許涵秋

(龍巖市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所,福建 龍巖 364000)

實驗技術(shù)

以二甲亞砜/正十二醇為二元致孔劑的新型苯乙烯-二乙烯苯毛細管整體柱的制備與表征

許涵秋*

(龍巖市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所,福建 龍巖 364000)

首次以二甲亞砜/正十二醇為二元致孔劑，苯乙烯為單體，二乙烯苯為交聯(lián)劑，過氧化苯甲酰為引發(fā)劑，通過原位聚合反應(yīng)制備了苯乙烯-二乙烯苯聚合物型毛細管整體柱。結(jié)果表明，苯乙烯 ∶二乙烯苯 ∶二甲亞砜 ∶正十二醇的體積比為18.7∶15.3∶13.2∶52.8，即二甲亞砜占致孔劑的比例為20%，交聯(lián)度為45%，致孔劑含量為66%為最優(yōu)配比。所合成的整體柱實現(xiàn)了反相色譜模式下對小分子苯系物與生物大分子蛋白的快速分離。其中蛋白分離實驗的流速達到104 μL·min-1，線速度約為12 mm·s-1，而常規(guī)色譜柱的線速度為1～2 mm·s-1。該整體柱的滲透性好，可用于物質(zhì)的高速分離，若對其進行化學修飾，有望用于其它色譜分離模式。

二元致孔劑；苯乙烯-二乙烯苯；反相色譜；毛細管；整體柱；高速分離

整體柱(Monolithic column)是將單體、交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑等混合后通過原位聚合制備而成的棒狀連續(xù)床層[1]，是一種可根據(jù)需要對整體材料的表面作相應(yīng)衍生化處理的連續(xù)整體多孔結(jié)構(gòu)。整體柱是應(yīng)復(fù)雜樣品體系(如生物樣品、環(huán)境樣品等)的快速、高效、高通量分析需要而發(fā)展起來的一種新型色譜柱，被譽為第4代分離介質(zhì)[2]，具有如下優(yōu)點：制備簡單，可原位制備；聚合反應(yīng)混合物中的單體可靈活選擇以改變性質(zhì)；通過控制聚合反應(yīng)的條件可優(yōu)化孔的性狀；內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻；多孔，柱容量高；可用于快速分離；易于衍生化等[3-5]。

整體柱按其制備方法可分為聚合物整體柱、硅膠整體柱、以填充為基礎(chǔ)的整體柱等[6]。聚苯乙烯類整體柱作為聚合物整體柱的一種，最早在1964年被提及，F(xiàn)réchet小組[7-9]以及Premstaller小組[10-11]對聚苯乙烯整體柱的制備與應(yīng)用做出了突出貢獻。如今，聚苯乙烯類整體柱[12-13]因性能穩(wěn)定、適用范圍廣等優(yōu)點，被廣泛用于有機小分子、蛋白質(zhì)、核酸等的分離[14]。聚苯乙烯類整體柱使用的單體種類較少，目前所使用的單體僅為苯乙烯、氯甲基苯乙烯、二乙烯基苯等[6]，或者少數(shù)經(jīng)功能團化學修飾的上述單體。引發(fā)劑為過氧化苯甲?；蚺嫉惗‰鎇15]，交聯(lián)劑為二乙烯基苯，致孔劑為甲醇、乙醇、丙醇、甲苯等[11]。

本方法首次引入二甲亞砜/正十二醇為二元致孔劑，充分考慮了致孔劑的選擇對聚合物結(jié)構(gòu)起的關(guān)鍵作用。二甲亞砜是一種常用試劑，易獲得，穩(wěn)定性好，不易與單體反應(yīng)，對極性和非極性物質(zhì)有較好的溶解性，可以更好地調(diào)節(jié)聚合物整體柱的孔結(jié)構(gòu)，且較少用于聚合物整體柱的制備，而正十二醇具有易取得和毒性小的優(yōu)點，因此用二甲亞砜和正十二醇作為致孔劑?？疾炝酥驴讋┑慕M成、交聯(lián)度以及致孔劑含量對整體柱床結(jié)構(gòu)與分離性能起的關(guān)鍵作用，采用最優(yōu)配比制成了在反相色譜模式下對小分子與生物大分子均有快速分離效果的毛細管整體柱。采用掃描電鏡觀察該整體柱的微觀結(jié)構(gòu)和孔徑分布；用逆體積排阻色譜法測孔徑分布與孔隙率[16]；通過測量柱壓與流動相流速的關(guān)系考察其通透性；用苯系物與蛋白質(zhì)樣品為目標探針測試該新型色譜整體柱的分離性能[17]。本方法中交聯(lián)度是指聚合前體混合物中交聯(lián)劑(二乙烯苯)的摩爾數(shù)占聚合前體(苯乙烯和二乙烯苯)總摩爾數(shù)的百分比。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

高壓注射泵(實驗室自制)，KQ2200E醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，DHG-9076A 型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，XL-30環(huán)境掃描電子顯微鏡(荷蘭Philips-FEI公司)，島津LC-20A高效液相色譜(配CBM-20A 控制器，LC-20AD高壓泵，SPD-20A二極管陣列檢測器及LC Solution色譜工作站等，日本Shimadzu)，AB704-N電子天平(Mettler)，石英毛細管(530 μm，永年銳灃色譜器件有限公司)，一次性塑料注射器(1 mL，上海康德萊企業(yè)發(fā)展集團有限公司)。

NaOH、HCl、丙酮、甲苯、二甲亞砜、正十二醇、過氧化苯甲酰、乙腈、甲醇、硫脲、苯(分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司)；γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲基硅烷(分析純，日本TCI公司)；苯乙烯(化學純，廣東汕頭市西隴化工廠)；二乙烯苯(化學純，F(xiàn)luka公司)；聚苯乙烯標準品(分子量分別為5 000、2 000 00、2 000 000，美國Alfa-Aesar)；四氫呋喃(色譜純，天津市光復(fù)精細化工研究所)；乙苯(化學純，上海國藥集團化學試劑有限公司)；正丙苯、正丁苯、正戊苯(分析純，美國Alfa Aesar)，核糖核酸酶A、細胞色素C、肌紅蛋白、三氟乙酸(色譜純)均購自美國Sigma公司；去離子水(南京娃哈哈飲料有限公司)。

1.2 PS-DVB毛細管整體柱的制備

圖1 內(nèi)壁的活化與硅烷化示意圖Fig.1 Activation and silylation of the capillary

毛細管的預(yù)處理：毛細管內(nèi)壁活化與硅烷化的反應(yīng)示意圖如圖1所示[18]。

毛細管柱的柱管材料選用530 μm內(nèi)徑的熔融石英毛細管，依次用色譜純丙酮清洗15～30 min，1 mol·L-1NaOH溶液沖洗活化1～3 h，純水沖洗1～2 h，0.5 mol·L-1HCl溶液沖洗2～3 h，純水清洗毛細管內(nèi)壁1 h，再充滿丙酮，最后于氣相色譜柱溫箱中，通氮氣干燥(160 ℃，1 h)，用硅橡膠塊兩端封口，保存于干燥處，使內(nèi)壁獲得豐富的游離型硅羥基。然后進行硅烷化，將γ-MAPS 與甲苯以體積比3∶7混合，再將此混合液注入毛細管(封口，室溫過夜)，用丙酮洗，最后通氮氣吹干。

圖2 共聚反應(yīng)示意圖Fig.2 Process of copolymerization

整體柱的制備：管中原位整體聚合反應(yīng)制備PS-DVB整體柱的反應(yīng)原理如圖2所示。

以苯乙烯與二乙烯苯為單體混合物，二甲亞砜和正十二醇為致孔劑，過氧化苯甲酰為引發(fā)劑。各單體混合物、致孔劑按一定的體積比混合，引發(fā)劑按反應(yīng)單體混合物質(zhì)量的1%加入?；旌暇鶆?，氮吹超聲振蕩脫氣后用一次性注射器注入已預(yù)鍵合的毛細管中，兩端封口。豎直放入烘箱，于70 ℃下反應(yīng)24 h。最后，用高壓平流泵驅(qū)動乙腈水溶液沖洗，除去致孔劑后即得到多孔結(jié)構(gòu)的連續(xù)整體式毛細管液相色譜微柱。

1.3 PS-DVB毛細管整體柱的表征

1.3.1整體柱孔徑分布的觀察采用掃描電鏡(SEM)觀察整體柱的孔徑分布。截取2～5 mm長度的一小段毛細管整體柱，用雙面膠粘在鋁合金座上，用環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察整體柱微觀結(jié)構(gòu)和孔徑分布。每個整體柱至少記錄3張電鏡照片：柱截面整體形貌(200倍放大)，管壁與柱床鍵合層(2 000倍放大)，雙孔結(jié)構(gòu)(5 000倍放大)以及粒度分布(2 000倍放大)。

1.3.2整體柱孔徑分布的考察采用逆體積排阻色譜法，用已知分子量的甲苯和聚苯乙烯標準品為目標探針，獲得整體柱在濕態(tài)下的孔隙率和孔徑分布。流動相為四氫呋喃(等度洗脫)，流速為0.005 mL·min-1，進樣體積為0.2 μL，檢測254 nm處的吸收強度。將所得數(shù)據(jù)作成峰強度～保留體積的譜圖，即ISEC圖。

1.3.3整體柱通透性的考察聚合物填料的耐壓性是其用作HPLC固定相的重要參數(shù)，當其他色譜條件不變時，柱壓降與流速呈線性關(guān)系[19]。以常用的色譜流動相(乙腈、純水、甲醇、四氫呋喃)測整體柱的柱壓與流速關(guān)系?？紤]到柱子的承受能力，選擇流速在0～300 μL· min-1范圍內(nèi)變化。

1.3.4整體柱對小分子物質(zhì)的分離能力以苯系物樣品為目標探針測試整體柱對小分子的分離性能?；旌蠘悠返呐渲迫缦拢毫螂?.1 g，苯100 μL，甲苯90 μL，乙苯110 μL，丙苯100 μL，丁苯110 μL，用ACN-H2O(體積比7∶3)溶解并定容至10 mL，混勻。

接入自制的整體柱，流動相為ACN-H2O(體積比7∶3)，等度洗脫，流速為0.013 mL· min-1，進樣體積為0.2 μL，檢測254 nm處吸收強度。

1.3.5整體柱對大分子物質(zhì)的分離能力以蛋白質(zhì)樣品為目標探針測試整體柱對大分子的分離性能?；旌蠘悠返呐渲迫缦拢阂訟CN-H2O(7∶3)溶解并制成核糖核酸酶標準溶液1.0 g·L-1，細胞色素標準溶液0.93 g·L-1，馬肌紅蛋白標準溶液1.0 g·L-1，再以體積比1∶1∶1混合。

接入自制的整體柱，流動相為0.05% TFA-CAN/0.05% TFA-H2O，梯度洗脫，流速為0.050 mL·min-1，進樣體積為0.2 μL，檢測214 nm處吸收強度。

2 結(jié)果與討論

2.1 致孔劑組成的影響

將單體與交聯(lián)劑占聚合混合物的比例定為30%，交聯(lián)度定為50%，二甲亞砜占致孔劑的比例由0%～100%變化，考察致孔劑組成的影響。結(jié)果表明，隨著致孔劑中二甲亞砜含量的增大，聚合物的孔徑與粒徑逐漸減小。這符合相分離機理，二甲亞砜對聚合物種子是良溶劑，使得相分離推遲，進而表現(xiàn)為聚合物的孔徑與粒徑逐漸減小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二甲亞砜占致孔劑的比例為20%時孔徑分布最好，此時聚合物對小分子的苯系物和大分子的蛋白質(zhì)樣品均有較好的分離效果[20]。

2.2 交聯(lián)度的影響

固定單體與交聯(lián)劑占聚合混合物的比例及二甲亞砜占致孔劑的比例分別為30%、20%，交聯(lián)度由10%～50%變化。結(jié)果顯示，隨著交聯(lián)度的增大，聚合物的孔徑逐漸減小，而粒徑并未明顯變化。這是由于隨著交聯(lián)度的增大，交聯(lián)劑含量增加，相分離較早發(fā)生，使得聚合物的孔徑下降。并且由于對粒徑起主導(dǎo)作用的致孔劑含量相同，且交聯(lián)度的變化范圍較小，故粒徑并未明顯變化。

當交聯(lián)度為45%與50%時，對小分子的苯系物和大分子的蛋白質(zhì)樣品均有較好的分離效果。同時，考慮到采用功能基化的苯乙烯作為聚合單體時可以引入盡量多的功能基，因此選擇交聯(lián)度為45%。

2.3 致孔劑含量的影響

固定交聯(lián)度為45%，二甲亞砜占致孔劑的比例為20%，考察了致孔劑含量(50%～75%)的影響。結(jié)果表明，隨著致孔劑含量的降低，孔徑與粒徑均明顯減小。這是由于隨著致孔劑含量的降低，單體與交聯(lián)劑的含量逐漸增大，反應(yīng)初期的聚合物種子越多，最終導(dǎo)致孔徑與粒徑均明顯減小。當致孔劑含量為66%時，對小分子的苯系物和大分子的蛋白質(zhì)樣品均有較好的分離效果。

2.4 優(yōu)化的實驗結(jié)果及討論

綜合上述實驗結(jié)果，通過對比不同配比合成的整體柱在分離烷基苯同系物及蛋白時的柱效評價其分離效果，發(fā)現(xiàn)聚合混合物的苯乙烯 ∶二乙烯苯 ∶二甲亞砜 ∶十二醇的體積比為18.7∶15.3∶13.2∶52.8時為最優(yōu)配比，此時，二甲亞砜占致孔劑的比例為20%，交聯(lián)度為45%，致孔劑含量為66%。對采用此配比制得的整體柱進行表征測試。

孔徑分布：整體柱的整體形貌(200倍放大)、管壁與柱體鍵合層(2 000倍放大)、雙孔結(jié)構(gòu)(5 000倍放大)與粒度分布(2 000倍放大)如圖3所示。結(jié)果表明，所制得的整體柱管壁與柱體鍵合良好，存在大孔與小孔結(jié)構(gòu)，基于此雙孔結(jié)構(gòu)可以實現(xiàn)物質(zhì)的分離。

圖3 整體柱的SEM圖Fig.3 SEM photographs of the monolithic columnA：macrocosm(×200)；B：bonding layer(×2 000)；C：dual pore structure(×5 000)；D：distribution of the particle(×2 000)

用甲苯、分子量分別為5 000、2 000 00、2 000 000的聚苯乙烯標準品進行ISEC測試，結(jié)果表明，該整體柱大孔網(wǎng)絡(luò)占總孔隙的比例近100%,因此柱壓很低。

通透性：考慮到柱子可能的承受能力，控制流速在0～300 μL·min-1內(nèi)變化，結(jié)果表明，流速在0～300 μL·min-1范圍內(nèi)與柱壓呈線性關(guān)系。說明此整體柱結(jié)構(gòu)均一、通透性好、機械性能穩(wěn)定。

分離性能：分離苯系物和蛋白質(zhì)的實驗結(jié)果如圖4所示。在苯系物的分離實驗中，以正丙苯分離為例，流速在13～78 μL·min-1范圍內(nèi)變化，柱效分別為3 350、1 702、1 230、1 263、1 110、952 N/m；在蛋白質(zhì)分離實驗中，以分離細胞色素C為例，在流速39～104 μL·min-1范圍內(nèi)，柱效分別為38 451、25 045、30 308、24 641、14 926 N/m。結(jié)果表明，隨著流速的增大，分離時間縮短。在高流速下，對蛋白的分離效果依然很好，而對苯系物的分離有一定影響。

圖4 不同流速下對苯系物(A)和蛋白(B)的分離Fig.4 Chromatograms of benzenes(A) and proteins(B) on monolithic columnA.column dimension,200 mm×0.530 mm;mobile phase,ACN-H2O(70∶30,by volume;UV at 254 nm;peaks:1.sulfourea;2.benzene;3.toluene;4.phenylethane;5.n-proplbenzene;6.n-butylbenzene;7.amylbenzene;B.column dimension,200 mm×0.530 mm;mobile phase,ACN-H2O system with different volume ratios,containing 0.1% trifluoroacetic acid;UV at 214 nm;peaks:1.ribonuclease A;2.benzene;3.myoglobin

在26 μL·min-1(線速度約為3 mm· s-1)流速下等度分離正丙苯的柱效達1 686 N/m(圖5A)；改變梯度洗脫條件，在104 μL·min-1(線速度約為12 mm·s-1)流速下梯度分離細胞色素C的柱效達到36 868 N/m，與圖4B的結(jié)果對比可知，分析時間進一步縮短(圖5B)。

圖5 對苯系物(A)和蛋白(B)的快速分離Fig.5 Chromatograms of benzenes(A) and proteins(B) on monolithic column the conditions and peak numbers denoted were the same as Fig.4

結(jié)果表明，此整體柱實現(xiàn)了對苯系物與蛋白的快速分離。其中蛋白分離實驗的流速達104 μL·min-1，線速度約為12 mm·s-1，而常規(guī)色譜柱的線速度為1～2 mm·s-1。此整體柱滲透性好，可用于物質(zhì)的高速分離。

3 結(jié) 論

本文首次以二甲亞砜/正十二醇為二元致孔劑用于整體材料的合成。所制備的整體柱對小分子與大分子均有良好的分離效果，其通透性好，柱壓降小，可用于快速分離物質(zhì)，為毛細管整體柱的制備提供了新的思路。采用帶反應(yīng)基團的苯乙烯衍生物進行聚合，再經(jīng)過柱上化學修飾，或直接采用帶功能基的苯乙烯衍生物進行整體聚合，可得到帶有不同功能基的聚苯乙烯整體柱，有望用于其它色譜分離模式。本研究中制備條件對柱結(jié)構(gòu)與性能的影響規(guī)律，對將來更深層的研究具有參考意義。

致謝：非常感謝廈門大學王秋泉教授以及廣東省測試分析研究所(中國廣州分析測試中心)付強博士的指導(dǎo)和幫助。

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Preparation and Characterization of a PS-DVB Monolithic Column Using Dimethylsulfoxide/Dodecanol as Binary Porogenic Agent

XU Han-qiu*

(Inspection of Products Quality of Longyan City,Longyan 364000,China)

A novel styrene-divinylbenzene copolymer monolithic capillary column was prepared using dimethylsulfoxide/dodecanol as binary porogenic agent.The polymer was prepared with styrene as monomer,divinylbenzene as crosslinker,benzoperoxide as initiator.In order to optimize the properties,the contents of the polymerized mixtures were investigated.Key variables such as composition of porogenic agent and crosslinking degree and content of porogenic agent in the mixtures could be controlled easily during the on-column polymerization.The PS-DVB monolithic column was characterized by scan electric microscopy(SEM),inverse size exclusion chromatography(ISEC),and measured under back pressure at different flow rates to evaluate the porous properties.Homologous compounds of benzene and some proteins were used as objective probes in reverse phase chromatography mode for evaluating the separation performance of the synthesized column.The optimum preparation conditions were as follows:the volume ratio of styrene and divinylbenzene and dimethylsulfoxide and dodecanol was 18.7∶15.3∶13.2∶52.8,that is,the content of dimethylsulfoxide in binary porogenic agent occupied 20%,the degree of crosslinking tooked up to 45% and the content of binary porogenic agent reached to 66%.The flow rate reached to 104 μL·min-1in the experiment for the separation of protein,and the line speed was about 12 mm·s-1,while the conventional speed was about 1-2 mm·s-1.With the advantage of excellent chromatographic separation efficiency for biological macromolecules,the monolithic capillary column could be available in other separation modes if it is chemically modified.

binary porogenic agent;styrene-divinylbenzene;reverse phase chromatography;dimethylsulfoxide;capillary;monolithic column;high speed separation

O652.63

:A

：1004-4957(2017)09-1139-06

2017-03-30；

：2017-05-18

*

：許涵秋，工程師，研究方向：分析化學，Tel：0597-3292395，E-mail：Rachelogo@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.015