鄭海松，毛 慎，丁 順，陳雪嬌，李云飛，宗 凱，操小棟，葉永康*

(1.安徽出入境檢驗檢疫局 技術(shù)中心，安徽 合肥 230022；2.合肥工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

納米金-還原氧化石墨烯修飾葡萄糖氧化酶傳感器的制備及其電流法檢測飲料中的葡萄糖

鄭海松1，毛 慎2，丁 順2，陳雪嬌1，李云飛1，宗 凱1，操小棟2，葉永康2*

(1.安徽出入境檢驗檢疫局 技術(shù)中心，安徽 合肥 230022；2.合肥工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

利用納米金(AuNPs)與還原氧化石墨烯(rGO)復(fù)合納米材料制備了葡萄糖氧化酶生物傳感器并用于飲料中葡萄糖含量的檢測。將殼聚糖作為還原劑及穩(wěn)定劑，通過一步法合成了AuNPs-rGO復(fù)合材料，并通過物理吸附固定葡萄糖氧化酶(GOx)來制作GOx生物傳感器。該傳感器在磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 6.0)中，-0.45 V(vs.Ag/AgCl)電位下電流法檢測葡萄糖含量，線性檢測范圍為0.01～0.88 mmol/L，靈敏度為22.54 μA·mmol-1·L·cm-2，檢出限為1.01 μmol/L，且表觀米氏常數(shù)為0.497 mmol/L。該傳感器用于多種飲料中葡萄糖含量的直接檢測，結(jié)果滿意。

納米金；還原氧化石墨烯；葡萄糖氧化酶；電流法；飲料；葡萄糖

葡萄糖氧化酶(GOx)作為識別原件對葡萄糖具有高選擇性，可在氧的存在下催化葡萄糖氧化成過氧化氫和葡糖酸內(nèi)酯[1]。基于GOx的電化學(xué)[1-3]和光譜生物傳感器[4-6]用于血液和食物中葡萄糖測定的研究已有報道。用于葡萄糖測定的電化學(xué)生物傳感器由于具有制備和應(yīng)用簡易，成本低，靈敏，選擇性高和能夠快速檢測葡萄糖的優(yōu)點，已成為研究熱點[4,7]。

石墨烯由于具有比表面積大、導(dǎo)電性良好和機械強度高等突出特點，在基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中獲得了極大的關(guān)注[8]，如制作可以檢測非法食品添加劑蘇丹紅Ⅰ的傳感器[9]。石墨烯類生物傳感器具有適合保持生物大分子活性的微環(huán)境[1,10]，且可以固定AuNPs[11]、PtNPs[12]、SiO2納米球[13]和TiO2納米球[14]等形成石墨烯納米復(fù)合材料(如GOx固定在鉑納米粒子功能化氮摻雜石墨烯納米復(fù)合材料上用于葡萄糖的測定[15])，在更寬的線性范圍、高靈敏度和低檢出限等方面顯示出優(yōu)異的分析性能。

本文利用殼聚糖作為還原劑和穩(wěn)定劑，進行一步法制備AuNPs-rGO納米復(fù)合材料用以固定GOx，構(gòu)建電化學(xué)GOx生物傳感器。對構(gòu)建過程中的pH值、酶濃度以及時間～電流響應(yīng)電位進行優(yōu)化，以提高其靈敏度，并在最優(yōu)條件下對該傳感器的性能進行了研究。使用本方法檢測飲料中葡萄糖，相比于酶比色法葡萄糖檢測試劑盒，方法操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

GOx、低分子量殼聚糖和GAGO-20葡萄糖檢測試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)；氧化石墨(南京吉倉納米科技有限公司)；氯金酸(HAuCl4，上海三愛思試劑有限公司)；麥芽糖(上海源聚生物科技有限公司)；D-果糖(北京索萊寶科技有限公司)；葡萄糖、乳糖、蔗糖、醋酸、Na2HPO4和NaH2PO4(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。其他化學(xué)試劑均為分析純。各種飲料購自超市。所有溶液配制均使用雙蒸餾水。

CHI 660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；透射電子顯微鏡(TEM，日本JEOL)；UV4802分光光度計(UNICO，尤尼柯上海儀器有限公司)。

1.2 AuNPs-rGO復(fù)合納米材料的合成

按文獻[10]報道略作調(diào)整，使用殼聚糖作為還原劑和穩(wěn)定劑一步法制備AuNPs修飾的rGO：超聲波24 h處理氧化石墨(1.0 mg/mL)得到棕色氧化石墨烯(GO)懸浮液，離心除去未剝離的氧化石墨，透析上清液除去鹽和酸。10 mg/mL HAuCl4溶液和50 μL 0.1 mol/L NaOH加入2.0 mL 1.5 mg/mL氧化石墨烯懸浮液中，85 ℃下劇烈攪拌10 min。然后加入10.0 mL 1.0 mg/mL殼聚糖(1.0%乙酸溶液)，120 ℃下攪拌24 h。最后，該AuNPs-rGO溶液冷卻并儲存在4 ℃?zhèn)溆?。作為空白對照，相同條件下分別合成rGO和AuNPs。

1.3 GOx/AuNPs-rGO修飾玻碳電極的制備

將直徑為3 mm的玻碳電極(GCE)拋光至鏡面并清洗后，以5.0 μL AuNPs-rGO溶液分散至其表面，4 ℃下干燥后得到AuNPs-rGO/GCE；再將5.0 μL 7.0 mg/mL GOx(0.1 mol/L pH 6.0 PBS溶液)滴涂在上述電極表面，制得GOx/AuNPs-rGO/GCE電極。用0.1 mol/L pH 6.0 PBS徹底清洗電極以除去未吸附的GOx，4 ℃下保存。

圖1 rGO(A)與rGO-AuNPs(B、C)的透射電子顯微鏡圖以及UV-Vis圖(D)Fig.1 TEM images of reduced graphene oxide (A)， rGO-AuNPs(HAuCl4∶GO = 1∶3) (B)，rGO-AuNPs (HAuCl4∶GO = 2.8∶3) (C) and UV-Vis absorption spectra (D)a:graphene oxide；b:rGO；c:rGO-AuNPs

1.4實際樣品的電化學(xué)檢測及試劑盒參照方法的建立

實際樣品檢測：樣品無需預(yù)處理，分別取樣10.0 μL，用雙蒸水稀釋至5.0 mL，組裝3支傳感器采用電流 ～時間響應(yīng)方法分析。當電流穩(wěn)定時，每隔50 s依次注入1.0 μL樣品，同一傳感器每個樣品測3次。葡萄糖試劑盒檢測方法根據(jù)產(chǎn)品說明書，樣品預(yù)處理后分別取樣10.0 μL，用雙蒸水稀釋至5.0 mL后測量。

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNPs-rGO納米復(fù)合材料的表征

2.2 GOx/AuNPs-rGO/GCE對葡萄糖的電催化反應(yīng)及分析性能

圖2 不同材料修飾電極在無氧PBS中的循環(huán)伏安圖Fig.2 CVs of the different material modified electrodes in N2-saturated PBSa.AuNPs-rGO/GCE;b.GOx/AuNPs/GCE;c.GOx/rGO/GCE;d.GOx/AuNPs-rGO/GCE

采用循環(huán)伏安法(CV)研究葡萄糖氧化酶的直接電化學(xué)。如圖2所示，在無氧條件下(底液為0.2 mol/L PBS，pH 7.0，掃描速率100 mV/s)，AuNPs-rGO/GCE(曲線a)在-0.7 ～ 0.0 V電位窗口內(nèi)無氧化還原峰，而GOx/AuNPs-rGO/GCE(曲線d)有1對對稱的氧化還原峰，其標準勢電位(E0’)和峰電位差(ΔEp)分別為-0.418 V和46 mV。此外，GOx/AuNPs-rGO/GCE的峰電流明顯大于GOx/AuNPs/GCE(曲線b)和GOx/rGO/GCE(曲線c)的峰電流。說明AuNPs-rGO復(fù)合物顯著加強了酶與電極之間的電子傳遞能力。無氧條件下，在20～500 mV/s范圍內(nèi)，ΔEp隨著掃描速率(v,mV/s)的增大而增大；陽極峰電流(Ipa)和陰極峰電流(Ipc)與掃描速率呈良好的線性關(guān)系。這表明GOx與電極表面之間的電子轉(zhuǎn)移是一個表面控制過程。當v為100 mV/s時，其電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)(Ks)為2.80 s-1。

圖3A為傳感器在不同底液中的循環(huán)伏安圖。在無氧的PBS中，GOx/AuNPs-rGO/GCE有1對明顯的氧化還原峰(曲線a)，說明GOx具有一個可逆的電化學(xué)反應(yīng)。但在含氧的PBS中，還原峰電流急劇增加而氧化峰電流降低(曲線b)，說明氧氣參與了反應(yīng)。然而在含氧的PBS中加入0.1 mmol/L葡萄糖后，因為氧氣的消耗，還原峰電流顯著下降(曲線c)。

圖3 GOx/AuNPs-rGO/GCE在PBS中的循環(huán)伏安表征(A)以及對葡萄糖的時間～電流響應(yīng)曲線(B)Fig.3 Cyclic voltammograms of GOx/AuNPs-rGO/GCE in phosphate buffer(A) and amperometric responses of GOx/AuNPs-rGO/GCE(B) upon successive additions of glucosea:N2-saturated; b:air-saturated; c:air-saturated phosphate buffer in presence of 0.1 mmol/L glucose

優(yōu)化了電極的檢測分析過程：包括AuNPs-rGO(2.8∶3)，酶負載量(7 mg/mL GOx)，緩沖液的酸堿度(pH 6.0 PBS)和電流測量的工作電位(-0.45 V)等條件。采用I～t方法在最優(yōu)的實驗條件下研究GOx/AuNPs-rGO/GCE傳感器對不同濃度葡萄糖的催化響應(yīng)(圖3B)，每50 s向5.0 mL體系中依次注入3次1.0 μL的0.01、0.05、0.1、0.2 mol/L葡萄糖溶液，隨著體系中葡萄糖濃度的增加，響應(yīng)電流持續(xù)降低。葡萄糖濃度與穩(wěn)態(tài)電流的線性關(guān)系顯示，當體系的葡萄糖濃度在0.01 ～ 0.88 mmol/L范圍內(nèi)時，葡萄糖的濃度與穩(wěn)態(tài)電流成正比，線性方程I(μA)=1.621-1.593cglucose(mmol/L) (r2= 0.999)，檢出限低至1.01 μmol/L(S/N=3)，傳感器的靈敏度高達22.54 μA·mmol-1·L·cm-2。表觀米氏常數(shù)Kmapp是酶促反應(yīng)中極為重要的動力學(xué)參數(shù)，表示酶與底物之間的親和能力。根據(jù)傳感器對葡萄糖的線性響應(yīng)，利用Lineweaver-Burk公式計算得到該傳感器的米氏常數(shù)為0.497 mmol/L。

表1比較了部分文獻用于葡萄糖的電流檢測研究的生物傳感器的分析性能，相較而言，本體系的Kmapp較小，表明該GOx傳感器對葡萄糖具有更高的親和力與酶活性，并具有更寬的線性范圍和更低的檢出限。

表1 不同葡萄糖生物傳感器的分析性能比較Table 1 Comparison of analytical performances of various glucose biosensors

Ru-FeNiHCM:ruthenium(Ⅲ),nickel(Ⅱ) and iron(Ⅱ) hexacyanometallate(HCM);GE:graphite electrode;CCE:carbon ceramic electrode;MWCNTs:multi-walled carbon nanotubes;GQD:graphene quantum dots;Cs:chitosan;TDN:titanium dioxide nanocluster;poly(BSeTT):poly(4,7-bis(thieno[3,2-b]thiophen-2-yl)benzo[c][1,2,5] selenadiazole)

2.3 GOx傳感器的選擇性、再現(xiàn)性及穩(wěn)定性

本文所提出的傳感器對葡萄糖檢測具有良好的選擇性。在PBS中依次加入0.05 mmol/L的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖和葡萄糖溶液，結(jié)果顯示，蔗糖、乳糖和果糖對葡萄糖的檢測幾乎無影響，麥芽糖略有影響(其響應(yīng)電流僅為葡萄糖的3.4%)，這可能是麥芽糖水解產(chǎn)生少量葡萄糖所致，總體而言，該生物傳感器的抗干擾性能強。

對傳感器穩(wěn)定性進行了考察。用6根玻碳電極組裝傳感器，其對0.1 mmol/L葡萄糖的響應(yīng)電流標準誤差為±0.010 8 mmol/L，以100 mV/s掃速進行循環(huán)伏安掃描，結(jié)果無明顯變化。同批GOx傳感器(n=3)的相對標準偏差(RSD)為1.46%，電極在4 ℃冰箱中放置1周后再進行測試，電流響應(yīng)仍為初始電流響應(yīng)的96.1%，表明在實驗期間未發(fā)生明顯的GOx損失。該GOx傳感器具有良好的測量穩(wěn)定性和壽命。

2.4 實際飲料樣品中葡萄糖的檢測

制備的GOx傳感器用于檢測15種飲料中的葡萄糖含量，以商業(yè)酶比色法試劑盒檢測結(jié)果作為對照。在優(yōu)化條件下，樣品無需任何預(yù)處理，直接注入檢測池記錄其安培響應(yīng)。樣品的濃度根據(jù)標準曲線計算得出。將生物傳感器所得的結(jié)果與比色法的結(jié)果進行比較(表2)。方法回收率為87%～112%；通過配對樣本檢驗，在0.05水平上，兩種方法之間無顯著性差異(t統(tǒng)計值為-0.040 89；P為0.967 96，P>|t|)。

表2 比色法和傳感器對各種飲料中葡萄糖含量的檢測結(jié)果Table 2 Detection results for glucose analysis in beverages obtained from the proposed biosensor and colorimetric method

(續(xù)表2)

SampleConcentrationofglucose(mmol/L)ColorimetricmethodThismethodRecovery(%)Sprite170 40±8 100169 71±6 900100Crystalgrapejuice191 12±9 830192 27±12 23299Sydneyjuice227 80±7 450231 09±8 46199Plum115 89±5 880133 87±21 16887Orangejuice(Nongfu)102 30±3 690114 40±12 62289Carrotjuice(Nongfu)94 67±1 53095 97±4 00099Grapefruitjuice(Nongfu)95 41±3 37093 31±3 200102WongLoKat5 49±0 6015 47±0 272100

3 結(jié) 論

本研究利用一步法還原制備了AuNPs-rGO復(fù)合材料用以在GCE表面固定GOx，所制備的GOx傳感器對葡萄糖顯示出良好的電催化能力。在優(yōu)化的分析條件下，將GOx/AuNPs-rGO傳感器直接用于飲料中葡萄糖含量的測定，與商品化的酶比色法葡萄糖檢測試劑盒相對照，兩種方法無顯著性差異；且用于制備傳感器的材料穩(wěn)定性好，GOx酶活度保持性好，線性范圍寬，靈敏度得到了提高。傳感器制備方便快捷，無需預(yù)處理樣品，保存條件簡單，壽命較長，具備在食品行業(yè)應(yīng)用的可能性。

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Preparation of a Gold Nanoparticles-Reduced Graphene Oxide Modified Glucose Oxidase Biosensor and Its Amperometric Determination of Glucose in Beverages

ZHENG Hai-song1,MAO Shen2,DING Shun2,CHEN Xue-jiao1,LI Yun-fei1,ZONG Kai1,CAO Xiao-dong2,YE Yong-kang2*

(1.Technology Center of Anhui Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Hefei 230022,China; 2.School of Food Science and Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)

An amperometric glucose oxidase(GOx) biosensor based on gold nanoparticles(AuNPs) -reduced graphene oxide(rGO) was fabricated for the detection of glucose in beverages.AuNPs-rGO composite was synthesized by one-pot method with chitosan as reducing and stabilizing agent.It was used as the matrix for GOx immobilization via physical adsorption technique to fabricate the GOx-based biosensor.The biosensor was applied in the amperometric determination of glucose at -0.45 V(vs.Ag/AgCl) in a phosphate buffer (0.1 mol/L，pH 6.0).There was a linear response to glucose in the concentration range of 0.01-0.88 mmol/L,with a sensitivity of 22.54 μA·mmol-1·L·cm-2and a detection limit of 1.01 μmol/L.The apparent Michaelis-Menten constant was rather small(0.497 mmol/L).The constructed biosensor was successfully applied in the detection of glucose in beverages.

gold nanoparticles; reduced graphene oxide; glucose oxidase; amperometric determination; beverage；glucose

O657.1；S951.4

：A

：1004-4957(2017)09-1114-05

2017-04-12；

：2017-05-17

安徽省自然科學(xué)基金項目(1508085MC42，1508085MC47)；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(31401573)；安徽省科技計劃項目(1604g0702051)

*

：葉永康，博士，副教授，研究方向：食品分析，Tel:0551-62903171，E-mail:yongkang.ye@hfut.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.010