化三醇；內(nèi)皮祖細(xì)胞；一氧化氮；心血管疾病

0 引言

維生素D是一種人體內(nèi)維持鈣磷代謝平衡的重要激素，在體內(nèi)經(jīng)二次羥化作用后，以1,25-(OH)2D3，即骨化三醇形式發(fā)揮生物學(xué)作用[1]。由于維生素D受體同樣存在內(nèi)皮細(xì)胞，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)活性維生素D不足會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，且與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展及死亡率等相關(guān)[2-3]。我們?cè)谇捌谂R床觀察發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定型心絞痛患者體內(nèi)維生素D濃度與外周血EPCs水平存在一定正相關(guān)性[4]。因此，我們通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步觀察骨化三醇對(duì)體外培養(yǎng)EPCs數(shù)量及功能的影響,希望為維生素D防治心血管疾病的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 骨化三醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.5%)購(gòu)自STEM CELL公司,人纖維連接蛋白購(gòu)自Roche公司,FITC-UEA-I lectin(FITC標(biāo)記的荊豆凝集Ⅰ)購(gòu)自Sigma公司，DiI-ac-LDL(DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?購(gòu)自Molecular probe公司,PE-CD34單克隆抗體購(gòu)自Caltag Laboratories公司，PE-VEGFR-2單克隆抗體、FITC-CD133單克隆抗體均購(gòu)自R&D Systems。NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天公司，CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海同仁化學(xué)研究所,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)購(gòu)自Pepro Tech EC公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人外周血來(lái)源EPCs的培養(yǎng) 經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并簽署知情同意書(shū)后，從30歲健康男性志愿者的肘靜脈處抽取外周血30 mL,用Hank′s液等比稀釋后，小心加入在Ficoll液上面，采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,按適當(dāng)密度接種于24孔培養(yǎng)板(預(yù)先包被人纖維連接蛋白)中,每孔中加入預(yù)先混合有鏈霉素、青霉素、VEGF、20%胎牛血清的M199培養(yǎng)液，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,再用Hank′s液反復(fù)沖洗2次，洗去未貼壁細(xì)胞，然后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d。

1.2.2 EPCs的鑒定[5]培養(yǎng)第6天，在顯微鏡下觀察到貼壁的梭形細(xì)胞，用0.25%胰酶消化搜集貼壁的細(xì)胞,制成1×109/L的單細(xì)胞懸液,加入熒光標(biāo)記的抗CD34、VEGFR-2及CD133單克隆抗體,用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞CD34、VEGFR-2及CD133表達(dá)情況。同樣取培養(yǎng)第6天的細(xì)胞,進(jìn)行雙染色試驗(yàn)，依次加入DiI-ac-LDL、FITC-UEA-Ilectin，共同避光孵育2 h,多聚甲醛固定10 min,PBS沖洗2次后，用激光共聚焦顯微鏡觀察鑒定細(xì)胞熒光表達(dá)情況。

1.2.3 分組 培養(yǎng)第6天,用0.25%胰酶將各孔細(xì)胞重新消化,制成單細(xì)胞混懸液,按1×104/cm2的密度分別接種到24孔板中,然后設(shè)立空白對(duì)照組和10、50、100 μmol/L濃度的骨化三醇干預(yù)培養(yǎng)組,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)72 h,再進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、黏附、增殖及產(chǎn)NO能力測(cè)定。

1.2.4 EPCs的計(jì)數(shù) 在倒置相差顯微鏡下(上、下、左、右、中10個(gè)高倍鏡視野×200)計(jì)數(shù)各組各孔具有典型梭形的貼壁細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 EPCs的黏附能力測(cè)定 以0.25%胰酶重新消化各組各孔的貼壁細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液。重新接種到24孔培養(yǎng)板,繼續(xù)培養(yǎng)30 min,洗去各孔未貼壁細(xì)胞,倒置相差顯微鏡下(上、下、左、右、中10個(gè)高倍鏡視野×200)，再計(jì)數(shù)重貼壁的梭形細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6 CCK-8法檢測(cè)EPCs的增殖能力 以0.25%胰酶將每組細(xì)胞重新消化,制成單細(xì)胞懸液。再將等量細(xì)胞數(shù)重新接種到96孔培養(yǎng)板中,按照廠商提供的CCK-8試劑盒檢測(cè)步驟，每孔加入CCK-8試劑10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,再以600 nm為參照波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上450 nm處測(cè)吸收度A值。

1.2.7 Griess法檢測(cè)EPCs分泌NO的能力 將空白組和骨化三醇干預(yù)組的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h后,各組分別吸取50 μL上清液加入96孔培養(yǎng)板中,按照廠商提供的步驟操作，依次加入GriessReagentⅠ、GriessReagentⅡ各50 μL,混勻后在酶標(biāo)儀上570 nm處測(cè)A值。按廠商提供的步驟獲取NO標(biāo)準(zhǔn)曲線(0～100 μmol/L)。

2 結(jié)果

2.1 EPCs的鑒定 根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室前期建立的培養(yǎng)鑒定方法[5]：培養(yǎng)到第3天洗去未貼壁的細(xì)胞，可以見(jiàn)到典型的細(xì)胞集落(圖1)。培養(yǎng)到第6天，形成了梭形內(nèi)皮樣貼壁細(xì)胞。細(xì)胞表型標(biāo)志檢測(cè)顯示其表達(dá)CD34陽(yáng)性細(xì)胞比例為75.25%±7.95%、VEGFR-2陽(yáng)性細(xì)胞比例為8.06%±1.28%、CD133陽(yáng)性細(xì)胞比例為5.95%±1.96%。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡鑒定,結(jié)合FITC-UEA-I lectin的細(xì)胞激發(fā)綠色熒光,吞噬DiI-ac-LDL的細(xì)胞激發(fā)紅色熒光,雙染色陽(yáng)性的細(xì)胞為正在分化的EPCs(圖2)。

圖1 培養(yǎng)第3天的細(xì)胞集落(400×)

圖2 細(xì)胞熒光表達(dá)結(jié)果(200×)

注：結(jié)合FITC-UEA-I lectin的細(xì)胞激發(fā)綠色熒光,吞噬DiI-ac-LDL的細(xì)胞激發(fā)紅色熒光

2.2 骨化三醇對(duì)EPCs數(shù)量、黏附能力、增殖能力及產(chǎn)生NO能力的影響 與對(duì)照組相比，不同濃度骨化三醇組貼壁EPCs的數(shù)量均增加(P<0.01),其中100 μmol/L組與50 μmol/L、10 μmol/L組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；不同濃度的骨化三醇均可增強(qiáng)EPCs的黏附能力(P<0.01),但各干預(yù)組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同濃度的骨化三醇組對(duì)EPCs的增殖能力、產(chǎn)生NO能力均無(wú)明顯影響(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 骨化三醇對(duì)EPCs數(shù)量黏附增殖和產(chǎn)生NO能力的影響

注：*與10、50 μmol/L組比較，t=7.16、8.48，P<0.05；#與10、50 μmol/L組比較，t=2.02、1.85，P>0.05；△與10 μmol/L組比較，t=1.65，P>0.05

3 討論

維生素D是一種類固醇激素，在人體內(nèi)主要靠太陽(yáng)光照產(chǎn)生和攝入吸收兩種途徑獲取。以往認(rèn)為維生素D僅參與人體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣磷平衡代謝，但近年來(lái)其越來(lái)越多的其他生物學(xué)作用被發(fā)現(xiàn)[6]。國(guó)外多項(xiàng)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，高血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者的血清維生素D水平降低，這種維生素D缺乏與心血管急性事件乃至死亡率存在一定相關(guān)性[3]。多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)維生素D缺乏會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。Pittarella等[7]研究發(fā)現(xiàn)，1,25-(OH)2D3可以直接作用于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，并通過(guò)NO途徑對(duì)其遷移能力、增殖能力產(chǎn)生影響。Mrtínez-Miguel等[8]發(fā)現(xiàn)，骨化三醇可以同時(shí)上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞合成內(nèi)皮素-1和NO，二者對(duì)維持內(nèi)皮細(xì)胞的功能平衡具有重要作用。

人外周血中的EPCs是一類內(nèi)皮前體細(xì)胞，稱為循環(huán)EPCs[9]，由骨髓動(dòng)員進(jìn)入外周血，細(xì)胞表型主要以CD34陽(yáng)性為主，可以歸巢到血管損傷部位，能夠分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有促進(jìn)損傷區(qū)域血管新生和修復(fù)損傷血管內(nèi)膜的作用，同時(shí)具有旁分泌功能，能分泌VEGF-A、成纖維細(xì)胞因子-2等，對(duì)內(nèi)皮功能具有重要的修復(fù)及保護(hù)作用，因此，在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、高血壓等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要的保護(hù)作用[10]。鑒于骨化三醇、EPCs在內(nèi)皮功能上存在交叉點(diǎn)，因此，有學(xué)者開(kāi)始探索研究骨化三醇與EPCs之間的直接關(guān)聯(lián)性。

Cianciolo等[11]證實(shí)，維生素D受體同樣存在于外周血循環(huán)EPCs上，通過(guò)對(duì)入選透析患者做補(bǔ)充活性維生素D治療后，可以增加循環(huán)EPCs的數(shù)量。Brodowski等[12]對(duì)子癇前期的孕婦適當(dāng)給予補(bǔ)充維生素D后，其體內(nèi)的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能得到改善。本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)，骨化三醇可以直接提高體外培養(yǎng)的人外周血來(lái)源的EPCs的黏附能力；雖然各濃度組EPCs的增殖能力略受影響，但與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；本實(shí)驗(yàn)未能進(jìn)一步證實(shí)骨化三醇可以提高EPCs產(chǎn)NO的能力，提示骨化三醇在對(duì)EPCs的生物學(xué)功能影響不一定是通過(guò)NO實(shí)現(xiàn)的。

目前已經(jīng)證實(shí)，維生素D受體廣泛存在于各類組織細(xì)胞和上皮細(xì)胞上，分為細(xì)胞核受體和細(xì)胞膜受體兩大類，是骨化三醇發(fā)揮生物學(xué)作用的主要受體[13]。維生素D受體存在于人體各類組織細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[14]。在Cianciolo等[11]的研究基礎(chǔ)上，我們推測(cè)骨化三醇通過(guò)作用于EPCs的維生素D受體后，激活某種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并對(duì)EPCs的增殖、分化及旁分泌等功能產(chǎn)生影響。我們的后期實(shí)驗(yàn)也將進(jìn)一步探討該機(jī)制。綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由于人體內(nèi)的活性維生素D的濃度遠(yuǎn)小于100 μmol/L[15]，因此，我們推測(cè)骨化三醇對(duì)體內(nèi)EPCs的作用有限，可能只是促進(jìn)外周循環(huán)EPCs的歸巢作用，而本身對(duì)EPCs的功能影響較小，這仍需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。我們期望通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究，使補(bǔ)充維生素D成為防治心血管疾病的有益補(bǔ)充。

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Pharmacologicaleffectsofcalcitriolonendothelialprogenitorcellsinvitro

YU Huaa,ZHU Zai-shenga,DU Xiao-honga,ZHANG Huai-qinb

(a.Department of Geriatric Medicine,b.Department of Cardiovascular Medicine,First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China)

ObjectiveTo observe the effect of calcitriol [1,25-(OH)2D3] on the number and function of endothelial progenitor cells (EPCs) in human peripheral blood.MethodsEPCs were obtained by Ficoll density gradient centrifugation and differential adherence method,and identified by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy.Then,the attached cells were stimulated with calciriol (10,50 and 100 μmol/L) for 72 h.The number of EPCs,adhesion,proliferation,and production of nitric oxide (NO) were observed.ResultsCompared with control group,the number of attached cells in 10,50 and 100 μmol/L groups were 13.91±1.58,14.28±1.66,and 16.91±1.85,respectively,the difference being statistically significant (P<0.01);the number of reattached cells were 9.55±1.11,10.25±1.15 and 10.88±1.02,respectively,the difference being statistically significant (P<0.01);proliferation (OD value) were 0.285±0.005,0.301±0.009 and 0.321±0.006,respectively,and there was no statistically significant difference (P>0.05);the NO content in culture medium was 5.687 9±0.392 5,5.954 7±0.243 2 and 7.682 2±0.353 4 μmol/L,respectively,there being no statistically significant difference (P>0.05).ConclusionCalcitriol can improve adhesive ability of EPCs,but has no effect on either proliferation or secretion of NO in EPCsinvitro.

Calcitriol;Endothelial progenitor cells;Nitric oxide;Cardiovascular disease

2016-03-22

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院a.干部保健科，b.心內(nèi)科，溫州 325000

溫州市科技局基金項(xiàng)目(Y20120141)

10.14053/j.cnki.ppcr.201709002