祁澤文,孫鑫博,樊波,張雪,袁建波,韓烈保*

(1.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所,北京 100083；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)河北省作物生長(zhǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定071001；3.深圳市園藝園林建設(shè)有限公司,廣東 深圳518038)

PEG介導(dǎo)的柳枝稷葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系的建立

祁澤文1,孫鑫博2,樊波3,張雪1,袁建波1,韓烈保1*

(1.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所,北京 100083；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)河北省作物生長(zhǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定071001；3.深圳市園藝園林建設(shè)有限公司,廣東 深圳518038)

為了建立以PEG介導(dǎo)的柳枝稷葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系,本研究以柳枝稷 Alamo品種的葉片為材料,通過(guò)設(shè)計(jì)梯度實(shí)驗(yàn)確定柳枝稷原生質(zhì)體分離的最佳條件, 每組梯度實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次, 方案如下：1)對(duì)植物培養(yǎng)的時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。酶解時(shí)間固定在8 h, 甘露醇濃度為0.6 mol/L, 將培養(yǎng)了1, 2, 3和4周的黃化苗用作實(shí)驗(yàn)材料；2)滲透壓優(yōu)化。選取2周的黃化苗為實(shí)驗(yàn)材料, 酶解時(shí)間固定在8 h, 甘露醇濃度分別為0.4, 0.5, 0.6， 0.7和0.8 mol/L；3)酶解時(shí)間優(yōu)化。選取2周的黃化苗為實(shí)驗(yàn)材料, 甘露醇濃度為0.6 mol/L, 酶解時(shí)間分別為6, 7, 8, 9和10 h。通過(guò)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),苗齡為2周的柳枝稷黃化苗葉片在甘露醇為0.6 mol/L的酶解液中, 黑暗, 28 ℃并裂解8 h后分離的原生質(zhì)體最為理想。接下來(lái)構(gòu)建了能夠在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GFP-MYB103融合蛋白(GFP為綠色熒光蛋白)的重組質(zhì)粒LN-OsMYB103, 利用PEG介導(dǎo)法將質(zhì)粒LN-OsMYB103轉(zhuǎn)化進(jìn)入柳枝稷原生質(zhì)體, 并且在激光共聚焦顯微鏡下觀察到了強(qiáng)烈的綠色熒光蛋白信號(hào)。該結(jié)果表明, 分離的原生質(zhì)體可以行使正常生物學(xué)功能。綜上所述, 利用柳枝稷葉片建立了一套完整的柳枝稷葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系。這將為深入開展柳枝稷的功能基因組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

柳枝稷；PEG；原生質(zhì)體；瞬時(shí)表達(dá)

在現(xiàn)代分子生物學(xué)中, 瞬時(shí)表達(dá)方法已經(jīng)成為了研究基因的重要手段, 被逐漸應(yīng)用到各類生物學(xué)的研究中。植物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的建立, 為研究啟動(dòng)子活性、基因功能和蛋白質(zhì)定位提供了便利[1-2]。柳枝稷(Panicumvirgatum)屬禾本科黍亞科黍?qū)? 是一種多年生高稈的C4植物, 它起源于北美洛基山脈以東、北緯55°以南[3-4], 柳枝稷能用種子繁殖, 具有耐干旱, 耐貧瘠, 適應(yīng)性強(qiáng), 生物量潛力高等優(yōu)良品質(zhì), 常被用于放牧、生態(tài)建設(shè), 目前也是一種重要的生物燃料作物。在化石燃料儲(chǔ)量逐步下降、環(huán)境保護(hù)日益嚴(yán)峻的今天, 生物燃料受到了各國(guó)的高度重視, 生物燃料的原料來(lái)源成為生物燃料可持續(xù)發(fā)展的重要課題, 因此柳枝稷引起了國(guó)內(nèi)外的重視[5-9]。

柳枝稷是一種異源多倍體植物, 具有自交不親和的遺傳特性, 通過(guò)傳統(tǒng)育種方法對(duì)其進(jìn)行改良存在巨大的困難[5]。隨著技術(shù)的進(jìn)步, 現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展, 通過(guò)基因工程手段進(jìn)行遺傳改良成為一種快捷、有效的育種手段, 可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)育種的不足[10-11]。

外源基因在植物中表達(dá)有兩種方式：一種通過(guò)農(nóng)桿菌或者基因槍介導(dǎo)的方式, 外源基因整合到植物基因組中, 進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)；一種是在植物材料中進(jìn)行順利表達(dá)的方法。而瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的方法主要有：基因槍轟擊法[12]、農(nóng)桿菌侵染法[13]、PEG(polyethylene glycol, 聚乙二醇)[14]介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化等方法。PEG轉(zhuǎn)化法是一種通過(guò)PEG的滲透作用, 將外源基因轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中的方法, 使用PEG法不僅費(fèi)用低、操作簡(jiǎn)便、不需特定儀器而且結(jié)果準(zhǔn)確[15-16]。通過(guò)這種方法在很多植物中獲得了成功, 例如在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、玉米(Zeamays)、柑橘(Citrusparadisi)和軟棗獼猴桃(Actinidiaargute)等原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系中, 外源 DNA 轉(zhuǎn)化率均能達(dá)到10%以上[17]。模式植物擬南芥的外源DNA轉(zhuǎn)化率更是達(dá)到90%[2,18-20], 并為其功能基因組和基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

在柳枝稷的遺傳轉(zhuǎn)化研究中, 國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有很多學(xué)者進(jìn)行了嘗試, 如Liu等[21]、Mazarei等[22]成功地建立了柳枝稷的遺傳轉(zhuǎn)化方法。而在原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)的研究中, 國(guó)內(nèi)外尚處于體系建立的探索階段[23-25]。因此針對(duì)這點(diǎn), 本課題組進(jìn)行原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系的建立。要優(yōu)化以PEG介導(dǎo)法建立的柳枝稷葉肉原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系, 優(yōu)化原生質(zhì)體制備條件尤為重要。水稻(Oryzasativa)和柳枝稷同屬于禾本科植物, 可借鑒中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所朱立煌課題組的水稻原生質(zhì)體分離方法分離柳枝稷的原生質(zhì)體, 以此為基礎(chǔ), 本研究使用柳枝稷品種Alamo黃化苗原生質(zhì)體為材料, 借鑒水稻原生質(zhì)體分離方法并利用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法, 對(duì)柳枝稷原生質(zhì)體分離主要因素進(jìn)行分析及優(yōu)化, 建立分離的原生質(zhì)體的體系，并在此基礎(chǔ)上建立一套簡(jiǎn)單、高效的柳枝稷葉肉原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系, 優(yōu)化柳枝稷的遺傳轉(zhuǎn)化體系, 旨在為提高柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化效率和改良柳枝稷的遺傳特性奠定基礎(chǔ), 并推動(dòng)柳枝稷在分子及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2016年 9 月至 2016 年12 月在中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所朱立煌組實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1供試材料

供試柳枝稷 Alamo品種的成熟種子購(gòu)于美國(guó) Ernst Conservation Seeds 公司。

1.2黃化苗的準(zhǔn)備

選取柳枝稷種子, 在70%酒精中浸泡2 min 后, 將種子放在滅菌液(成分：巴士消毒液20%, 滅菌水80%)中, 在150 r/min的搖床上, 室溫, 30 min。種子滅完菌后用滅菌水洗凈, 在超凈工作臺(tái)下吹干, 然后播在滅菌的營(yíng)養(yǎng)土中, 并維持在(28±2) ℃, 黑暗條件下培養(yǎng)。

1.3酶解液優(yōu)化

參考水稻原生質(zhì)體的提取方法[26], 在此基礎(chǔ)上優(yōu)化條件, 使該方法適用于柳枝稷。原配方成分為酶解液, W5溶液, Mmg溶液和40% PEG溶液。具體的配方如下：酶解液為0.6 mol/L甘露醇(D-mannitol), 10 mmol/L MES [2-(N-嗎啡啉)乙磺酸,pH 5.7], 1.5% 纖維素酶(Cellulase RS), 0.75%果膠酶(Macerozyme), 0.1% BSA(牛血清白蛋白), 3.4 mmol/L CaCl2, 5 mmol/L β-羥基乙醇(β-mercaptoethanol)和50 μg/mL羧芐青霉素(carbenicillin)；W5溶液為154 mmol/L NaCl, 125 mmol/L CaCl2, 5 mmol/L KCl和2 mmol/L MES；Mmg溶液為0.6 mol/L甘露醇, 15 mmol/L MgCl2和4 mmol/L MES;40% PEG溶液為0.6 mol/L甘露醇, 100 mmol/L CaCl2和40% PEG4000 (聚乙二醇4000)。

設(shè)計(jì)梯度實(shí)驗(yàn), 確定柳枝稷原生質(zhì)體分離的最佳條件, 每組梯度實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。具體方案如下：1)對(duì)植物培養(yǎng)的時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。 酶解時(shí)間固定在8 h, 甘露醇濃度為0.6 mol/L, 將培養(yǎng)了1, 2, 3和4周的黃化苗用作實(shí)驗(yàn)材料；2)滲透壓優(yōu)化。 選取2周的黃化苗為實(shí)驗(yàn)材料, 酶解時(shí)間固定在8 h, 甘露醇濃度分別為0.4, 0.5, 0.6， 0.7和0.8 mol/L；3)酶解時(shí)間優(yōu)化。 選取2周的黃化苗為實(shí)驗(yàn)材料, 甘露醇濃度為0.6 mol/L, 酶解時(shí)間分別為6, 7, 8, 9和10 h。

1.4原生質(zhì)體提取方法

首先使用全新的刀片將柳枝稷黃化幼苗的葉片切割成1 mm寬的細(xì)條。用鑷子將切好的苗條放在含20 mL酶溶液的150 mL燒瓶中, 放置28 ℃的黑夜中振蕩(40～60 r/min)培養(yǎng), 4 h后從燒瓶中取10 μL, 在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體。健康的原生質(zhì)體應(yīng)是圓形的并沒(méi)有其他細(xì)胞。酶解完成后, 原生質(zhì)體及酶的混合液經(jīng)35 μm(100 μm)的篩網(wǎng), 除去未完全酶解的材料。濾液經(jīng)916 r/min離心5 min, 去掉上清。向沉淀(原生質(zhì)體)加入3 mL的W5溶液使其懸浮, 再向管底加入5 mL的CPW20溶液[附加20%蔗糖的CPW鹽溶(細(xì)胞原生質(zhì)體清洗液，cell protoplast wash medium)], 916 r/min離心4 min, 兩相中間出現(xiàn)一條純凈的原生質(zhì)體帶, 小心取出并以W5溶液重懸后等到純凈的原生質(zhì)體。取少量純化后的原生質(zhì)體懸浮液滴加在血球計(jì)數(shù)板上, 在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù), 依次計(jì)數(shù)中央大方格內(nèi)原生質(zhì)體數(shù), 重復(fù)3次。

原生質(zhì)體的密度(個(gè)/mL)=大方格(0.1 mm3,即0.1 μL)的原生質(zhì)體數(shù)×104

原生質(zhì)體產(chǎn)量(個(gè)/g)=原生質(zhì)體密度×原生質(zhì)體懸浮液總體積(mL)/制備原生質(zhì)體所用材料的鮮重

1.5載體構(gòu)建及顯微觀察

選用pEZR(K)-LN雙元載體用作亞細(xì)胞定位載體。該載體含CaMV 35S啟動(dòng)子和加強(qiáng)型的綠色熒光蛋白eGFP。OsMYB103基因是MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子, 根據(jù)Yang等[27]的方法, 將OsMYB103連接上LN載體 (pEZR-LN), 用于亞細(xì)胞定位的實(shí)驗(yàn)。

將制備好的原生質(zhì)體沖懸浮于Mmg溶液中。取10 μg的質(zhì)粒LN-PCF5放入2 mL離心管, 再加入200 mL重懸液, 輕輕混勻后在室溫下放置15 min, 接著加入220 μL的 40% PEG溶液, 輕輕混勻,室溫放置 15 min。用 880 μL的W5 溶液重新懸浮原生質(zhì)體, 輕彈管底混勻, 1183 r/min離心 2 min, 棄上清液。加入1 mL WI溶液(即洗滌培養(yǎng)液, washing and incubation solution, 配方為0.5 mol/L 甘露醇, 20 mol/L KCl和4 mmol/L MES) 重懸浮并轉(zhuǎn)移至經(jīng)BSA(牛血清白蛋白)預(yù)沖洗過(guò)的培養(yǎng)皿中, 24 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。之后用激光共聚焦顯微鏡(Leica, Germany)觀察鑒定。

2 結(jié)果與分析

圖1 不同時(shí)期的黃化苗提取柳枝稷原生質(zhì)體Fig.1 The preparation of switchgrass protoplasts with different periods of etiolated seedlings 甘露醇濃度為0.6 mol/L,酶解時(shí)間為8 h。 The concentration of mannitol: 0.6 mol/L; Enzymolysis time: 8 h. 不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05), 下同。Different lowercase letters mean significant difference (P<0.05). The same below.

2.1原生質(zhì)體提取條件優(yōu)化

2.1.1黃化苗培養(yǎng)時(shí)間 植物的幼嫩程度會(huì)極大地影響原生質(zhì)體提取效率, 在此首先針對(duì)植物培養(yǎng)的時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。在保持滲透壓和酶解時(shí)間不變的條件下, 選擇不同培養(yǎng)時(shí)間的黃化苗進(jìn)行原生質(zhì)體的提取。如圖1所示, 培養(yǎng)1周左右的黃化苗得到的數(shù)量較少, 且細(xì)胞也偏小, 不利于亞細(xì)胞定位的觀察；而培養(yǎng)2～3周的黃化苗能得到數(shù)量很多的原生質(zhì)體, 并且2周左右的苗子能得到最多數(shù)量原生質(zhì)體, 適用于亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)觀察。而超過(guò)3周后的柳枝稷黃化幼苗, 提取原生質(zhì)體的量開始減少。

2.1.2滲透壓優(yōu)化 植物細(xì)胞在缺少細(xì)胞壁的保護(hù)之后, 對(duì)外界的滲透壓會(huì)非常敏感。因此, 滲透壓的優(yōu)化是原生質(zhì)體提取的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。選擇2周大的黃化苗在保持酶解時(shí)間不變的條件下, 選擇不同滲透壓條件進(jìn)行原生質(zhì)體的提取。如圖2所示, 當(dāng)甘露醇濃度為0.4 mol/L時(shí), 得到非常少量的原生質(zhì)體, 隨著濃度上升, 原生質(zhì)體提取量迅速增大, 在甘露醇濃度為0.6 mol/L時(shí)原生質(zhì)體提取量達(dá)到了最大值。之后隨著甘露醇濃度的增大, 原生質(zhì)體的量又迅速的減少。

2.1.3酶解時(shí)間優(yōu)化 在黃化苗苗齡及滲透壓一致的條件下, 酶解時(shí)間能明顯影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量。如圖3所示, 酶解7和8 h都能獲得大量的原生質(zhì)體, 并且8 h獲得的原生質(zhì)體數(shù)最多。在酶解6～8 h之間, 原生質(zhì)體數(shù)量隨著酶解時(shí)間增大而顯著增加, 當(dāng)大于酶解8 h時(shí), 原生質(zhì)體數(shù)量則隨著酶解時(shí)間的增大而減小, 而且發(fā)現(xiàn)游離的細(xì)胞碎片明顯增多。

圖2 不同滲透壓下提取柳枝稷原生質(zhì)體Fig.2 The preparation of switchgrass protoplasts under different osmotic pressure

2周的黃化苗, 酶解時(shí)間8 h。 Etiolated seedlings of two weeks, enzymolysis time: 8 h.

圖3 不同酶解時(shí)間下提取原生質(zhì)體Fig.3 The preparation of switchgrass protoplasts in different enzymolysis time

甘露醇0.6 mol/L, 2周的黃化苗。The concentration of mannitol: 0.6 mol/L, etiolated seedlings of two weeks.

綜合分析影響柳枝稷葉肉原生質(zhì)體制備的主要因素, 柳枝稷葉肉原生體質(zhì)體系得以優(yōu)化。選取2周大的柳枝稷黃化幼苗為實(shí)驗(yàn)材料, 酶解液中甘露醇濃度為0.6 mol/L, 酶解8 h。流程如下：對(duì)Alamo柳枝稷種子進(jìn)行滅菌處理, 維持在(28±2) ℃, 黑暗條件下培養(yǎng)2周, 取柳枝稷黃化幼苗的葉片切割成1 mm寬的細(xì)條, 將切好的苗條與酶解液充分接觸(圖4a)，對(duì)得到的原生質(zhì)體進(jìn)行沉淀純化, 消除分離過(guò)程中的破裂細(xì)胞和未酶解的碎片, 獲得原生質(zhì)體(圖4b)?；谏鲜隽鞒趟玫降脑|(zhì)體大, 碎片少, 量多, 活性強(qiáng)(圖4c), 滿足進(jìn)一步的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)條件。

圖4 柳枝稷原生質(zhì)體的分離Fig.4 Separation of switchgrass protoplasts a:樣品的酶解反應(yīng)The enzymatic hydrolysis of the sample；b:原生質(zhì)體的沉淀純化Purification of protoplasts；c:柳枝稷原生質(zhì)體Protoplasts.

2.2亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建

從水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://rice.plantbiology.msu.edu)下載OsMYB103(ID：Os08g05520)的基因序列。根據(jù)序列信息LN載體的引物L(fēng)N-EcoRI-103: AGCTCAAGCTTCGAATTCATGGGGCATCACTCTTGCTGC; LN-BamHI-103: AGCGGCAGCAGCCGGATCCTTAATCATGGTCATTTGGTCCCATA, 用高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增, 其長(zhǎng)度約為1000 bp。將擴(kuò)增片段連上載體pEASY-T5(CT501, 全式金), 通過(guò)熱激導(dǎo)入到菌株為BH5a的感受態(tài)大腸桿菌中(CD-201, 全式金), 之后挑菌測(cè)序。將攜帶正確質(zhì)粒的大腸桿菌擴(kuò)繁, 提取pEASY-103質(zhì)粒, 用NEB公司的酶切體系, 分別對(duì)pEASY-103和LN載體進(jìn)行雙酶切。結(jié)果如圖5a, pEASY-103酶切后有個(gè)1000 bp的片段, 這是目標(biāo)基因OsMYB103, LN載體酶切后為10 kb以上的片段(圖5b), 分別將這兩段切膠回收, 再利用NEB公司的連接酶進(jìn)行反應(yīng), 得到LN-103(LN-OsMYB103),之后導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌, 挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。經(jīng)酶切與測(cè)序檢測(cè), 質(zhì)粒LN-103完全正確(圖5c)。

圖5 載體PCR擴(kuò)增Fig.5 PCR amplification of pEZR MYB指的是含有MYB結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子；LN指的是雙元表達(dá)載體； marker為DL2000的marker;a:從植物cDNA中擴(kuò)增得到的OsMYB103基因, 大小為1 kb左右；b:載體LN的雙酶切膠圖；c:LN-103(LN-OsMYB103)的雙酶切圖, 載體大小完全正確。MYB refers to the transcription factor; LN refers to the binary expression pEZR； marker：DL2000 marker; a：The OsMYB103 gene, which is about 1 kb in size, was amplified from cDNA；b： The double enzyme map of pEZR-LN；c：The double enzyme map of LN-103 and the pEZR size is correct.

2.3亞細(xì)胞定位分析

將制備好的柳枝稷原生質(zhì)體分別和LN-103(LN-OsMYB103), LN空載體共培養(yǎng)12 h, 在共聚焦顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)。如圖6所示, 在激發(fā)光為488 nm條件下LN-103和LN空載體都檢測(cè)到了綠色熒光；在激發(fā)光為580 nm下, 原生質(zhì)體檢測(cè)到了紅色熒光。攜帶OsMYB103基因的質(zhì)粒始終定位于細(xì)胞核上, 這與Yang等[27]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。同時(shí)空載體LN的熒光蛋白在細(xì)胞、細(xì)胞核及細(xì)胞膜上。上述結(jié)果表明,LN載體適用于柳枝稷的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn), 并且可用于轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)基因的分析。

圖6 攜帶OsMYB103基因的LN-103載體和LN空載體的亞細(xì)胞定位圖(10 μm)Fig.6 Subcellular localization of pEZRLN-103 and empty pEZR-LN carrying OsMYB103 gene (10 μm)

3 討論

植物原生質(zhì)體是研究基因功能的強(qiáng)有力工具, 在植物功能基因研究中扮演非常重要的角色[28]。20世紀(jì)中期原生質(zhì)體的分離得到了初步的研究, 目前已經(jīng)有很多的物種進(jìn)行了原生質(zhì)體體系的建立, 然而在柳枝稷中卻鮮有報(bào)道[23-25]。雖然水稻和柳枝稷是近緣物種, 都隸屬于禾本科植物, 但種間差異會(huì)影響基因的功能研究, 因此建立一個(gè)柳枝稷原生質(zhì)體的亞細(xì)胞定位體系是很重要的。

植物的各個(gè)器官如根、莖、葉、種子及愈傷組織等都能分離出原生質(zhì)體[29]。愈傷組織容易獲得大量原生質(zhì)體, 但需要長(zhǎng)時(shí)間的材料準(zhǔn)備, 且不利于葉綠體相關(guān)的基因研究。借鑒中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所朱立煌課題組的水稻原生質(zhì)體分離辦法發(fā)現(xiàn), 分離禾本科植物的黃化幼苗(包括莖, 葉)能滿足各類基因功能的研究工作。因此, 本課題組決定用兩周齡柳枝稷黃化幼苗的莖和葉作為實(shí)驗(yàn)材料。

由于原生質(zhì)體是去壁的細(xì)胞, 對(duì)外面環(huán)境的刺激非常敏感, 分離有效原生質(zhì)體會(huì)被很多因素影響, 獲得高質(zhì)量的原生質(zhì)體, 需要優(yōu)化滲透壓、 酶解時(shí)間等幾個(gè)關(guān)鍵因素[30]。最直接重要的就是外界環(huán)境的滲透壓, 只有維持在一定滲透壓內(nèi)才能保證原生質(zhì)體的產(chǎn)量及活力。在本實(shí)驗(yàn)中, 發(fā)現(xiàn)甘露醇在0.6 mol/L能使外界環(huán)境的滲透壓達(dá)到最佳狀態(tài), 濃度過(guò)大或過(guò)小都會(huì)影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量及質(zhì)量, 低于0.6 mol/L原生質(zhì)體會(huì)因部分失水變癟, 過(guò)高導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)分吸水而破裂, 直接影響原生質(zhì)體產(chǎn)量。

原生質(zhì)體提取是植物細(xì)胞去壁的過(guò)程, 因此細(xì)胞壁的酶解時(shí)間和細(xì)胞的幼嫩程度都會(huì)極大影響原生質(zhì)體的提取。酶解時(shí)間過(guò)短, 細(xì)胞壁水解的不充分, 原生質(zhì)體難以分離；而酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng), 會(huì)影響原生質(zhì)體的存活, 使得無(wú)法得到有效的原生質(zhì)體[31]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明, 酶解8 h是最佳的時(shí)間, 產(chǎn)量能達(dá)到9×105個(gè)/g, 并且酶解時(shí)間在7～8 h間都能獲得大量原生質(zhì)體以滿足實(shí)驗(yàn)需求。植物細(xì)胞的幼嫩程度則決定了細(xì)胞壁是否易于分解, 苗齡在兩周大的黃化苗能獲得最多的原生質(zhì)體。小于兩周, 細(xì)胞壁過(guò)嫩較易水解；大于兩周, 細(xì)胞壁過(guò)老而不利于水解。

在確立了柳枝稷原生質(zhì)體分離體系之后, 本課題組用已報(bào)道過(guò)的基因進(jìn)行了驗(yàn)證, 該基因是MYB家族的基因, 定位于細(xì)胞核上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 分離出的原生質(zhì)體適用于基因的亞細(xì)胞定位。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示, 2周左右的苗子能得到最多數(shù)量原生質(zhì)體, 原生質(zhì)體提取量均超過(guò)8.43×105個(gè)/g, 并適用于亞細(xì)胞定位的實(shí)驗(yàn)觀察；其他條件相同, 在甘露醇濃度為0.6 mol/L時(shí)原生質(zhì)體提取量達(dá)到了最大值, 原生質(zhì)體提取量均超過(guò)7.98×105個(gè)/g；其他條件相同, 酶解8 h獲得的原生質(zhì)體數(shù)最多, 原生質(zhì)體提取量均超過(guò)8.61×105個(gè)/g；經(jīng)酶切與測(cè)序檢測(cè), 質(zhì)粒LN-103完全正確；將制備好的柳枝稷原生質(zhì)體和LN-103載體共培養(yǎng)12 h, 在共聚焦顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：LN載體適用于柳枝稷的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn), 并且可用于轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)基因的分析, 通過(guò)本研究可為柳枝稷遺傳改良及功能基因研究奠定一定的基礎(chǔ)。

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Establishmentofagenetransientexpressionsystemmediatedbypolyethyleneglycolinswitchgrass(Panicumvirgatum)mesophyllprotoplasts

QI Ze-Wen1, SUN Xin-Bo2, FAN Bo3, ZHANG Xue1, YUAN Jian-Bo1, HAN Lie-Bao1*

1.TurfgrassResearchInstitute,BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China; 2.KeyLaboratoryofCropGrowthRegulationofHebeiProvince,HebeiAgriculturalUniversity,Baoding071001,China; 3.ShenzhenHorticulturalGardenConstructionCompany,Shenzhen518038,China

Leaves of Alamo switchgrass (Panicumvirgatum) were used as materials to establish a transient expression system for mesophyll protoplasts cells. To determine the optimal conditions to obtain protoplasts from switchgrass, we designed a gradient experiment, with three replicates per treatment. First, we determined the optimal age of plants as the source of material. The leaves of etiolated seedlings grown for 1, 2, 3, and 4 weeks were subjected to enzymolysis for 8 h in a solution containing D-mannitol at 0.6 mol/L. Next, we determined the optimal osmotic pressure by exposing leaf material from 2-week-old etiolated seedlings to solutions containing D-mannitol at 0.4 mol/L, 0.5 mol/L, 0.6 mol/L, 0.7 mol/L and 0.8 mol/L. The optimal duration of enzymolysis was determined by subjecting leaf material from 2-week-old etiolated seedlings to enzymolysis for 6, 7, 8, 9, and 10 h in a solution containing 0.6 mol/L D-mannitol. This series of assays showed that the optimal conditions to isolate protoplasts were as follows: 2-week-old etiolated seedlings as the source material, and enzymatic hydrolysis in a solution containing 0.6 mol/L D-mannitol in the dark for 8 h at 28 ℃. The protoplasts obtained using this method were transformed with the plasmid LN-OsMYB103 by a polyethylene glycol-mediated method, and strong green fluorescence was detected by laser confocal microscopy. These results indicated that the protoplasts retained normal biological functions. In summary, we established an integrated transient expression system for protoplasts obtained from switchgrass leaves. This method will be very useful for functional genomics research on switchgrass.

switchgrass (Panicumvirgatum); PEG; protoplast; transient expression

10.11686/cyxb2017029

http://cyxb.lzu.edu.cn

祁澤文, 孫鑫博, 樊波, 張雪, 袁建波, 韓烈保. PEG介導(dǎo)的柳枝稷葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系的建立. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(9): 113-120.

2017-01-18；改回日期：2017-03-29

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JSGG20160229155434792和JCYJ20160331151245672)資助。

祁澤文(1992-)，男，江蘇連云港人，碩士。E-mail: qizewen0404@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail: hanliebao@163.com

QI Ze-Wen, SUN Xin-Bo, FAN Bo, ZHANG Xue, YUAN Jian-Bo, HAN Lie-Bao. Establishment of a gene transient expression system mediated by polyethylene glycol in switchgrass (Panicumvirgatum) mesophyll protoplasts. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(9): 113-120.