于博昊,繆文彬,吳 婷,康 燕,姚建磊,張 磊*

(1．華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237；2．上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135)

光譜法與共焦熒光成像法研究羅丹明B與ct-DNA的相互作用

于博昊1,繆文彬2,吳 婷1,康 燕1,姚建磊1,張 磊1*

(1．華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237；2．上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135)

采用吸收光譜、熒光光譜以及共焦熒光成像技術(shù)研究生理條件下羅丹明B(Rhodamine B，RB)與小牛胸腺DNA(ct-DNA)的相互作用以及相互作用模式。光譜研究結(jié)果顯示，在450 ～650 nm的吸收光譜范圍內(nèi)，ct-DNA溶液對羅丹明B有減色作用；在560～660 nm熒光發(fā)射光譜范圍內(nèi)，ct-DNA對羅丹明B有熒光猝滅作用。同時，隨著ct-DNA的加入，羅丹明B溶液的熒光偏振值發(fā)生變化，說明羅丹明B與ct-DNA能發(fā)生相互作用。在競爭性實(shí)驗中，羅丹明B未能將亞甲基藍(lán)(MB)從MB-ct-DNA復(fù)合體系中置換出來，說明羅丹明B與ct-DNA通過溝槽結(jié)合方式發(fā)生相互作用。共焦熒光成像結(jié)果顯示，ct-DNA加入后，羅丹明B的熒光猝滅十分明顯。利用羅丹明B和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對HeLa細(xì)胞染色后進(jìn)行共焦熒光成像，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)羅丹明B與ct-DNA是通過溝槽結(jié)合作用將細(xì)胞核染成紅色。

羅丹明B(RB)；小牛胸腺DNA(ct-DNA)；溝槽結(jié)合；光譜法；共焦熒光成像

DNA作為生物的基本遺傳物質(zhì)，是一種十分重要的生物大分子，是遺傳信息的載體和基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)[1-4]。DNA分子的識別模式研究是當(dāng)今國際科學(xué)前沿領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，尤其在抗癌新藥的設(shè)計和研制上具有重大意義和廣闊前景。目前，許多抗癌藥物在細(xì)胞內(nèi)均以DNA為作用靶點(diǎn)[5-9]，通過與癌細(xì)胞的DNA發(fā)生相互作用破壞其雙螺旋結(jié)構(gòu)，影響基因調(diào)控與表達(dá)功能，抑制DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡。近年來，國內(nèi)外許多科學(xué)家均在研究DNA分子的識別模式，以期找到識別DNA分子的新型化合物。小分子化合物與DNA的相互作用主要有嵌插結(jié)合和溝槽結(jié)合。溝槽結(jié)合僅僅導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)的微小變化，但DNA依然保持“B”型結(jié)構(gòu)。嵌插結(jié)合是配體平面的一部分插入到DNA臨近的堿基對中，從而導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化，使得DNA鏈變長，變硬，并發(fā)生雙鏈解旋[10]。探索常用的小分子熒光化合物與DNA相互作用模式，對于靶向抗癌藥物的設(shè)計具有潛在的指導(dǎo)意義。羅丹明B是一種常用的以氧蒽酮為母體的堿性染料顯色劑，有較深的顏色，常被用作熒光探針。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

紫外-可見-近紅外分光光度計(美國Perkin Elmer，Lambda 950)，熒光/磷光/發(fā)光分光光度計(美國 PerkinElmer，PE LS55)，激光掃描共聚焦熒光顯微鏡(日本 Nikon，A1R)；亞甲基藍(lán)(MB)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)和羅丹明B(RB)均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司)；小牛胸腺DNA(ct-DNA，Sigma公司)溶液用pH 7.4 的Tris-HCl緩沖液(含0.5 mol·L-1NaCl)溶解，通過260 nm處的紫外吸收確定其濃度，ct-DNA在260 nm處的吸光系數(shù)為6 600 mol/L，于4 ℃保存；羅丹明B用超純水配成0.21 mmol/L儲備液備用；所用試劑均為分析純，實(shí)驗用水為超純水。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1吸收光譜法將0.21 mmol/L羅丹明B儲備液稀釋成10.60 μmol/L，取適量該稀釋液，依次加入不同體積的0.23 mmol/L ct-DNA，將混合溶液體系攪拌均勻，室溫放置5～10 min，在450～650 nm范圍內(nèi)測試含不同ct-DNA濃度混合溶液的吸收光譜。

1.2.2熒光光譜法將0.21 mmol/L羅丹明B儲備液稀釋成0.085 μmol/L，取適量該稀釋液，依次加入不同體積的0.23 mmol/L ct-DNA，將混合溶液體系攪拌均勻，室溫放置5～10 min，以554 nm為激發(fā)波長，在560～660 nm范圍內(nèi)測試含不同ct-DNA濃度混合溶液的熒光光譜。

1.2.3熒光偏振光譜法利用軟件采集熒光偏振值的功能，在進(jìn)行“1.2.2”實(shí)驗的同時，以最大吸收554 nm為激發(fā)波長，熒光發(fā)射峰576 nm為發(fā)射波長，積分時間1 s，自動采集含不同濃度ct-DNA的羅丹明B-ct-DNA溶液的熒光偏振值，繪制成曲線。

1.2.4競爭位點(diǎn)研究用超純水將亞甲基藍(lán)(MB)配成2.84 μmol/L的溶液，取適量該溶液，依次加入不同體積的0.23 mmol/L ct-DNA，將MB-ct-DNA混合溶液攪拌均勻，室溫放置5～10 min，以660 nm為激發(fā)波長，在650～800 nm范圍內(nèi)測試含不同濃度ct-DNA混合溶液的熒光光譜。

依次將不同體積的羅丹明B加入到上述最終的MB-ct-DNA混合體系中，以660 nm為激發(fā)波長，在625～825 nm范圍內(nèi)測試含不同濃度羅丹明B混合溶液的熒光光譜。

1.2.5共焦熒光成像涂片成像：取0.085 μmol/L羅丹明B溶液2 μL涂片，然后用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行掃描成像觀察。然后取0.085 mmol/L ct-DNA溶液2 μL涂在該片上，再次進(jìn)行掃描成像觀察。

服裝產(chǎn)業(yè)鏈中SCM、CRM、ERP、CAD等系統(tǒng)的應(yīng)用較普遍。這些系統(tǒng)相對獨(dú)立，在企業(yè)內(nèi)部形成了大量的各自獨(dú)立的數(shù)據(jù)庫，可以稱之為 “數(shù)據(jù)孤島”。當(dāng)下，企業(yè)信息化的重點(diǎn)是如何連通各業(yè)務(wù)部門所產(chǎn)生的 “數(shù)據(jù)孤島”，提高信息傳遞效率，完善業(yè)務(wù)流程。

細(xì)胞成像：將宮頸癌細(xì)胞(HeLa)培養(yǎng)4 h，分別用DAPI和羅丹明B對細(xì)胞染色，進(jìn)行細(xì)胞成像觀察。

圖1 ct-DNA濃度對羅丹明B吸收光譜的影響Fig.1 Absorption spectra of Rhodamine B in the presence of various concentration of ct-DNAcct-DNA(1-14)：0，2.28,4.51,6.70，8.85，10.95，13.02，15.05，17.04，20.91，24.64，30.00，36.72，44.52 μmol/L,respectively

圖2 ct-DNA濃度對羅丹明B熒光光譜的影響Fig.2 Fluorescence spectra of Rhodamine B in the presence of various concentration of ct-DNAcct-DNA(1-11)：0，1.10，2.28，3.40，4.51,5.61，6.70，7.78，8.85，9.90，10.95 μmol/L,respectively

2 結(jié)果與討論

2.1 ct-DNA與羅丹明B相互作用的吸收光譜

吸收光譜能簡單而有效地檢測出小分子化合物與DNA的結(jié)合情況。當(dāng)小分子和DNA相互作用并形成新的復(fù)合物時，通常伴有吸收強(qiáng)度和吸收帶位置的變化[11]。ct-DNA與羅丹明B相互作用的吸收光譜如圖1所示。羅丹明B的濃度為10.60 μmol/L時，最大吸收峰位于554 nm，隨著ct-DNA濃度的增加，吸光度從1.02降至0.58，吸收光譜表現(xiàn)出明顯的減色現(xiàn)象，這表明羅丹明B與ct-DNA發(fā)生了相互作用，兩者的結(jié)合方式可能為溝槽結(jié)合[12]。同時，最大吸收峰位置幾乎不發(fā)生變化，這表示兩者的結(jié)合形式為非嵌插作用[13]。

2.2 ct-DNA對羅丹明B的熒光猝滅

熒光猝滅的研究可為考察羅丹明B與ct-DNA的相互作用模式提供重要的理論依據(jù)。由圖2可以看出，室溫條件下向羅丹明B中加入ct-DNA后，隨著ct-DNA濃度的增加，熒光發(fā)射峰位于576 nm，幾乎沒有發(fā)生變化，而羅丹明B的熒光強(qiáng)度從432依次降低至287。這說明ct-DNA可使羅丹明B的固有熒光猝滅，兩者能發(fā)生相互作用。

2.3 熒光偏振光譜

熒光偏振值可以反映熒光分子的轉(zhuǎn)動情況，當(dāng)熒光小分子結(jié)合到大分子上時，熒光分子的偏振值會發(fā)生改變，這種定量測試的方法不受溶液濃度或者環(huán)境條件的影響，可以快速、簡單、方便地表征熒光分子與大分子相互反應(yīng)作用的程度[14]。如果熒光小分子的偏振值升高，說明大分子限制了熒光小分子的自由轉(zhuǎn)動，兩者發(fā)生了相互作用。實(shí)驗表明，在羅丹明B溶液中逐漸加入ct-DNA后，隨著ct-DNA濃度的提高，羅丹明B-ct-DNA體系的偏振值由0.056逐漸升至0.062，表明羅丹明B結(jié)合到ct-DNA上，兩者發(fā)生了相互作用。ct-DNA限制了羅丹明B的自由轉(zhuǎn)動，使得羅丹明B的分子轉(zhuǎn)動速度降低。

2.4羅丹明B與MB競爭ct-DNA結(jié)合位點(diǎn)的研究

亞甲基藍(lán)(MB)是一種常見的DNA嵌插結(jié)合劑，故常用作熒光探針來研究化合物與雙鏈DNA的結(jié)合機(jī)制[15]。如圖3A所示，隨著體系中ct-DNA濃度的升高，通過嵌插結(jié)合，MB自身熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯的變化，ct-DNA能夠猝滅MB的熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度從371降至211，同時，MB的熒光發(fā)射峰發(fā)生明顯藍(lán)移，從695 nm藍(lán)移至690 nm，這說明兩者發(fā)生相互作用，生成了復(fù)合物。如果羅丹明B也能通過嵌插作用與ct-DNA結(jié)合，將會與MB共同競爭DNA上的結(jié)合位點(diǎn)，從而導(dǎo)致MB-ct-DNA復(fù)合體系的熒光強(qiáng)度顯著下降[16]。由圖3B看出，隨著溶液中羅丹明B濃度的升高，MB-ct-DNA體系的熒光強(qiáng)度為602～605，未發(fā)生顯著變化，熒光發(fā)射峰位置在687～688 nm之間，也未發(fā)生顯著變化，這說明羅丹明B未能置換出MB，兩者沒有形成競爭機(jī)制，而是形成了羅丹明B-MB-ct-DNA新的三元體系。這進(jìn)一步證明了羅丹明B與ct-DNA的結(jié)合方式不是嵌插結(jié)合，而是溝槽結(jié)合。

圖3 ct-DNA濃度對MB熒光光譜的影響(A)以及羅丹明B溶液滴定MB-ct-DNA體系的熒光光譜(B)Fig.3 Fluorescene spectra of MB in the presence of various concentration of ct-NDA(A) and fluorescene spectra of MB-ct-DNA complexes in the presence of varying concentration of Rhodamine B(B)A.cct-DNA(1-9)：0，0.34，0.69，0.92，1.14，1.37，1.60，1.83，2.05 μmol/L,respectively；B.cRB(1-9)：0，0.25，0.45，0.65，0.84，1.03，1.21，1.39，1.57 μmol/L,respectively

2.5 共焦熒光成像

激光掃描共聚焦熒光顯微鏡由于具有觀察細(xì)胞標(biāo)記的效率高，對活細(xì)胞毒副作用小等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞或者材料等的成像。

在設(shè)置相同參數(shù)掃描時，圖4A中羅丹明B溶液的共焦熒光成像圖呈現(xiàn)均勻的亮紅色。加入ct-DNA后，由于配制ct-DNA溶液的Tris-HCl緩沖液中含有NaCl，激光掃描后該體系部分呈現(xiàn)結(jié)晶狀態(tài)，圖4B中圖片亮度明顯變暗，說明ct-DNA對羅丹明B有明顯的熒光猝滅作用。

圖4 羅丹明B溶液(A)和羅丹明B-ct-DNA溶液(B)的共焦熒光成像圖Fig.4 Confocal imaging of Rhodamine B(A) and Rhodamine B-ct-DNA(B)

DAPI是一種熒光染料，可以穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)揮標(biāo)記的作用，可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光，熒光顯微鏡下可以看到顯藍(lán)色熒光的細(xì)胞核。利用共焦熒光分別對DAPI和羅丹明B染色的HeLa細(xì)胞進(jìn)行成像(如圖5)。圖5A、B、C、D分別為DAPI染細(xì)胞核、羅丹明B染細(xì)胞、細(xì)胞明場、疊加場的共焦熒光成像圖。由圖5B可以看出，羅丹明B可將細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜染上均勻的紅色。因為DAPI與DNA具有很強(qiáng)的溝槽結(jié)合作用[17]，能將細(xì)胞核染上藍(lán)色，由此可以看出羅丹明B與DNA通過溝槽結(jié)合作用能將細(xì)胞核染上紅色。

圖5 DAPI和羅丹明B染色的HeLa細(xì)胞共焦熒光成像圖Fig.5 Confocal imaging of HeLa cell dyed by DAPI and Rhodamine BA:HeLa cell nuclear dyed by DAPI;B:HeLa cell dyed by RB;C:HeLa cell bright field image;D:HeLa cell merged image

3 結(jié) 論

本文采用光譜法和共焦熒光成像法研究了羅丹明B與ct-DNA的相互作用模式。吸收光譜、熒光光譜研究結(jié)果表明，ct-DNA對羅丹明B有減色和熒光猝滅作用；羅丹明B溶液的熒光偏振值發(fā)生變化，說明兩者發(fā)生相互作用；吸收光譜的最大吸收峰位置沒有發(fā)生位移，說明兩者屬于非嵌插結(jié)合；羅丹明B未能將MB從MB-ct-DNA體系中置換出來，說明羅丹明B與ct-DNA為溝槽結(jié)合。共焦熒光成像結(jié)果表明，羅丹明B與ct-DNA通過溝槽作用能將細(xì)胞核染成紅色。本文為研究其他小分子熒光化合物與DNA的相互作用模式提供了快速、簡單、直觀的方法，同時對于設(shè)計、合成和篩選靶向DNA的化合物具有重要的指導(dǎo)和借鑒意義。

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Study on Interaction between Rhodamine B and Calf Thymus DNA by Spectroscopy and Confocal Imaging

YU Bo-hao1,MIU Wen-bin2,WU Ting1,KANG Yan1,YAO Jian-lei1,ZHANG Lei1*

(1.School of Chemistry & Molecular Engineering,East China University of Science and Technology，Shanghai 200237,China；2.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135,China)

The interaction between Rhodamine B and calf thymus DNA(ct-DNA) at physiological conditions were studied by the techniques of absorption spectroscopy,fluorescence spectroscopy and confocal imaging.The results of spectroscopy experiments suggested that the hypochromicity of Rhodamine B could appear in the presence of ct-DNA from 450 nm to 650 nm in the absorption spectroscopy,and the fluorescence of Rhodamine B was quenched in the presence of ct-DNA from 560 nm to 660 nm in the fluorescence emission spectroscopy.At the same time，the fluorescence polarization of Rhodamine B varied with the addition of ct-DNA.It was indicated that Rhodamine B could interact with ct-DNA.In the competition experiments,Rhodamine B was unable to replace methylene blue(MB) from MB-ct-DNA complex.It was indicated that the interaction between Rhodamine B and ct-DNA took place by the mode of groove combination.The results of confocal imaging experiments showed that the fluorescence of Rhodamine B was quenched quite obviously after the addition of ct-DNA.HeLa cells were dyed with Rhodamine B and 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI),then used for confocal imaging.It was further verified that the cell nucleus could be dyed red through the groove combination interaction between Rhodamine B and ct-DNA.

Rhodamine B；ct-DNA；groove combination；spectroscopy；confocal imaging

O433.4；O641.3

:A

：1004-4957(2017)09-1087-06

2017-03-13；

：2017-06-01

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2016IK227)

*

：張 磊，博士研究生，工程師，研究方向：光譜分析，Tel：021-64253225，E-mail：leizhang595@126.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.005