崔 嵩，韓葉葉，劉思伯

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬大連市中心醫(yī)院，重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 大連 116033)

研究報(bào)告

靜脈注射大腸桿菌制備高動(dòng)力型感染性休克犬模型

崔 嵩，韓葉葉，劉思伯

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬大連市中心醫(yī)院，重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 大連 116033)

目的通過(guò)靜脈注射大腸桿菌方法制備高動(dòng)力型感染性休克犬模型。方法雜種犬22只，隨機(jī)分為對(duì)照組(n=11)和實(shí)驗(yàn)組(n=11)。麻醉犬后，經(jīng)右股靜脈置入雙腔中心靜脈導(dǎo)管，對(duì)照組使用微量泵向犬股靜脈內(nèi)泵入生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組以同樣方法泵入大腸桿菌，經(jīng)右股動(dòng)脈置入PICCO導(dǎo)管，在0～48 h各時(shí)點(diǎn)應(yīng)用PICCO監(jiān)測(cè)全身血流動(dòng)力學(xué)情況。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組的心率(HR)、心排量(CO)、每搏量(SV)在12 h均顯著升高(P< 0.05)，收縮壓(SBP)、外周血管阻力(SVR)在12 h顯著降低(P< 0.05)，而其他血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)如中心靜脈壓(CVP)、肺動(dòng)脈楔壓(PAWP)、氧輸送(DO2)、氧消耗(VO2)、氧攝取率(O2ER)差異均無(wú)顯著性(P> 0.05)。實(shí)驗(yàn)組從12 h起即可觀察到明顯的尿量減少；動(dòng)脈收縮期峰值血流速度(PSV)和阻力指數(shù)(RI)與對(duì)照組相比差異均有顯著性(P< 0.05)。結(jié)論運(yùn)用微量泵向犬股靜脈泵入活大腸桿菌可以成功制備高動(dòng)力型感染性休克犬模型，可為研究感染性休克提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

感染性休克；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；犬；大腸桿菌；血流動(dòng)力學(xué)

膿毒癥是ICU中危重癥患者的主要死亡原因之一，其血流動(dòng)力學(xué)的復(fù)雜性使其治療比其他類(lèi)型的休克困難，因此，對(duì)其血流動(dòng)力學(xué)的的病理生理學(xué)的研究也更顯重要。本實(shí)驗(yàn)想要通過(guò)靜脈注射活大腸桿菌的方法制備出膿毒癥休克犬的動(dòng)物模型，希望為研究膿毒癥患者血流動(dòng)力學(xué)改變提供理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雜種雄性犬22只，1～2周歲成年犬，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(遼)2008-0002]，隨機(jī)分為2組，每組11只，體重18～20 kg，兩組實(shí)驗(yàn)犬體重差異無(wú)顯著性。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)用統(tǒng)一犬糧喂養(yǎng)1周[SYXK(遼)2008-0002]，術(shù)前禁食12 h，禁水4 h。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)(AEE15003)。

1.2細(xì)菌制備

大腸桿菌菌株ATCC25922由大連醫(yī)科大學(xué)微生物研究室提供，首次稀釋菌株分于50支2.0 mL凍存管(Corning Incorporated公司，430659型號(hào))內(nèi)，每管內(nèi)含有菌液0.2 mL和20%甘油0.8 mL，同一時(shí)間密封標(biāo)記后置于-80℃深低溫冰箱。每次取出1支凍存管，以保證每次實(shí)驗(yàn)注射用大腸埃希菌基因型和致病力相同。

培養(yǎng)基由3 g營(yíng)養(yǎng)肉湯粉和1.8 g瓊脂粉(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)加蒸餾水至100 mL制成，高壓蒸汽鍋滅菌維持30 min。滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻后制成固體培養(yǎng)基。取1支含菌液凍存管，置于37℃水浴箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠，WS2-261-79型號(hào))內(nèi)10 min進(jìn)行細(xì)菌復(fù)蘇。復(fù)蘇后，用已滅菌接種棒蘸取適量菌液均勻涂布于各培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫空氣浴振蕩器內(nèi)培養(yǎng)12 h后取出各培養(yǎng)皿，分別用生理鹽水洗脫表面菌落，收集于同一試劑瓶?jī)?nèi)。從試劑瓶?jī)?nèi)取少量菌液，采用稀釋平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，計(jì)算出原菌液中菌落形成單位(CFU/mL)，稀釋至1×109CFU/mL置于4℃冰箱內(nèi)備用。1.3模型制備

1.3.1 麻醉及機(jī)械通氣

戊巴比妥鈉(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)3 g溶解于97 mL生理鹽水配置成3%濃度溶液。首劑麻醉使用1.5 mL/kg肌肉注射，之后以1～3 mL/h經(jīng)微量注射泵(Fresenius Kabi公司，Injectmat型號(hào))持續(xù)靜脈泵入。待麻醉后將犬固定于動(dòng)物解剖臺(tái)上。經(jīng)口氣管插管，連接呼吸機(jī)(Drager Medical GmbH公司，Evita XL型號(hào))輔助通氣，初始呼吸參數(shù)設(shè)定：SIMV(容量控制)，潮氣量(tidal volume，VT)=8～10 mL/kg，吸入氧濃度(fraction of inspiration O2，F(xiàn)iO2)=30%～50%，呼氣末正壓(positive end expiratory pressure，PEEP)=0 mmHg，吸氣時(shí)間1.2 s，呼吸頻率(f)=15～20次/min。

1.3.2 動(dòng)靜脈置管，連接監(jiān)護(hù)設(shè)備

頸部和腹股溝區(qū)備皮后常規(guī)消毒、鋪無(wú)菌單，超聲引導(dǎo)下分別行動(dòng)、靜脈穿刺置管。頸內(nèi)靜脈留置12 Fr三腔導(dǎo)管(Arrow International Inc公司，REF CS-12123-F型號(hào))一枚，細(xì)腔連接壓力傳感器后與心電監(jiān)護(hù)儀(GE Medical Systems Information Technologies Inc公司，TRAM-RAC 4A型號(hào))連接用于監(jiān)測(cè)中心靜脈壓(central venous pressure，CVP)。股靜脈留置7 Fr雙腔導(dǎo)管(Arrow International Inc公司，REF CV-17702-E型號(hào))一枚，一腔用于連接PICCO注射液溫度探頭容納管，另一腔作為輸液和麻醉劑泵入通路。股動(dòng)脈留置PICCO熱稀釋導(dǎo)管，通過(guò)壓力傳導(dǎo)系統(tǒng)與PICCO機(jī)器(Pulsion Medical Systems公司，PC 8100型號(hào))連接，持續(xù)監(jiān)測(cè)并記錄收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)、心率(heart rate，HR)、心輸出量(cardiac output，CO)、心指數(shù)(cardiac index，CI)、每搏量(stroke volume，SV)、每搏量指數(shù)(stroke volume index，SVI)、外周血管阻力(systemic vascular resistance，SVR)、外周血管阻力指數(shù)(systemic vascular resistance index，SVRI)、每搏量變化(stroke volume variation，SVV)、氧輸送(oxygen delivery，DO2)、氧消耗(oxygen consumption，VO2)。脈氧夾固定于犬舌，連接心電監(jiān)護(hù)儀，持續(xù)進(jìn)行氧飽和度監(jiān)測(cè)。

1.3.3 大腸桿菌注射

將犬固定于解剖臺(tái)后，待心率及血壓穩(wěn)定(血壓波動(dòng)范圍不超過(guò)±10 mmHg)30 min作為基線0 h。之后，對(duì)照組經(jīng)股靜脈以0.5 mL/(kg·h)持續(xù)泵入生理鹽水至48 h后處死。實(shí)驗(yàn)組以同樣速度泵入活大腸桿菌(E.coli，1×109CFU/mL)，當(dāng)出現(xiàn)感染性休克時(shí)(MAP ≤ 60 mmHg或者SBP < 90 mmHg)改為持續(xù)泵入生理鹽水。每1 h記錄尿量。每6 h校正PICCO，每次校正前關(guān)閉雙腔管另一輸液腔，通過(guò)注射液溫度探頭容納管注射15 mL且溫度小于8℃的生理鹽水，3 s內(nèi)注射完畢。

1.4全身血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)

通過(guò)心電監(jiān)護(hù)儀及PICCO儀監(jiān)測(cè)并記錄48 h內(nèi)SBP、MAP、HR、CO、SV、SVI、SVR、SVRI、SVV、CVP、DO2、VO2等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.5腎臟血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)

每隔6 h使用彩色多普勒超聲儀(color Doppler flow imaging，CDFI；深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)分別測(cè)量右側(cè)腎動(dòng)脈(main renal artery，MRA)的動(dòng)脈收縮期峰值血流速度(peak systolic velocity，PSV)和阻力指數(shù)(resitance index，RI)，每次測(cè)量取連續(xù)3個(gè)波形均值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1血流動(dòng)力學(xué)改變

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組犬的所有血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)在基線0 h差異均無(wú)顯著性(P> 0.05)。實(shí)驗(yàn)組SBP在0 h為(169.01±12.50) mmHg，12 h時(shí)SBP出現(xiàn)明顯降低，HR、CO明顯升高并伴SVR的降低，呈現(xiàn)“高排低阻”血流動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)，和對(duì)照組相比差異有顯著性(P< 0.05)，在36 h時(shí)CO達(dá)到最大，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)，CO和SVR都逐漸降低，逐漸呈現(xiàn)出“低排低阻”(表1)。其他血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)如CVP、肺動(dòng)脈楔壓(pulmonary artery wedge pressure，PAWP)、DO2、VO2、氧攝取率(oxygen extraction rate，O2ER)與對(duì)照組相比差異均無(wú)顯著性(P> 0.05)。

表1 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的對(duì)比分析

2.2心輸出量與腎血流動(dòng)力學(xué)關(guān)系

實(shí)驗(yàn)組12 h即可出現(xiàn)PSV的增加，36 h達(dá)最大，而RI在12 h即可見(jiàn)明顯減少，與對(duì)照組相比，差異有顯著性(P< 0.05)。PSV與CO呈正相關(guān)(回歸方程為Y=0.642 + 0.005X，R2=0.785，P< 0.01)(圖1)，PSV隨CO增加而增加。RI與CO呈負(fù)相關(guān)(回歸方程為Y=4.013-1.836X，R2=0.812，P< 0.01)(圖2)，RI隨CO增加而減少。

圖1 PSV與CO的相關(guān)性Fig.1 Correlation between PSV and CO

圖2 RI與CO的相關(guān)性Fig.2 Correlation between RI and CO

圖3 高動(dòng)力型感染性休克犬模型Fig.3 The dog model of hyperdynamic septic shock

3 討論

膿毒癥是重癥監(jiān)護(hù)病房的主要死亡原因之一[1, 2]。一項(xiàng)來(lái)自高收入國(guó)家的流行病學(xué)資料顯示，從2008年到2012年膿毒癥患病人數(shù)從346/10萬(wàn)上升到436/10萬(wàn)[3]，全球膿毒癥患病人數(shù)估計(jì)約3150萬(wàn)，嚴(yán)重膿毒癥約1940萬(wàn)，膿毒癥死亡人數(shù)約530萬(wàn)[4]，一項(xiàng)來(lái)自法國(guó)的ICU的流行病學(xué)資料顯示膿毒癥休克的病死率高達(dá)45%，因此，膿毒癥的高發(fā)病率及病死率使其成為研究的熱門(mén)[5]。2016年第三次國(guó)際共識(shí)(Sepsis 3.0)定義膿毒癥為“嚴(yán)重感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)(失控的炎癥反應(yīng))導(dǎo)致的致命性器官功能障礙”[2]。Giantomasso[6, 7]認(rèn)為血流動(dòng)力學(xué)的改變參與多器官功能障礙的發(fā)展，是患者死亡的主要原因。臨床上，膿毒癥休克可根據(jù)血流動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)分為高排-低阻(暖休克)和低排-低阻(冷休克)兩種類(lèi)型。

目前存在多種膿毒癥休克動(dòng)物模型制備方法，較公認(rèn)的感染性休克模型制備方法有內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)、活菌注射、盲腸結(jié)扎穿孔等，選擇物種包括兔子、鼠、豬等，各種模型都包含了循環(huán)系統(tǒng)、組織代謝、激素反應(yīng)等方面指標(biāo)的改變[8, 9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)股靜脈注射活菌的方法制備感染性休克模型，模擬臨床上感染早起最常見(jiàn)的“高動(dòng)力”休克模型，實(shí)驗(yàn)組CO在12～36 h各時(shí)間點(diǎn)分別出現(xiàn)不同程度的上升，而SBP和SVR在12～48 h各時(shí)間點(diǎn)分別出現(xiàn)不同程度的下降，顯示高動(dòng)力循環(huán)感染性休克模型制備成功。我們同時(shí)還發(fā)現(xiàn)PSV與CO呈正相關(guān)，RI與CO呈負(fù)相關(guān)，這與最新研究高動(dòng)力型感染性休克時(shí)腎血流量增加、腎血管阻力下降一致[10]。

運(yùn)用微量泵向犬靜脈內(nèi)泵入活大腸桿菌制備高動(dòng)力型感染性休克犬模型，結(jié)果符合臨床上感染性休克早期高動(dòng)力型血流動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)，可以很好地模擬臨床情況，為更加準(zhǔn)確地研究感染性休克病理生理變化提供了理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

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EstablishmentofadogmodelofhyperdynamicsepticshockbyintravenousinjectionofEscherichiacoli

CUI Song， HAN Ye-ye， LIU Si-bo

(Department of Intensive Care Medicine, Dalian Municipal Central Hospital Affiliated of Dalian Medical University, Dalian 116033, China)

ObjectiveTo establish a dog model of hyperdynamic septic shock by intravenous injection ofEscherichiacoli.MethodsTwenty-two hybrid dogs were randomly divided into control group (n=11) and experimental group (n=11). A double-cavity central venous catheter was inserted into the right femoral vein of the dogs after anesthesia. Physiological saline was continuously pumped into the femoral vein of the dogs in the control group by the micro-pump, while the dogs of the septic shock group were pumped withE.coliin the same way. The catheter of PICCO (pulse indicator continuous cardiac output) was inserted into the right femoral artery and the systemic hemodynamics of the dogs was monitored at all of the time points from 0 to 48 h.ResultsCompared with the control group, the heart rate (HR), cardiac output (CO) and stroke volume (SV) of the experimental group were significantly increased at 12 h (P< 0.05), and the systolic blood pressure (SBP) and systemic vascular resistance (SVR) were significantly decreased at 12 h (P< 0.05). However, other hemodynamic parameters such as the central venous pressure (CVP), the pulmonary artery wedge pressure (PAWP), the oxygen delivery rate (DO2), the oxygen consumption rate (VO2), and the oxygen extraction rate (O2ER) were not significantly different (P> 0.05). Moreover, significant decrease in urine output was observed in the septic shock group since 12 hours, and the peak systolic velocity (PSV) and the resistance index (RI) of the systolic artery were significantly different from those in the control group (P< 0.05).ConclusionsThe dog model of hyperdynammic septic shock can be successfully established by intravenous injection ofEscherichiacoliinto the femoral vein by a micro-pump. This model provides an experimental basis for further study of septic shock.

Septic shock; Animal experiments; Canine;Escherichiacoli; Hemodynamics

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0048-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.09.009

2017-01-20

大連市衛(wèi)計(jì)委2013年課題項(xiàng)目(課題名稱(chēng)：《亞低溫治療感染性休克所致ARDS的實(shí)驗(yàn)研究》)。

崔嵩(1978-)，男，副主任醫(yī)師。E-mail: cuisong2008@qq.com