董 哲，謝立娟，李 陽(yáng),2，李碧野，李 丹，席海山

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 天然產(chǎn)物化學(xué)及功能分子合成自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 通遼 028043; 2.通遼市醫(yī)院骨一科，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

基于氧化型谷胱甘肽保護(hù)的熒光金納米團(tuán)簇的制備及其對(duì)Fe3+的檢測(cè)

董 哲1*，謝立娟1，李 陽(yáng)1,2，李碧野1，李 丹1，席海山1

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 天然產(chǎn)物化學(xué)及功能分子合成自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 通遼 028043; 2.通遼市醫(yī)院骨一科，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

利用氧化型谷胱甘肽作為還原劑和穩(wěn)定劑，通過(guò)綠色合成法制備了具有良好生物相容性的金納米團(tuán)簇(GSSG-Au NCs)，其平均粒徑大小為2.9 nm。以其為熒光探針實(shí)現(xiàn)了對(duì)Fe3+的高靈敏檢測(cè)，且對(duì)干擾離子具有高度選擇性，線性范圍寬 (0.1～30 μmol/L)，檢出限為0.03 μmol/L。該方法用于實(shí)際水樣(自來(lái)水、湖水和河水)中Fe3+的測(cè)定，結(jié)果滿(mǎn)意。

金納米團(tuán)簇；氧化型谷胱甘肽；熒光探針；鐵離子

鐵是生物體所必需的微量元素之一，也是人體中含量最豐富的過(guò)渡金屬，為細(xì)胞代謝和基因表達(dá)調(diào)控提供了必要條件[1]。許多酶均是通過(guò)Fe3+來(lái)維持其生物活性，生物機(jī)體內(nèi)Fe3+缺乏或攝入過(guò)多，可能會(huì)引起多種生理疾病甚至死亡[2]。因此，高選擇性和高靈敏地檢測(cè)Fe3+具有十分重要的意義[3]。目前，痕量檢測(cè)Fe3+的方法主要有離子色譜法、原子發(fā)射光譜法、原子吸收光譜法、伏安法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法等，但這些方法存在儀器運(yùn)行成本較高、維護(hù)繁瑣等缺點(diǎn)，限制了其廣泛應(yīng)用[3-4]。

貴金屬納米團(tuán)簇具有生物毒副作用低、化學(xué)及光穩(wěn)定性強(qiáng)、斯托克斯位移大、量子產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在生化分析領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注[5-6]。金納米團(tuán)簇作為分析靈敏度高及線性檢測(cè)范圍寬的熒光探針，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于重金屬和生物蛋白等的檢測(cè)[7-10]?；诮鸺{米團(tuán)簇材料的熒光分析方法具有操作簡(jiǎn)便和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)傳感器、納米電子、新型催化劑、光電納米器件等領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景。谷胱甘肽是一種含有γ-谷酞基和巰基(—SH)的三肽化合物，機(jī)體內(nèi)一般以還原型(GSH)形式存在，具有一定生物活性，氧化應(yīng)激后形成氧化型谷胱甘肽(GSSG)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成了基于GSSG保護(hù)的水溶性熒光金納米團(tuán)簇，并對(duì)水樣中的Fe3+進(jìn)行檢測(cè)，該探針響應(yīng)靈敏，可用于實(shí)際水樣中鐵離子的測(cè)定，對(duì)Fe3+快速檢測(cè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

透射電子顯微鏡(JEM-2100F，日本電子)，動(dòng)態(tài)光散射儀(Dynapro，美國(guó)懷雅特)，熒光分光光度計(jì)(970CRT，上海精科)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-Vis 8453，美國(guó)安捷倫)，熒光壽命測(cè)試系統(tǒng)(FL-TCSPC，法國(guó)堀場(chǎng))，集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101，金壇區(qū)岸頭林豐實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

氯金酸(HAuCl4)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和2-(N-嗎啡啉)乙烷磺酸鈉(MES)購(gòu)于阿拉丁(Aladdin)試劑中國(guó)有限公司；其它所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析級(jí)，購(gòu)于長(zhǎng)春鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司，未經(jīng)進(jìn)一步純化。實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q(18.2 MΩ·cm)超純水系統(tǒng)(Millipore,Biocel)制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GSSG-Au NCs的合成參考Guo等[13-14]的制備方法并加以適當(dāng)修改：在圓底燒瓶中分別加入5 mL的HAuCl4溶液(5.0 mmol/L)，在冰浴中磁力攪拌下，將5 mL的GSSG溶液(2.0 mmol/L)逐滴加入到燒瓶中。將溶液不斷攪拌20 min后，再逐滴加入10 mL的0.1% NaBH4溶液，然后快速加入1 mL 0.50 mol/L的NaOH溶液。撤掉冰浴的保護(hù)后，再不斷攪拌8 h。對(duì)所得混合溶液施加總功率為90 W的超聲波10 min，避光靜置3 h后得到黃棕色溶液。所得GSSG-Au NCs用錫箔紙包好，置于4 ℃冰箱內(nèi)避光儲(chǔ)存?zhèn)溆肹15-16]。

1.2.2 Fe3+的熒光檢測(cè)將100 μL的Fe3+溶液(濃度為0.5～800 μmol/L)加入到調(diào)配好的GSSG-Au NCs溶液中(30 μL的GSSG-Au NCs溶液，200 μL的MES緩沖溶液和1 670 μL的水溶液)，每次混合搖勻后均靜置30 min。在室溫下，熒光強(qiáng)度測(cè)定時(shí)的激發(fā)波長(zhǎng)為361 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。考察不同金屬離子對(duì)GSSG-Au NCs的熒光猝滅情況，驗(yàn)證熒光探針檢測(cè)Fe3+的選擇性。

2 結(jié)果與討論

2.1 GSSG-Au NCs制備條件的優(yōu)化

2.1.1反應(yīng)時(shí)間的選擇依照“1.2.1”合成方法，撤掉冰浴后繼續(xù)攪拌，每隔一段時(shí)間測(cè)定產(chǎn)品的熒光值，在反應(yīng)過(guò)程中所合成的GSSG-Au NCs熒光強(qiáng)度在第16 h后達(dá)到最大，但與攪拌8 h的產(chǎn)品所發(fā)出的熒光相差不大?？紤]到能源消耗效率，確定最佳反應(yīng)時(shí)間為8 h。

2.1.2反應(yīng)物濃度最佳比例依照“1.2.1”合成方法，考察了不同濃度比的反應(yīng)物對(duì)金納米團(tuán)簇合成的影響。分別加入5 mL不同濃度的HAuCl4溶液(0.5、2.5、5.0、10、20 mmol/L)，GSSG溶液用量為5 mL，濃度為2.0 mmol/L。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5 mL HAuCl4溶液濃度為5.0 mmol/L時(shí)，所合成的金納米團(tuán)簇樣品熒光值達(dá)到最大。

圖1 GSSG-Au NCs的TEM光譜圖 Fig.1 Typical TEM images of GSSG-Au NCsinsert: the size distributions

2.2 GSSG-Au NCs的熒光特性

2.2.1 GSSG-Au NCs的形貌特征考察了所制備熒光GSSG-Au NCs的形態(tài)和尺寸分布，分別用透射電子顯微鏡(TEM)和動(dòng)態(tài)光散射儀(DSL)進(jìn)行了表征。如圖1所示，粒子呈球狀，分散性良好，平均粒徑為2.9 nm。所制備的金納米團(tuán)簇在400 nm處出現(xiàn)制備樣品特有的等離子體共振吸收峰(圖2插圖)。采用羅丹明作為基準(zhǔn)物質(zhì)(在水中的量子產(chǎn)率為0.31%)，測(cè)得GSSG-Au NCs熒光量子產(chǎn)率為2.71%。以上結(jié)果表明,已成功合成了穩(wěn)定性好和量子產(chǎn)率高的熒光GSSG-Au NCs。

2.2.2 GSSG-Au NCs的激發(fā)與發(fā)射光譜所合成的金納米團(tuán)簇的熒光激發(fā)-發(fā)射光譜如圖2所示，其激發(fā)光譜峰的λem在672 nm處，最大熒光發(fā)射光譜峰λex在361 nm處。該金納米團(tuán)簇的激發(fā)光譜連續(xù)，同時(shí)具有很寬的熒光激發(fā)波長(zhǎng)范圍(260～430 nm)，熒光發(fā)射峰峰形對(duì)稱(chēng)，半峰寬較窄，熒光強(qiáng)度高，合成出的金納米團(tuán)簇光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，有良好的發(fā)光性能。

圖2 GSSG-Au NCs的激發(fā)光譜及發(fā)射光譜 Fig.2 The excitation and emission spectra of GSSG-Au NCsinsert:UV-Vis absorption spectrum

圖3 GSSG-Au NCs對(duì)不同金屬離子的熒光響應(yīng)情況Fig.3 Sensitivity of the GSSG-Au NCs based assay towards different metal ions

圖4 加入不同濃度Fe3+時(shí)GSSG-Au NCs的熒光光譜圖Fig.4 The fluorescence spectra of GSSG-Au NCs with different concentrations of Fe3+

2.2.3 GSSG-Au NCs的穩(wěn)定性為考察GSSG-Au NCs作為熒光探針的穩(wěn)定性，研究了其在不同鹽濃度條件下的熒光光譜，發(fā)現(xiàn)GSSG-Au NCs的熒光強(qiáng)度在高鹽濃度條件下(100 mmol/L NaCl)幾乎不受影響。實(shí)驗(yàn)還對(duì)GSSG-Au NCs樣品的熱穩(wěn)定性能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明GSSG-Au NCs的熒光值在4～95 ℃范圍內(nèi)變化不大，表明所制備的探針具有較好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。另外，考察了所合成的探針對(duì)Fe3+的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，結(jié)果表明該探針具有較好的時(shí)間穩(wěn)定性。同時(shí)考察了GSSG-Au NCs的熒光衰減曲線，計(jì)算得到其平均熒光壽命為1.572 ns[18]。

2.3 GSSG-Au NCs對(duì)Fe3+的選擇性

2.3.1 GSSG-Au NCs對(duì)不同金屬離子的響應(yīng)情況本文考察了可能存在的金屬離子對(duì)GSG-Au NCs熒光強(qiáng)度的影響。如圖3所示，其他實(shí)驗(yàn)條件相同，當(dāng)體系中分別加入等濃度(10 μmol/L)的不同金屬離子時(shí)，F(xiàn)e3+對(duì)該GSSG-Au NCs熒光表現(xiàn)出很強(qiáng)的猝滅效應(yīng)，而其他金屬離子只會(huì)引起較微弱的猝滅效應(yīng)。

2.3.2 GSSG-Au NCs測(cè)定Fe3+的干擾試驗(yàn)固定Fe3+濃度為10 μmol/L，在檢測(cè)體系中分別加入100 μmol/L的干擾金屬離子。結(jié)果顯示，Al3+、Cr3+、Hg2+、Co2+、Cd2+、Cu2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Ni2+、Pb2+、Na+、Ag+、Fe2+等金屬離子對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾，表明該方法檢測(cè)鐵離子具有較高的選擇性，可用于實(shí)際環(huán)境水樣中Fe3+的檢測(cè)。

2.3.3 GSSG-Au NCs對(duì)Fe3+檢測(cè)的工作曲線與檢出限在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，采用GSSG-Au NCs在水體系中對(duì)不同濃度的Fe3+進(jìn)行測(cè)定，以此驗(yàn)證本方法的靈敏度和線性范圍。從圖4中可知，隨著Fe3+濃度的增加，GSSG-Au NCs在水體系中的熒光強(qiáng)度不斷下降。在優(yōu)化條件下,Fe3+濃度在0.1～30 μmol/L范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度變化值呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為(IF0-IF)/IF=0.057 4C+0.138(r2=0.996)。以3σ/k[17]計(jì)算熒光探針的檢出限為0.03 μmol/L。

2.4 實(shí)際水樣中Fe3+的檢測(cè)

為驗(yàn)證本方法的實(shí)用性，采用合成的GSSG-Au NCs熒光探針測(cè)定實(shí)際水樣(包括自來(lái)水、湖水和河水)中Fe3+濃度，并同時(shí)用ICP-AES 法平行測(cè)定。實(shí)際水樣經(jīng)簡(jiǎn)單的過(guò)濾除沉操作后直接用于鐵離子的檢測(cè)。每種水樣中分別加入4.0、8.0、12.0 μmol/L的Fe3+，然后將含有不同濃度Fe3+的實(shí)際水樣加入到GSSG-Au NCs溶液中，攪拌后靜置30 min測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度，每組分別測(cè)定3 次取其平均值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，同時(shí)進(jìn)行樣品加標(biāo)回收率的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。兩種方法測(cè)得Fe3+濃度的結(jié)果一致，加標(biāo)回收率為82.5%～102.5%，RSD為1.7%～3.7%。說(shuō)明本方法測(cè)定Fe3+濃度的準(zhǔn)確性和可靠性符合要求。

表1 水樣中Fe3+濃度的含量測(cè)定Table 1 Determination of Fe3+ in water samples

3 結(jié) 論

本文在水溶液中利用環(huán)境友好的生物小分子作為還原劑和穩(wěn)定劑，一步法制備了熒光金納米團(tuán)簇，可以簡(jiǎn)便和迅速地測(cè)定溶液中Fe3+的濃度。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，確定了最佳合成條件，并考察了本方法的特異性、檢測(cè)范圍和靈敏度，其檢出限達(dá)0.03 μmol/L。所構(gòu)建的方法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，同時(shí)具有較強(qiáng)的準(zhǔn)確度和精密度，可應(yīng)用于實(shí)際水樣的測(cè)定。

[1] Hamishehkar H,Ghasemzadeh B,Naseri A,Salehi R,Rasoulzadeh F.Sens.ActuatorsB,2015,150: 934-939.

[2] Kakhlon O,Cabantchik Z I.FreeRadicalBiol.Med.,2002,33(8): 1037-1046.

[3] Wei S,Jia K,Shou H,Zhou X,Wang P,Liu X.Chem.Phys.Lett.,2017,678: 72-78.

[4] Qin Y A,Zhang X,Liu S Y,Sun M M.J.Instrum.Anal.(秦元安，張獻(xiàn)，劉叔堯，孫明明.分析測(cè)試學(xué)報(bào)),2015，34(10): 1158-1162．

[5] Zhang Y,Li M,Niu Q,Gao P,Zhang G M,Dong C,Shuang S M.Talanta,2017,171: 143-151.

[6] Selvaprakash K,Chen Y.Biosens.Bioelectron.,2017,92: 410-416.

[7] Qing T,He X,He D,Qing Z,Wang K,Lei Y,Liu T,Tang P,Li Y.Talanta,2016,161: 170-176.

[8] Lan J,Zou H Y,Wang Q,Zeng P,Li Y F,Huang C Z.Talanta,2016,161: 482-488.

[9] Mao B,Qu F,Zhu S,You J.Sens.ActuatorsB,2016,234:338-344.

[10] Hu S,Ye B,Yi X,Cao Z,Wu D,Shen C,Wang J.Talanta,2016,155: 272-277.

[11] Jones D P.MethodsEnzymol,2002,348(1): 93-112.

[12] Giustarini D,Tsikas D,Colombo G,Milzanic A,Dalle-Donnec I,Fantid P,Rossi R.J.Chromatogr.B,2016,1019(3):210-214.

[13] Guo C,Irudayaraj J.Anal.Chem.,2011,83(8): 2883-2889.

[14] Xie J,Zheng Y,Ying J Y.J.Am.Chem.Soc.,2009,131(3): 888-889.

[15] Zhang Z,Deng C Q,Guo T,Meng L S.J.Instrum.Anal.(張禎,鄧成權(quán),郭添,孟列素.分析測(cè)試學(xué)報(bào)),2014,33(7): 810-814．

[16] Ayesh A I,Karam Z,Awwad F,Meetani A M.Sens.ActuatorsB,2015,221: 201-206.

[17] Liu J,Wang B,Xu M,Wang L,Zhou Z.J.Lumin.,2017,185:258-262.

[18] Vosch T,Antoku Y,Hsiang J,Richards C I,Gonzalez J I,Dickson R M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2007,104(31): 12616-12621.

Synthesis of a Fluorescent Gold Nanoclusters Probe Based on GSSG and Its Application in Determination of Fe3+

DONG Zhe1*,XIE Li-juan1,LI Yang1,2,LI Bi-ye1,LI Dan1,XI Hai-shan1

(1.Key Laboratory for the Natural Products Chemistry and Functional Molecular Synthesis，Inner Mongolia University for Nationalities,Tongliao 028043,China; 2.Orthopedics One，Tongliao City Hospital,Tongliao 028000,China)

Gold nanoclusters were synthesized based on oxidized glutathione(GSSG) with a mean diameter of 2.9 nm.The fluorescence of GSSG-Au NCs was strongly quenched when Fe3+ions were present.The sensor was used to detelt Fe3+ions has a wide linear range of 0.1-30 μmol/L,a high sensitivity of 0.03 μmol/L and a good selectivity.The method described was successfully applied in real sample(tap water,lake water and river water samples) determination.

gold nanoclusters(Au NCs); oxidized glutathione(GSSG); fluorescent probe; Fe3+

O433.4

：A

：1004-4957(2017)09-1155-04

2017-04-28；

：2017-05-31

國(guó)家自然科學(xué)基金(21661026)；內(nèi)蒙古民族大學(xué)大型儀器功能開(kāi)發(fā)創(chuàng)新基地資助項(xiàng)目

*

：董 哲，博士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：無(wú)機(jī)生物，Tel: 0475-8314847，E-mail：dongzhe@imun.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.018