李小冬，吳佳海，孫方，陳光吉，王小利

(貴州省農業(yè)科學院草業(yè)研究所,貴州 貴陽 550006)

過量表達Fa14-3-3C促進擬南芥對低氮脅迫耐受性的研究

李小冬，吳佳海，孫方，陳光吉，王小利*

(貴州省農業(yè)科學院草業(yè)研究所,貴州 貴陽 550006)

氮元素是植物生長發(fā)育過程必不可少的營養(yǎng)元素之一，對禾本科作物生長的影響更加明顯。本研究采用RACE技術從高羊茅葉片中克隆獲得Fa14-3-3C基因全長，并對其亞細胞定位與分子功能進行系統(tǒng)研究。在煙草表皮細胞中觀察發(fā)現Fa14-3-3C-GFP主要定位在細胞質中與細胞膜上。將Fa14-3-3C基因在擬南芥中過量表達獲得3個單拷貝轉基因株系(抗性分離比為3∶1)。在低氮脅迫反應中，Fa14-3-3C過量表達株系OE-1與OE-3的根鮮重顯著比野生型高，而OE-2與野生型差異不顯著，通過熒光定量PCR分析發(fā)現OE-1與OE-3過量表達明顯而OE-2沒有過量表達，說明Fa14-3-3C對植物耐低氮脅迫調節(jié)具有劑量效應。定量觀察植物根系生長發(fā)現在低氮處理早期OE-1轉基因株系就顯著優(yōu)于野生型，主要是通過補償根系生長的方式緩解低氮脅迫對植物的傷害。因此本研究不僅獲得了耐低氮脅迫候選基因，而且驗證了其在模式植物中的分子功能，為進一步通過基因工程等手段培育耐低氮脅迫種質資源奠定基礎，具有重要理論研究價值與生產應用前景。

高羊茅；Fa14-3-3C；低氮脅迫；轉基因

氮元素是影響植物生長發(fā)育的主要營養(yǎng)元素之一，其參與植物有機體的結構組成，也參與植物生理代謝反應。因此，合理施用氮肥對提高作物產量起到極大的促進作用，但近年來農業(yè)生產中氮肥的過量施用導致地下水硝酸鹽含量超標、地表水富營養(yǎng)化等環(huán)境問題。我國是氮肥消費大國，并且氮肥使用量仍呈遞增的趨勢，然而作物對人工施加氮肥的利用率不到50%[1-2]，因此培育耐低氮肥脅迫的作物新品種對高效生產以及保護環(huán)境都有極其重要的意義。高羊茅(Festucaarundinacea)是主要的冷季型牧草和草坪草，在水土保持、環(huán)境保護、城市綠化和運動場建植上發(fā)揮著重要的作用[3]。但作為一種禾本科牧草，在其栽培和種子生產過程中對氮肥的依賴性很強，因此，培育經濟環(huán)保的耐低氮高羊茅新品種，對有效降低草地栽培管理成本，減少環(huán)境污染，促進草地農業(yè)生產可持續(xù)發(fā)展有重要促進作用[4-5]。

由于氮元素對植物生長以及農業(yè)生產等至關重要，前人從氮元素的吸收、轉運、同化、轉移、再生以及碳氮平衡等方面進行了系統(tǒng)的研究，并已進行了很好的綜述[6]。這些研究發(fā)現并闡述了多個家族基因的功能，其中包括響應NO3-的NRT[7]、NAXT[8]、NAR[7, 9]等家族基因，響應NH4+的AMT家族基因[10]，以及響應有機氮的ProT[11]、LHT[12]、AAP[13]等家族基因，并且這些基因在多個物種中的功能保守。除直接參與氮元素代謝的基因外，許多基因間接受氮元素含量的調節(jié)，14-3-3家族基因是其中之一。

14-3-3蛋白在真核生物中保守性較高，常通過單體或二聚體形式與靶蛋白結合行使調節(jié)功能，在植物中亦被稱為GF家族蛋白[14-15]。因為具有結合多種蛋白的功能，14-3-3家族基因不僅參與干旱[16]、高鹽[17]等多種植物逆境調節(jié)，而且受鐵元素[18]、磷元素與鉀元素[19]等多種營養(yǎng)元素含量水平的調控。氮元素的吸收與同化也顯著受14-3-3家族基因的調節(jié)，前人研究發(fā)現14-3-3蛋白能夠通過與NIR結合調節(jié)氮同化過程的關鍵酶NR的活性[20]，最近的研究發(fā)現14-3-3蛋白作為一種重要的信號轉導調節(jié)因子通過磷酸化靶標蛋白參與碳水化合物代謝以及氮元素的同化與利用[21]。盡管14-3-3家族基因功能重要，且在多個作物中被廣泛研究，然而在牧草類作物中關于14-3-3家族基因的研究還比較少，其在牧草中的同源基因是否能夠調控植物抵抗相應的逆境脅迫還不清楚，基于此，本研究克隆了Fa14-3-3C的全長，并將其在擬南芥中過量表達，系統(tǒng)分析了Fa14-3-3C在耐低氮脅迫中的功能，為下一步采用分子育種手段培育耐低氮脅迫牧草種質資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

本研究采用的植物材料為黔草1號高羊茅(由貴州省草業(yè)研究所選育而成)，以及哥倫比亞野生型擬南芥(ArabidopsisthalianaColumbia)，由華中農業(yè)大學周永明教授團隊饋贈，擬南芥以及高羊茅種植參考Li等[22]的方法，在人工氣候室中設定生長溫度為22 ℃，相對濕度為60%，光周期為16 h光照/8 h黑暗，光照強度為51750～67500 μmol/(m2·s)。Fa14-3-3C基因克隆于2014-2015年在貴州省草業(yè)研究所完成，亞細胞定位與耐低氮脅迫分析于2015-2016年在貴州省草業(yè)研究所完成。

1.2方法

1.2.1RNA的提取及反轉錄 稱取100 mg新鮮黔草1號高羊茅葉片，用液氮研磨成粉末，RNA的提取采用TRIZOLTMKit RNA提取試劑(Invitrogen，USA)。 cDNA 第一鏈的反轉錄采用RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)，操作參照所用試劑盒說明進行。

1.2.2Fa14-3-3C的克隆及過量表達載體的構建 利用前期轉錄組數據設計引物，進行5′RACE(rapid amplification of cDNA ends)以及3′RACE擴增，設計的引物如下，5′RACE：FaGF14-C-REV1，5′-GTTCTTGTAGGCGACG-3′；FaGF14-C-REV2，5′-CTCCTCGACGGTGAGCTC-3′；FaGF14-C-REV-3，5′-CGACCATCTCCTCGTACC-3′。3′RACE：FaGF14-C-FWD1，5′-GCAGAGCAGGCTGAGAGTTATGAAGAGA-3′；FaGF14-C-FWD2，5′-TTCATGGAGAAGGTGGCAAAGACAGTT-3′，具體操作過程參照RACE試劑盒說明書(Clontech SMART RACE kit，USA)，獲得高羊茅Fa14-3-3C全長mRNA的5′端與3′端的序列。

根據RACE結果，設計克隆Fa14-3-3C的全長CDS的引物，FaGF14-C-FWD4，5′-CGGGATCCATGTCGGCACCAGCGGAGCTTTC-3′；FaGF14-C-REV4，5′-GCTCTAGACTCGGCGGCTCCCTTTCG-3′。反應體系如下：10×buffer，2 μL；dNTP mix，0.5 μL；MgCl2，1.5 μL； FaGF14-C-FWD4，1 μL；FaGF14-C-REV4，1 μL；cDNA模板，2 μL；DNA Polymerase,0.2 μL；dd H2O，12 μL。程序如下，95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，72 ℃ 5 min，25 ℃ 5 min。并將其連接到pEASY-Blunt克隆載體(pEASY-Blunt Cloning Kit，Transgene)，進行測序分析，利用BamHⅠ與XbaⅠ將正確的序列與p1300-GFP載體酶切后，用T4連接酶連接成p1300-Fa14-3-3C-GFP過量表達載體(Fermentas)，具體操作參照試劑盒說明書。

1.2.3Fa14-3-3C-GFP亞細胞定位 采用電轉法將p1300-Fa14-3-3C-GFP載體轉化到GV3101感受態(tài)細胞，利用硫酸慶大霉素和卡那霉素進行抗性篩選，利用35S和FaGF14-C-REV4進行PCR 鑒定，反應體系與程序同Fa14-3-3C克隆，獲得轉化p1300-Fa14-3-3C-GFP陽性農桿菌克隆。將陽性菌落接種到5 mL Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)+25 mg/L 慶大霉素+50 mg/L卡那霉素的液體培養(yǎng)基中28 ℃, 220 r/min活化24 h。按照1∶50的比例將活化的菌液接種到200 mL LB+25 mg/L慶大霉素+50 mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基28 ℃, 220 r/min培養(yǎng)8～12 h。室溫5000 r/min離心15 min。棄上清，將農桿菌沉淀懸浮于新鮮配制的稀釋緩沖液[10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MES (2-4-morpholino ethanesulfonic acid)，pH=5.7，0.5% 葡萄糖，200 mmol/L 乙酰丁香酮]。將活化好的農桿菌用1 mL的一次性注射器打入煙草(Nicotianatabacum)葉片下表皮細胞，暗光培養(yǎng)3～5 d，撕煙草下表皮在紫外激發(fā)光下觀察508 nm的熒光信號(微分干涉熒光顯微鏡，Nikon，日本)。

1.2.4p1300-Fa14-3-3C-GFP轉化擬南芥 農桿菌的活化及培養(yǎng)同1.2.3，將收集的農桿菌菌體懸浮于新鮮配制的誘導培養(yǎng)基中(10 g 蔗糖充分溶解于200 mL蒸餾水中)，在轉化之前加入20 μL Silwet(上海生工)。將去除花和角果的野生型植株浸泡在農桿菌懸浮液30 s。避光培養(yǎng)過夜，然后正常培養(yǎng)至種子成熟，收獲的種子為T0轉基因擬南芥。

1.2.5轉基因擬南芥的篩選及分子鑒定 將T0代轉基因的擬南芥種子分裝成200 mg每管，用75%乙醇表面消毒1 min，用50% 84消毒液消毒3 min， 用無菌水清洗種子3～4次，均勻懸浮于0.1%的瓊脂糖，然后鋪布于1/2 Murashige & Skoog (MS)培養(yǎng)基+300 mg/L特美汀+50 mg/L潮霉素培養(yǎng)基，4 ℃放置3 d轉移到人工氣候室中篩選15～30 d，挑選綠色健壯的植株移栽到營養(yǎng)土中備用?？剐苑蛛x比的篩選挑選T1代種子，每份準備30～60顆種子，消毒與篩選參考T0代方法，15～30 d后統(tǒng)計陽性與非陽性比例。挑選接近3∶1分離的株系進行分子篩選(OE-1，OE-2，OE-3)，采用天根植物DNA提取試劑盒(DP305)提取轉基因與野生型擬南芥的新鮮葉片組織的DNA，程序方法參照試劑盒說明書。利用HptF+HptR以及35S+FaGF14-C-REV4兩個引物組合進行PCR 鑒定，PCR反應采用上海生工 2×Taq PCR反應試劑盒，反應體系如下：2×Taq PCR Mixture，10 μL；正向引物，1 μL；反向引物，1 μL；DNA，2 μL；dd H2O，6 μL?；靹蚝筮M行PCR擴增反應，程序如下：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)，72 ℃ 5 min，25 ℃ 5 min。取8 μL PCR產物電泳檢測，挑選陽性植株用于表型考察與表達分析。

1.2.6熒光定量分析 RNA提取及反轉錄參照1.2.1，采用GoTaq Real-Time PCR Systems (Promega,A6001)檢測轉基因植物和野生型中14-3-3C的表達，引物組合為：Fa14-3-3C-FWD5，5′-TTGCCTACCCTGGATAAGATCTAAG-3′與Fa14-3-3C-REV5，5′-TAATAAACCCAGTCGTATCGCTTAG-3′,內參基因為Ubiquitin，引物組合為UBI-FWD1，5′-CACCTCGATCACCCACCTCT-3′，UBI-REV1，5′-AGGGTCTCCGATAACCTCCA-3′，操作方法按照試劑盒說明書，反應程序為94 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，讀取熒光信號，45個循環(huán)，72 ℃ 5 min，25 ℃ 5 min。采用2-ΔΔct方法[22]分析14-3-3C的表達變化，每個樣品3個生物學重復，每個生物學重復3個技術重復。

1.2.7轉基因擬南芥耐低氮脅迫分析 將野生型以及轉Fa14-3-3C基因的擬南芥表面消毒后播種于Hoagland固體培養(yǎng)基中[1.25 mmol/L KNO3，1.25 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O，0.5 mmol/L MgSO4·7H2O，0.25 mmol/L KH2(PO4)，11.6 μmol/L H3BO3，4.6 μmol/L MnCl2·4H2O，0.19 μmol/L ZnSO4·7H2O，0.12 μmol/L Na2MoO4·2H2O，0.08 μmol/L CuSO4·5H2O 和10 μmol/L Fe(III)-EDTA，10 g/L瓊脂，用HCl調整pH值到6.0]，正常條件預培養(yǎng)4 d，挑選整齊一致的幼苗分別移栽到Hoagland全營養(yǎng)培養(yǎng)基與Hoagland缺氮培養(yǎng)基[1.25 mmol/L KCl，1.25 mmol/L CaCl2，0.5 mmol/L MgSO4·7H2O，0.25 mmol/L KH2(PO4)，11.6 μmol/L H3BO3，4.6 μmol/L MnCl2·4H2O，0.19 μmol/L ZnSO4·7H2O，0.12 μmol/L Na2MoO4·2H2O，0.08 μmol/L CuSO4·5H2O 和 10 μmol/L Fe(III)-EDTA，10 g/L瓊脂，用HCl調整pH值到6.0]中生長15 d，6株為一組分別取對應植物的根樣稱量鮮重，每個材料4個生物學重復。根長動態(tài)觀察：野生型與Fa14-3-3COE-1材料表面消毒、預培養(yǎng)及處理與生物產量測定相同，每天對處理以及對照的植物拍照，利用Image J軟件統(tǒng)計每個植株根系生長，每個材料統(tǒng)計30個單株。

1.3數據分析

采用Excel 2010進行實驗數據分析，熒光定量、根鮮重以及根長動態(tài)觀察采用t測驗分析差異顯著性，P<0.05被認為是差異顯著，采用Excel 2010與PowerPoint 2010作圖。

2 結果與分析

2.1Fa14-3-3C的克隆及過量表達載體構建

因為高羊茅為六倍體禾本科牧草，其基因組信息較少，本研究采用RACE (rapid amplification of cDNA end)技術以高羊茅葉片cDNA為模板，獲得Fa14-3-3C5′端(圖1A)與3′端(圖1B)序列，根據RACE結果擴增Fa14-3-3C整個編碼區(qū)序列(圖1C)，Fa14-3-3C整個編碼區(qū)長783 bp，編碼一個261氨基酸的小分子蛋白。利用設計的BamHⅠ與XbaⅠ酶切pGEM-Fa14-3-3C與p1300-GFP空載體，回收并連接線性化載體和Fa14-3-3C基因，獲得過量表達載體(圖1D)。

2.2Fa14-3-3C亞細胞定位

14-3-3家族基因在信號轉導、細胞凋亡、營養(yǎng)物質感應等過程中起十分重要的作用。前人研究發(fā)現14-3-3 作為蛋白結合配體能夠與多種蛋白結合，通過目標蛋白質結合改變其在細胞內定位，例如14-3-3 蛋白能夠促進許多核定位的信號蛋白定位到細胞質中，包括促凋亡蛋白BAD以及細胞周期調控磷酸酶Cdc25C等[23]。然而Fa14-3-3C在植物細胞中的定位還沒有被研究，本研究將Fa14-3-3C與綠色熒光蛋白GFP融合表達，觀察其在煙草表皮細胞中的定位，發(fā)現Fa14-3-3C主要定位于細胞質與細胞膜上(圖2A，B)。而對照35S:eGFP在細胞內均有很強的熒光信號(圖2C,D)。

圖1 Fa14-3-3C的克隆與過量表達載體構建Fig.1 Cloning of Fa14-3-3C and constructing of p1300-Fa14-3-3C-GFP over-expression vector A～C: Fa14-3-3C 5′端(A)、3′端(B)以及全長編碼區(qū)(C)的克隆Electrophoresis of PCR products from 5′ RACE (A), 3′ RACE (B) and full coding sequence amplification (C) of Fa14-3-3C. D：p1300-Fa14-3-3C-GFP過量表達載體示意圖 Diagrammatic drawing of p1300-Fa14-3-3C-GFP overexpression vector.

圖2 Fa14-3-3C亞細胞定位Fig.2 Subcellular localization of Fa14-3-3C protein 在紫外激發(fā)光(A，C)以及白光(B，D)條件下，轉p1300-Fa14-3-3C-GFP表達載體(A～B)與p1300-GFP空載體對照(C～D)在煙草表皮細胞的熒光信號定位以及細胞形態(tài)。Fluorescence signal distribution and cellular morphology of tobacco adaxial epidermis cells transiently expressed p1300-Fa14-3-3C-GFP (A-B) and p1300-GFP mocked control (C-D), pictures were taken under ultraviolet light field (A, C) and bright light field (B, D).

2.3Fa14-3-3C轉基因擬南芥獲得與驗證

在前期研究結果中，發(fā)現Fa14-3-3C能顯著被低氮脅迫誘導，為進一步研究Fa14-3-3C的功能，本研究利用農桿菌介導的花器官侵染法將p1300-Fa14-3-3C-GFP轉化野生型擬南芥。以25 mg/L潮霉素進行抗性篩選，共獲得12株陽性轉基因植株，對各株系T2代植株抗性統(tǒng)計分析獲得3個分離比接近3∶1的株系，為可能的單拷貝插入轉基因植株，隨機挑選6個抗性單株分別用潮霉素抗性引物以及35S啟動子與基因下游引物進行組合擴增，結果顯示抗性植株都為陽性(圖3A，B)。

2.4Fa14-3-3C轉基因植株在低氮脅迫條件下的生物產量及表達分析

氮元素的吸收主要是通過植物根系起作用，本研究重點分析了3個抗性分離比接近3∶1的株系(OE-1，OE-2，OE-3)在低氮脅迫條件下根系鮮重的變化。在正常條件下，野生型與Fa14-3-3C過量表達植株的根鮮重沒有顯著區(qū)別(圖4A)，而在低氮脅迫條件下，Fa14-3-3COE-1與OE-3的根鮮重顯著比野生型高(圖4B)，OE-2與野生型差異不顯著。OE-2與OE-1及OE-3的表型不一致，猜測這種現象可能與Fa14-3-3C在植物中的表達量有關。因此，分析在正常條件下，3個過表達株系與野生型擬南芥中Fa14-3-3C的表達變化，Fa14-3-3C在OE-1與OE-3株系中均顯著上調，而OE-2中Fa14-3-3C的表達與野生型差異不顯著。

為進一步分析低氮脅迫條件下，Fa14-3-3C對植物根系的影響，本研究平行觀察了OE-1與野生型擬南芥根系的變化。在正常情況下，OE-1與野生型沒有顯著區(qū)別(圖5A)，其根長從開始處理到結束都與野生植株差異不顯著(圖5B)。在低氮脅迫條件下，OE-1的根長顯著比野生型擬南芥長(圖5C)，在動態(tài)觀察中，本研究發(fā)現從處理的第2天開始，OE-1的根系顯著比野生型長，并且一直維持到處理結束(圖5D)。因此14-3-3C能夠顯著提高植物對低氮脅迫的耐受性。

圖3 Fa14-3-3C轉擬南芥植株分子鑒定Fig.3 Molecular detection of Fa14-3-3C transgenic plants in Arabidopsis A～B：轉基因擬南芥分子檢測示意圖，分別用潮霉素抗性引物(A，Hpt基因)與基因特異引物(B，35S+14-3-3C rev)檢測6株陽性轉基因植株Molecular detections of hygromycim resistant plants with primers for hygromycim resistant gene (A, Hpt) and specific gene (B, 35S+14-3-3C rev), 6 individual plants were detected.

圖4 Fa14-3-3C轉基因擬南芥生物產量以及基因表達分析Fig.4 Bio-production and gene expression analysis in three Fa14-3-3C over expression strains and wild type plants A：在正常條件下以及低氮脅迫條件下，3個過表達株系(OE-1、OE-2與OE-3)與野生型根系生物產量分析Under normal and low nitrogen conditions, fresh weight of three different over expression (OE) strains and wild type plants; B：在正常條件下，過表達株系與野生型中14-3-3C基因的表達分析Gene expression analysis of three OE strains and wild type plants under normal growth condition；10株幼苗(包括根)混為1個樣品，每個樣品3個生物學重復，用Ubiquitin基因做內參, *表示差異在P<0.05達顯著水平。 Ten seedlings were grouped as a sample (root included); Each sample had three biological repeats, Ubiquitin were used as an internal reference, *stands for a significant difference at P<0.05 level. Col表示野生擬南芥，OE-1～OE-3表示3個Fa14-3-3C過量表達擬南芥株系Col stands for wild type seedlings, while OEs stands for different Fa14-3-3C over expression strains.

圖5 Fa14-3-3C OE-1在低氮脅迫條件下的表型考察Fig.5 Morphological observation of Fa14-3-3C OE-1 under low nitrogen stress 在正常條件下(A)與低氮脅迫條件下(C)OE-1與野生型擬南芥植株。在正常條件下(B)與低氮脅迫條件下(D)OE-1與野生型擬南芥根系動態(tài)測量。*表示差異在P<0.05達顯著水平。 Seedlings of wild type and Fa14-3-3C OE-1 under normal (A) and low nitrogen stress (C) conditions. Dynamic analysis of root length in wild type and Fa14-3-3C OE-1 plants under normal (B) and low nitrogen (D) conditions. *stands for a significant difference at P<0.05 level.Col表示野生擬南芥，OE-1表示Fa14-3-3C OE-1過量表達擬南芥株系，植株先在1/2 MS培養(yǎng)基上育苗3 d，再轉移到低氮脅迫培養(yǎng)基上脅迫8 d。Col stands for wild type seedlings, while OE-1 stands for Fa14-3-3C over expression strains-1. Seedlings were pre-cultured in 1/2 MS for 3 d, then transferred into low nitrogen stress medium for 8 d.

3 討論

在植物基因組中，一個生物學過程需要多個功能蛋白協(xié)同才能完成，同時某些蛋白與其他不同的蛋白互作表現不同的功能。14-3-3蛋白作為廣譜的代謝物質感應分子以及信號調節(jié)因子，主要是由其能與多個不同蛋白結合的特性決定，例如參與氮代謝的NR基因[24]、參與糖代謝的SPS基因[25]。在前期研究中發(fā)現4個Fa14-3-3家族基因能夠不同程度的受高溫、干旱、高鹽以及低氮脅迫誘導[26]，而且過量表達Fa14-3-3C能夠顯著增強植物對低氮脅迫的抵抗力，其同源基因在其他植物的抗旱、耐鹽以及耐低磷低鉀等抗逆性中也均有報道[16-17,19]，說明Fa14-3-3家族基因可能與其同源基因類似，具有多效性，通過多個途徑調節(jié)植物對不同脅迫反應的應答。

14-3-3蛋白屬于小分子蛋白(25～32 Kd)，在真核生物中廣泛存在，序列保守性較高[27]，在細胞中常常以同聚化或者寡聚化的形式與靶標蛋白結合，引導其在細胞結構中的定位[28]。在本研究中，Fa14-3-3C-GFP的熒光信號主要分布在細胞質中以及細胞膜上，符合其作為信號轉導分子與多功能的小分子配體的特點，并且以往研究發(fā)現14-3-3蛋白作為到校因子行使功能的機理之一是與靶標蛋白結合并改變其亞細胞定位，如促凋亡蛋白BAD與細胞周期調控磷酸酶Cdc25C等[23]。

植物基因表達受轉錄因子調控，如果轉錄因子表達發(fā)生變化會由于級聯放大效應導致下游基因的表達發(fā)生劇烈變化[29]。而對于直接行使功能的酶或配體作為直接的效應分子，往往具有較明顯的劑量效應。在本研究挑選的3個轉基因陽性株系中，OE-1與OE-3根鮮重顯著高于野生型，而OE-2與野生型差異不顯著，這個表型與對應株系中Fa14-3-3C的表達量相吻合(圖4)，說明Fa14-3-3C調節(jié)植物耐低氮脅迫反應的劑量效應比較明顯。而OE-2可能由于轉化過程中轉入片段不完全或者T-DNA插入的位置效應使Fa14-3-3C不能過量表達導致與野生型耐低氮脅迫差異不明顯。

14-3-3家族基因能與碳、氮代謝的關鍵基因相互作用，說明其協(xié)調與利用代謝物的機制可能具有普遍性[27]，因為碳、氮作為植物生長發(fā)育最重要元素之一，其含量失衡會導致植物生理與發(fā)育改變[30]。例如，氮元素不僅能夠影響植物根系的形成，而且對植物光合作用的效率有重要影響[31]。前人研究發(fā)現在土豆(Solanumtuberosum)中過量表達14-3-3基因能顯著降低蔗糖、兒茶酚胺以及油脂的含量，反義表達14-3-3基因能影響土豆塊莖淀粉的含量與氨基酸的組成[32-33]。在本研究中只分析過量Fa14-3-3C在低氮脅迫條件下對植物根系形態(tài)的影響，其是否能調節(jié)植物對其他逆境的抵抗性，是否影響植物品質性狀及其是否具有與其同源基因相同的分子作用機理還有待于進一步研究。

4 結論

高羊茅Fa14-3-3C蛋白在細胞中主要定位在細胞質與細胞膜。作為耐低氮脅迫的關鍵調控基因，Fa14-3-3C能正向調節(jié)擬南芥對低氮脅迫耐受性，并且具有顯著的劑量效應。Fa14-3-3C能夠通過促進根系生長提高植物對低氮脅迫的耐受性。

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EnhancedtoleranceofArabidopsisoverexpressingFa14-3-3Cfromtallfescue(Festucaarundinacea)tolow-nitrogenstress

LI Xiao-Dong, WU Jia-Hai, SUN Fang, CHEN Guang-Ji, WANG Xiao-Li*

GuizhouAcademyofAgricultureScience;GuizhouInstituteofPrataculture,Guiyang550006,China

Nitrogen is essential for the growth and development of plants, especially gramineous crop plants. In this study, the full-lengthFa14-3-3Cgene was obtained by rapid amplification of cDNA ends from leaves of tall fescue (Festucaarundinacea). Subcellular localization analyses showed thatFa14-3-3C-GFP was mainly located in the cytoplasm and cell membrane when it was transiently expressed in tobacco epidermal cells.Fa14-3-3Cwas transferred intoArabidopsis, and three single-copy T-DNA insertion strains showing a 3∶1 hygromycin resistance segregation ratio were obtained. When wild-type andFa14-3-3Coverexpression strains were subjected to nitrogen deficiency, the root fresh weight was higher in strains OE-1 and OE-3 (but not OE-2) than in wild type. Quantitative real-time PCR analyses showed thatFa14-3-3Cwas highly expressed in OE-1 and OE-3, but not in OE-2, reflecting a dosage effect on the response to nitrogen deficiency. Dynamic analyses of the root growth of wild-type andFa14-3-3Coverexpression strains in nitrogen-deficient medium revealed that OE-1 showed a dramatic advantage over wild-type plants at the early stage of nitrogen deficiency. This was mainly due to compensation growth to alleviate the negative effects of low-nitrogen stress in the OE-1 strain. Therefore, we have cloned a candidate gene conferring resistance to low-nitrogen stress, and verified its molecular function in the model plantArabidopsis. These results are fundamentally important for breeding crop plants resistant to low-nitrogen stress via genetic engineering.

tall fescue;Fa14-3-3C; low nitrogen stress; transgenic

10.11686/cyxb2017058

http://cyxb.lzu.edu.cn

李小冬, 吳佳海, 孫方, 陳光吉, 王小利. 過量表達Fa14-3-3C促進擬南芥對低氮脅迫耐受性的研究. 草業(yè)學報, 2017, 26(9): 104-112.

LI Xiao-Dong, WU Jia-Hai, SUN Fang, CHEN Guang-Ji, WANG Xiao-Li. Enhanced tolerance ofArabidopsisover expressingFa14-3-3Cfrom tall fescue (Festucaarundinacea) to low-nitrogen stress. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(9): 104-112.

2017-02-20；改回日期：2017-03-31

貴州省重大科技專項(黔科合重大專項字[2014]6017)，貴州省農業(yè)科學院專項基金(黔農科院院專項 [2013]03)和貴州省百層次人才培養(yǎng)專項(黔科合人才[2016]4024)資助。

李小冬(1984-)，男，湖南邵陽人，副研究員，博士。 E-mail: lixiaodongzl@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail:wangxiaolizhenyuan@126.com