趙麗珂,穆冰瑤,周榮偉,程永靜,黃慈波

(北京醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 國家老年醫(yī)學(xué)中心，北京 100730)

·基礎(chǔ)研究·

不同免疫抑制劑及甲潑尼龍對(duì)小鼠肺間質(zhì)纖維化的療效對(duì)比

趙麗珂,穆冰瑤,周榮偉,程永靜,黃慈波

(北京醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 國家老年醫(yī)學(xué)中心，北京 100730)

目的比較環(huán)磷酰胺、來氟米特和甲潑尼龍對(duì)博來霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化小鼠模型的療效。方法將75只C57BL/6小鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、環(huán)磷酰胺組、來氟米特組及甲潑尼龍組(n=15)?？瞻捉M氣管內(nèi)注入0.9%氯化鈉注射溶液0.2 mL，其余5組氣管內(nèi)注入博來霉素(5 mg/kg)建立肺纖維化模型，24 h后分別對(duì)空白組、模型組每日用0.2 mL 0.9%氯化鈉注射溶液灌胃，藥物組每日分別用環(huán)磷酰胺 (50 mg/kg)、來氟米特 (4 mg/kg)和甲潑尼龍灌胃(10 mg/kg)。并于造模后第7、14、28 天分批處死小鼠，取小鼠肺臟評(píng)估肺泡炎程度及纖維化的程度。結(jié)果(1)博來霉素誘導(dǎo)組小鼠體質(zhì)量較對(duì)照組減輕(P<0.05),環(huán)磷酰胺、來氟米特組和甲潑尼龍組小鼠在第7、14、28天小鼠體質(zhì)量較模型組均明顯增加(P<0.05)。(2)與模型組相比，環(huán)磷酰胺組與甲潑尼龍組小鼠7天、14天時(shí)肺泡炎評(píng)分降低(P<0.05)；第7天、14天、28天時(shí)纖維化評(píng)分明顯降低(P<0.05)。而來氟米特組小鼠肺泡炎及纖維化評(píng)分較模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論環(huán)磷酰胺和甲潑尼龍能顯著降低博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺間質(zhì)纖維化，減輕肺組織肺泡炎及肺纖維化程度，但來氟米特沒有類似作用。

肺纖維化；免疫抑制劑；激素類；博來霉素；環(huán)磷酰胺；甲潑尼龍

間質(zhì)性肺病 (ILD)指主要累及肺間質(zhì)、肺泡和(或)細(xì)支氣管的一組肺部彌漫性疾病[1]。目前發(fā)現(xiàn)部分肺間質(zhì)纖維化常繼發(fā)于結(jié)締組織病(CTD)如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多肌炎/皮肌炎等。有文獻(xiàn)證實(shí)，15%的ILD是由CTD引起的[2]，稱之為結(jié)締組織病相關(guān)的間質(zhì)性肺疾病(CTD-ILD)，它是CTD 呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥的重要臨床表現(xiàn)之一，也是引起死亡的重要原因。CTD-ILD中無論非特異性間質(zhì)性肺炎或?qū)こＰ烷g質(zhì)性肺炎，其病理學(xué)特征早期均可見炎性細(xì)胞浸潤，隨之才是成纖維細(xì)胞增生和膠原沉積。間質(zhì)纖維化一旦形成，將不可逆地導(dǎo)致嚴(yán)重的甚至威脅生命的呼吸循環(huán)功能障礙。目前，國內(nèi)外對(duì)于肺纖維化的治療效果并不理想，且存在各種爭(zhēng)議；而動(dòng)物模型可以幫助觀察不同的藥物對(duì)肺間質(zhì)纖維化的治療效果，目前，國際上應(yīng)用最為廣泛的是博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化動(dòng)物模型[3]。本研究擬采用氣管內(nèi)滴注博來霉素的方法建立小鼠肺間質(zhì)纖維化模型，探討常用于結(jié)締組織病藥物環(huán)磷酰胺、來氟米特及激素對(duì)于博來霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化小鼠模型的療效差異。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)C57BL/6，雄性小鼠，5周齡。購于北京維通利華公司，飼養(yǎng)于北京朝陽醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心動(dòng)物室。

1.2 藥物與試劑 博來霉素A5(15 毫克/支，日本化藥株式會(huì)社產(chǎn))；小鼠細(xì)胞因子/趨化因子磁珠檢測(cè)試劑盒(購于上海升聯(lián)醫(yī)療器械有限公司)；Masson染色試劑盒(購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.3 動(dòng)物模型建立及給藥 將75只C57BL/6小鼠用苦味酸進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記，然后使用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，隨機(jī)分成空白組、模型組、環(huán)磷酰胺組、來氟米特組及甲潑尼龍組(每組15只)。小鼠在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)一周后，采用4%水合氯醛0.1mL腹腔注射麻醉，無菌條件下作氣管切開，空白組氣管內(nèi)注入0.9%氯化鈉注射溶液0.2 mL，其余5組所有小鼠(模型組和藥物組)氣管內(nèi)一次性給予博來霉素0.2 mL(5 mg/kg)制作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

于造模后第2天起，空白組和模型組每日給予0.2 mL 0.9%氯化鈉注射溶液灌胃，艾拉莫德組每日給予0.2 mL艾拉莫德灌胃(90 mg/kg)，環(huán)磷酰胺組每周給予0.2 mL環(huán)磷酰胺灌胃(50 mg/kg)，來氟米特組每日給予0.2 mL來氟米特灌胃(4 mg/kg)，甲潑尼龍組每日給予甲潑尼龍0.2 mL(10 mg/kg)灌胃。期間每天觀察小鼠體質(zhì)量、食欲和活動(dòng)等。

1.4 標(biāo)本收集 五組小鼠分別于造模后第7、14、28天隨機(jī)死5只小鼠(每次每組隨機(jī)抽取5只小鼠)，開胸取肺并稱重，切取右肺葉置于10%的甲醛溶液中固定，然后進(jìn)行HE染色及Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理結(jié)構(gòu)變化。同時(shí)摘除小鼠眼球取血行細(xì)胞因子檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞因子檢測(cè) 血清細(xì)胞因子檢測(cè)步驟根據(jù)Mouse Luminex Screening Assay試劑盒說明書進(jìn)行，方法為ELISA檢測(cè)法。

1.6 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 病理學(xué)評(píng)分根據(jù)Szapiel等[4]報(bào)道的方法確定肺泡炎和肺纖維化的程度，將肺泡炎和肺纖維化分級(jí)并計(jì)算積分進(jìn)行分析。1級(jí)：1分，無肺泡炎；2級(jí)：2分，輕度肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化，單核細(xì)胞浸潤使肺泡間隔增寬僅限于局部，面積不到全肺的20%，肺泡結(jié)構(gòu)正常；3級(jí)：3分，中度肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化，面積占全肺的20%～50%；4級(jí)：4分，重度肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化，面積超過全肺的50%，偶見肺泡腔內(nèi)有單核細(xì)胞及出血造成。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及體質(zhì)量 體質(zhì)量資料列表，經(jīng)整體分析(單因素方差分析)，除0天外，其余時(shí)間點(diǎn)，五個(gè)組的整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較并結(jié)合主要情況來看：空白組小鼠生長良好，除體質(zhì)量自然增長外，其他無異常改變；博來霉素誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠活動(dòng)減少，飲食進(jìn)水較前減少，部分小鼠可見皮毛暗淡無光澤，皮毛紊亂甚至伴有脫毛現(xiàn)象。與空白組對(duì)比，模型組、環(huán)磷酰胺組、來氟米特組和甲潑尼龍組在第7、14、28天小鼠體質(zhì)量下降(P<0.05)；與模型組對(duì)比，環(huán)磷酰胺組小鼠第7、14天重低于模型組小鼠體質(zhì)量但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第28天體質(zhì)量有所增加(P<0.05)，甲潑尼龍組小鼠在第7、14、28天小鼠體質(zhì)量均明顯增加(P<0.05)，來氟米特組與模型組相比體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 小鼠肺組織HE染色情況及肺泡炎評(píng)分

2.2.1 小鼠肺組織HE染色情況 各組小鼠肺組織HE染色顯示(圖1)：(1)空白組：肺泡間隔和肺泡腔內(nèi)未見炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔未見增厚，無新生血管形成。(2)模型組：第7天肺泡間隔和肺泡腔內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤，以單核巨噬細(xì)胞為主，成纖維細(xì)胞逐漸增多；第14天肺泡萎縮壓扁、間隔增寬，肺泡上皮腫脹，炎性細(xì)胞浸潤較明顯，成纖維細(xì)胞明顯增多并可見纖維組織增生，出現(xiàn)肺纖維化改變；第28天肺泡間隔炎性細(xì)胞減少，但肺泡結(jié)構(gòu)破壞，纖維組織呈條索樣瘢痕改變，肺間質(zhì)纖維化形成。(3)來氟米特組在第7、14、28天病理變化同模型組變化基本相同；(4)環(huán)磷酰胺組及甲潑尼龍組第7、14天肺泡萎縮不明顯，間隔略增寬，肺泡上皮略顯腫脹，炎性細(xì)胞浸潤減少，成纖維細(xì)胞較少；第28天部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞，局部肺間質(zhì)有成纖維細(xì)胞聚集，形成輕中度肺間質(zhì)纖維化。

表1 五組小鼠不同時(shí)間體質(zhì)量變化比較

注： 兩兩比較為HSD-q檢驗(yàn)；與對(duì)照組比較，aP<0.05;與模型組比較，bP<0.05;與環(huán)磷酰胺組比較，cP<0.05;與來氟米特組比較，dP<0.05

與空白組相比，博來霉素誘導(dǎo)組小鼠(模型組、 環(huán)磷酰胺組、來氟米特組及甲潑尼龍組)肺部肺泡炎癥程度均增加。與模型組相比，來氟米特組小鼠肺部病變程度同模型組基本相似，但環(huán)磷酰胺組和甲潑尼龍組小鼠肺部病變較模型組有明顯減輕。

2.2.2 小鼠肺組織肺泡炎評(píng)分 如表2所示，整體分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：使用博來霉素誘導(dǎo)的各組小鼠模型(模型組、 環(huán)磷酰胺組、來氟米特組及甲潑尼龍組)肺泡炎在7、14、28 d炎癥評(píng)分均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。環(huán)磷酰胺組與甲潑尼龍組7 d、14 d時(shí)肺泡炎程度評(píng)分較模型組減輕(P<0.05)；28 d時(shí)與模型組肺泡炎程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。環(huán)磷酰胺組和甲潑尼龍組兩組之間肺泡炎程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。來氟米特組7天、14天、28天與模型組肺泡炎程度比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 小鼠肺組織Masson染色情況 各組小鼠肺組織Masson染色顯示(圖2)：膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色，紅細(xì)胞呈橘紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。空白組：肺組織無明顯變化，僅于大氣道和血管壁周圍可見少量藍(lán)色的基質(zhì)膠原纖維。模型組：第7天小鼠肺間質(zhì)、和肺泡間隔可見藍(lán)色膠原沉積；第14天可見呈小灶樣藍(lán)色的膠原纖維；第28天肺間質(zhì)膠原增生沉積呈彌漫性，并伴有肺泡的融合。來氟米特組肺組織病理改變基本同模型組，環(huán)磷酰胺組與甲潑尼龍組肺組織病理改膠原纖維沉積程度較模型組減輕，成纖維細(xì)胞灶均有所減少。與空白組對(duì)比，灌注博來霉素各組Masson染色顯示的膠原沉積程度均增加。

表2 肺組織病變HE染色評(píng)分比較分)

注： 兩兩比較為HSD-q檢驗(yàn)；與對(duì)照組比較，aP<0.05;與模型組比較，bP<0.05;與環(huán)磷酰胺組比較，cP<0.05;與來氟米特組比較，dP<0.05

2.4 小鼠肺組織肺纖維化評(píng)分 整體比較得知，五組各時(shí)間點(diǎn)處整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：使用博來霉素誘導(dǎo)的各組小鼠模型(模型組、 環(huán)磷酰胺組、來氟米特組及甲潑尼龍組)肺纖維化在7、14、28天評(píng)分均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。來氟米特組7天時(shí)較模型組纖維化程度減輕(P<0.05)，14天、28天較模型組纖維化程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；環(huán)磷酰胺組與甲潑尼龍組7天、14天、28天時(shí)纖維化程度均較模型組明顯減輕(P<0.05)。見表3。

a：對(duì)照組第7天;b：對(duì)照組第14天;c：對(duì)照組第28天,肺泡間隔和肺泡腔內(nèi)未見明顯異常；d：模型組第7天;e：模型組第14天;f：模型組第28天;g：環(huán)磷酰胺組第7天、h:環(huán)磷酰胺組第14天，肺泡萎縮不明顯，間隔略增寬，肺泡上皮略顯腫脹，炎性細(xì)胞浸潤減少，成纖維細(xì)胞較少；i：環(huán)磷酰胺組第28天：部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞，局部肺間質(zhì)有成纖維細(xì)胞聚集，形成輕中度肺間質(zhì)纖維化；j:來氟米特組第7天,均可見肺泡間隔和肺泡腔內(nèi)有以單核巨噬細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，可見成纖維細(xì)胞；k:來氟米特組第14天,均可見肺泡萎縮壓扁，肺泡上皮腫脹，炎性細(xì)胞浸潤明顯，成纖維細(xì)胞較多并可見纖維組織增生；l:來氟米特第28天均可見肺泡間隔炎性細(xì)胞減少，但肺泡結(jié)構(gòu)破壞，纖維組織呈條索樣瘢痕改變；m:甲潑尼龍組第7天肺泡間隔和肺泡腔內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤，可見少量成纖維細(xì)胞;n:甲潑尼龍組第14天肺泡間隔有炎性細(xì)胞浸潤，肺泡上皮略腫脹，成纖維細(xì)胞較多；o:甲潑尼龍組第28天肺泡間隔炎性細(xì)胞較少，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺間質(zhì)有成纖維細(xì)胞聚集

圖1 小鼠肺病理HE染色結(jié)果(×100)

注：兩兩比較為HSD-q檢驗(yàn)；與對(duì)照組比較，aP<0.05;與模型組比較，bP<0.05;與環(huán)磷酰胺組比較，cP<0.05;與來氟米特組比較，dP<0.05

a：對(duì)照組第7天；b：對(duì)照組第14天；c：對(duì)照組第28天，肺組織纖維染色未見明顯異常；d：模型組第7天；e：模型組第14天；f：模型組第28天；g：環(huán)磷酰胺組第7天，肺間質(zhì)可見少量藍(lán)色的基質(zhì)膠原纖維；h：環(huán)磷酰胺組第14天，肺間質(zhì)見較多藍(lán)色的膠原纖維；i：環(huán)磷酰胺組第28天，肺間質(zhì)膠原增生沉積呈輕度彌漫性；j:來氟米特組第7天；k:來氟米特組第14天，均可見肺間質(zhì)和肺泡間隔可見藍(lán)色膠原沉積；l:來氟米特組第28天，均可見肺間質(zhì)膠原增生沉積呈彌漫性，并伴有肺泡的融合；m：甲潑尼龍組第7天，僅于血管壁周圍可見少量藍(lán)色的基質(zhì)膠原纖維，余未見明顯異常；n：甲潑尼龍組第14天，肺間質(zhì)見較多藍(lán)色的膠原纖維；o：甲潑尼龍組第28天，肺間質(zhì)膠原增生明顯，未見肺泡的融合

圖2小鼠肺病理Masson染色結(jié)果(×100)

3 討論

目前CTD-ILD的治療目前仍沒有共識(shí)，缺乏有效的治療方法，檢索近年國內(nèi)外的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，所涉及的CTD-ILD 常用的治療藥物有：糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑等[5-11]。糖皮質(zhì)激素作為首選藥物被應(yīng)用于臨床，結(jié)果表明激素對(duì)肺間質(zhì)纖維化的療效確是有限的[12-13]。免疫抑制劑中報(bào)道較多的有甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺、嗎替麥考酚酯等。其中環(huán)磷酰胺在CTD-ILD 的治療中療效相對(duì)肯定，而來氟米特(LEF)在CTD-ILD的治療報(bào)道幾乎未見。環(huán)磷酰胺作為一種強(qiáng)有力的經(jīng)典的免疫抑制劑，主要通過殺傷免疫細(xì)胞(T細(xì)胞和B細(xì)胞)并抑制免疫細(xì)胞的數(shù)量和功能發(fā)揮作用，其起效慢、作用時(shí)間持久。來氟米特是丙二腈酰胺類免疫抑制劑，其通過抑制二氫乳酸脫氫酶活性發(fā)揮抑制淋巴細(xì)胞增殖作用，起效慢、作用時(shí)間持久、副作用較其他大多數(shù)免疫抑制劑少。本研究對(duì)比了環(huán)磷酰胺、來氟米特及甲潑尼龍對(duì)小鼠肺間質(zhì)纖維化療效差異。

鑒于博來霉素廣泛用于建立肺纖維化的動(dòng)物模型，本研究構(gòu)建了博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型，發(fā)現(xiàn)博來霉素誘導(dǎo)后小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤明顯，肺間質(zhì)和肺泡間隔膠原纖維增生呈彌漫性并伴有肺泡的融合；而使用環(huán)磷酰胺或者甲潑尼龍干預(yù)后，小鼠在疾病的不同時(shí)間炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，肺間質(zhì)和肺泡間隔膠原染色中膠原纖維減少，肺泡炎和肺纖維化病理評(píng)分明顯降低。提示環(huán)磷酰胺及甲潑尼龍可以抑制炎性細(xì)胞的浸潤，降低小鼠肺泡炎和肺纖維化的程度，對(duì)肺纖維化小鼠有一定的積極干預(yù)作用。但是來氟米特干預(yù)組小鼠肺泡炎程度及纖維化程度較模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示來氟米特對(duì)ILD暫無明確療效。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示環(huán)磷酰胺和甲潑尼龍能減輕及抑制博來霉素誘導(dǎo)的小鼠的炎性反應(yīng)和肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展，而來氟米特對(duì)小鼠肺間質(zhì)纖維化無明顯抑制作用，臨床醫(yī)師在使用來氟米特治療CTD-ILD時(shí)，需先評(píng)估患者的肺部情況，嚴(yán)格掌握適應(yīng)證，謹(jǐn)慎使用LEF，有肺部基礎(chǔ)疾病的患者盡量避免使用。

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Effectsofimmunosuppressiondrugsandprednisoloneonmicemodelofbleomycin-inducedpulmonaryfibrosis

ZhaoLike,MuBinyao,ZhouRongwei,ChengYongjing,HuangCibo

(DepartmentofRheumatology,BeijingHospital,NationalCenterofGerontology,Bejing100730,China)Correspondingauthor:HuangCibo,Email:huangcibo1208@139.com

ObjectiveTo explore the effect of cyclophosphamide(CTX),leflunomide(LEF) and methylprednisolone(MP) on mouse model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis.MethodsA total of 75 C57BL / 6 mice were randomly and evenly divided into control group，model group，CTX group，LEF group and MP group(n=15 in each group).The mice in control group were injected 0.2 mL normal saline from endotracheal ,and others were injected with 0.2mL bleomycin(5 mg/kg) from endotracheal to induce the pulmonary fibrosis model.The next day,the mice in control group and model group were fed with 0.2mL normal saline every day;The mice in other groups were fed with respectively 0.2 mL CTX (50 mg/kg) ,0.2 mL LEF(4 mg/kg)and 0.2 mL MP (10 mg/kg) every day respectively.Finally the mice were sacrificed at day 7,day 14,day 28 separately,and the lung tissue was examined by HE staining and Masson staining to evaluate the degree of alveolitis and fibrosis.Results(1) The body mass of mice in bleomycin-induced groups were decreased compared with control group;(2) The pathological alveolitis scores in CTX group and MP group were significantly decreased compared with mode group at day 7 and day 14(P<0.05),and the pathological fibrosis scores were decreased dramatically compared with mode group at day 7,day 14 and day 28(P<0.05).While there was no statistical significance between LEF group and model group.ConclusionsThe CTX and MP can reduce and inhibit bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis in mices,but not LEF.

Pulmonary fibrosis；Immunosuppressive agents；Hormones；Bleomycin；Cyclophosphamide；Methylprednisolone

R563.13

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2017.05.027

2017-01-20)

首都醫(yī)學(xué)發(fā)展基金(首發(fā)-1-4051)

趙麗珂，主治醫(yī)師，Email:likezhao@126.com

黃慈波，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email:huangcibo1208@139.com