王強(qiáng)輝 翟健程 夏彥玲 劉偉石 李和平

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

馴鹿EGFR基因克隆及序列分析1)

王強(qiáng)輝 翟健程 夏彥玲 劉偉石 李和平

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

以快速生長(zhǎng)期雄性馴鹿(Rangifertarandus)鹿茸頂端表皮組織為研究材料，提取其頂端表皮組織總RNA，參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中牛、羊的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因序列設(shè)計(jì)同源引物；采用RT-PCR技術(shù)、分子克隆技術(shù)首次成功獲得雄性馴鹿茸頂端表皮組織EGFR基因編碼區(qū)部分cDNA序列，片段大小為910 bp；Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)馴鹿EGFR基因與牛、羊、馬、人、鯨、野豬的同源性分別是97%、96%、88%、86%、92%、89%，同源性均在85%以上，表明馴鹿EGFR基因在進(jìn)化上比較保守；構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)馴鹿EGFR基因與牛親緣關(guān)系最近，與人的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；最后通過(guò)在線分析軟件預(yù)測(cè)獲得EGFR基因序列對(duì)應(yīng)mRNA最小自由能二級(jí)結(jié)構(gòu)。

馴鹿；EGFR基因；RT-PCR；分子克隆；生物信息學(xué)

表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是細(xì)胞表面具有配體介導(dǎo)的受體酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，是重要的ErbB受體蛋白家族成員，又名ErbB-1[1]。EGFR分子具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是與配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)以及羧基端具有受體酪氨酸激酶活性的區(qū)域[2]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ErbB家族成員有EGFR/ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3、ErbB-4[3]，其中對(duì)EGFR研究最為廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR存在6種配體類型，分別是表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、安非調(diào)節(jié)素、Bcta-celluin、肝素結(jié)合樣EGF、表皮調(diào)節(jié)素(EPR)，其中EGF、TGF、Qmhiregulin只能和EGFR結(jié)合，其余的和其他ErbB家族配體共同結(jié)合發(fā)揮作用[4]。大量研究表明，EGFR基因的過(guò)量表達(dá)或者變化與人類腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)有著密切的關(guān)系[5]，其作用機(jī)理是EGFR與配體結(jié)合進(jìn)而激活本身固有的酪氨酸激酶的活性，酪氨酸殘基進(jìn)行自身磷酸化活化EGFR，活化后的EGFR可以通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活下游的生長(zhǎng)因子活性，從而刺激細(xì)胞增殖、分化、抗凋亡等[6]。EGFR基因的表達(dá)直接影響到生命活動(dòng)，它是一個(gè)多效基因，其突變和過(guò)量表達(dá)都會(huì)使得正常生命活動(dòng)的改變，例如已有研究表明在癌癥細(xì)胞中EGFR基因總存在過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象[7]，這就使得EGFR基因研究為癌癥治療提供了新的方向，孫夢(mèng)梅的研究表明，人源性EGFR抗體能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖和擴(kuò)散[8]。鹿茸作為一種能夠完全再生的骨質(zhì)性器官，且快速生長(zhǎng)期細(xì)胞分裂速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)腫瘤細(xì)胞分裂速度(約為癌細(xì)胞分裂速度的30多倍)的正常細(xì)胞[9]，對(duì)其EGFR基因的探索對(duì)于人類疾病治療以及鹿茸生長(zhǎng)研究有著巨大的價(jià)值。

馴鹿(Rangifertarandus)是唯一雌雄都具角的鹿科動(dòng)物，在我國(guó)僅分布在大興安嶺地區(qū)，在敖魯古雅河畔形成了特有的鄂溫克馴鹿文化[10]。馴鹿因其獨(dú)特的生理和文化特征聞名世界，也吸引著廣大學(xué)者的關(guān)注。鹿茸研究一直是鹿科動(dòng)物研究的熱點(diǎn)，尤其鹿茸再生機(jī)理和神奇的細(xì)胞分裂速度一直被認(rèn)為是再生生物學(xué)領(lǐng)域[11]和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[12]重要的生物模型。鹿茸細(xì)胞的快速增殖和生長(zhǎng)因子以及生長(zhǎng)因子受體的作用息息相關(guān)。馮海華等研究表明，IGF-1對(duì)鹿茸中心細(xì)胞增殖有著重要作用，并且不同生長(zhǎng)時(shí)期影響不同[13]。楊曉光在馬鹿鹿茸頂端茸皮和軟骨組織轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)，EGFR基因是茸皮組織中高表達(dá)的生長(zhǎng)因子受體基因之一[14]，但GenBank中沒(méi)有鹿源性EGFR基因的任何記錄，因此筆者參考近緣物種牛、羊等的EGFR基因序列設(shè)計(jì)同源引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)、T-A克隆技術(shù)展開(kāi)對(duì)EGFR基因的探索，首次成功克隆獲得EGFR基因編碼區(qū)的部分cDNA序列，并對(duì)此序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為馴鹿EGFR基因的后續(xù)研究提供可參考的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與保存

選用遼陽(yáng)千山呈龍科技有限公司養(yǎng)鹿場(chǎng)引自根河市敖魯古雅鄉(xiāng)的成年健康雄性馴鹿作為試驗(yàn)對(duì)象，于2016年鹿茸快速生長(zhǎng)期切取雄性馴鹿茸頂端大約5 cm，參考Li et al.[15]對(duì)馬鹿鹿茸頂端組織分層的方法，先將樣品表面迅速消毒，縱向剖開(kāi)，取其頂端表皮組織，采集完后迅速放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2馴鹿茸頂端表皮組織總RNA提取及cDNA的合成

總RNA提取和純化：運(yùn)用Trizol法[16]提取總RNA，根據(jù)Trizol試劑盒說(shuō)明步驟提取總RNA，完成總RNA提取后進(jìn)行純化，再用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，最后使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度和純度。

模板cDNA的合成：根據(jù)M-MLV3逆轉(zhuǎn)錄酶的要求按照20 μL體系合成第一鏈cDNA，其體系組分為，總RNA2.0 μL、RT-buffer 4.0 μL、dNTPs 2.0 μL、RNase inhibitor 1.0 μL、Oligo-dT 1.0 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶 1.0 μL、DEPC處理水9.0 μL，反應(yīng)條件為，42 ℃ 20 min、 99 ℃ 5 min、4 ℃ 5 min，完成后瞬間離心，放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 馴鹿EGFR基因的擴(kuò)增及克隆

引物合成：參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中牛、羊、印度水牛、犀牛等同源物種EGFR基因mRNA序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，由哈爾濱新海生物公司合成。上游引物EGFRF：5′GCACTTTTGAAGACCACT 3′；下游引物EGFRR：5′AACTCACCGATTCCTATT 3′。

EGFR基因擴(kuò)增與回收：以cDNA為模板、EGFRF為上游引物、EGFRR為下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)獲取目的基因。PCR反應(yīng)條件為，94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，36個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物按照凝膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行回收并純化，通過(guò)以上兩步成功獲得目的基因。

EGFR基因克?。喝∩鲜霾襟E中回收產(chǎn)物3.5 μL參照連接體系說(shuō)明書進(jìn)行連接，將目的基因成功連入PMD18-T載體中，然后將連有目的基因的載體與大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞完成轉(zhuǎn)化，將成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在超凈工作臺(tái)用涂布棒均勻涂在事先準(zhǔn)備好的LB固體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～14 h，最后經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選得到帶有目的基因的15個(gè)白色菌落，將菌落挑至加有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床培養(yǎng)6～8 h，進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)。

1.4 馴鹿EGFR基因序列測(cè)定

克隆成功的菌液送往吉林庫(kù)美生物公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)Chromas峰圖查看，DNAstar分析，確認(rèn)測(cè)序結(jié)果可靠性。

1.5 馴鹿EGFR基因生物學(xué)信息分析

測(cè)序結(jié)果運(yùn)用DNAstar中SeqMan進(jìn)行檢測(cè)校準(zhǔn)，對(duì)準(zhǔn)確的目的序列通過(guò)Blast進(jìn)行初步分析，比對(duì)馴鹿EGFR基因與其他物種EGFR基因的同源性，下載同源序列，運(yùn)用Mega5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、DNAman分析對(duì)比物種間差異堿基的個(gè)數(shù)以及位點(diǎn)，運(yùn)用ViennaRNA Web Services對(duì)得到序列所對(duì)應(yīng)的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，綜合分析馴鹿EGFR基因所攜帶的生物信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取與目的片段擴(kuò)增

總RNA在1%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示5.8S、18S、28S條帶清晰無(wú)拖帶，且28S亮度約為18S亮度的二倍(圖1)，提取質(zhì)量濃度為1 760.4 mg·L-1，OD260/OD280為2.0，表明其質(zhì)量濃度以及純度均達(dá)到后續(xù)試驗(yàn)的要求。

M.DL2000 Marker；A.總RNA。

2.2 馴鹿EGFR基因部分cDNA的克隆及陽(yáng)性檢測(cè)

馴鹿EGFR基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1條900 bp左右的特異性條帶(圖2)，將該條帶純化回收克隆，通過(guò)對(duì)15個(gè)克隆菌落的陽(yáng)性檢測(cè)，確認(rèn)克隆成功后(圖3)進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAstar拼接獲得大小為910 bp基因序列，完全與預(yù)期的目的基因大小一致。進(jìn)一步Blast比對(duì)分析，確認(rèn)此序列是馴鹿EGFR基因編碼區(qū)的部分cDNA序列。測(cè)序結(jié)果如下：GCACTTTTGAAGACCACTTTCTGAGCCTCCAGAGGATGTTCAACAACTGTGAGGTGGTCCTTGGGAATTTGGAAATTACCTACATGCAGAGTAGTTACAACCTTTCTTTTCTCAAGACCATCCAGGAGGTTGCTGGCTATGTACTCATTGCCCTCAACACAGTGGAGAAGATTCCGCTGGAAAACCTGCAGATCATCCGAGGAAATGTGCTTTATGAAAACACCCATGCCTTAGCGGTCTTATCCAACTATGGAGCAAACAAAACCGGACTGAGGGAGCTGCCCTTGAGAAACTTACAGGAAATTCTGCAAGGTGCCGTGCGATTCAGCAACAACCCTGTCCTCTGCAACGTGGAGACCATCCAGTGGCGGGACATCGTCAACCCTGACTTTCTAAGCAACATGACAGGGGACTTTCAGAACCAGCTGAGCAACTGCCCGAAGTGTGATCCAGTCTGTCTCAATGGAAGCTGCTGGGGTGCTGGGAAGGAGAACTGCCAGAAATTGACCAAAATCATCTGTGCCCAGCAGTGTTCCGGGCGCTGCCGTGGCAGGTCCCCCAGCGACTGCTGTCACAACCAGTGCGCCGCTGGCTGCACGGGGCCACGGGAGAGTGACTGCCTGGTCTGCCGCAGGTTCCGTGATGAAGCCACTTGCAAGGACACGTGTCCGCCACTCATGCTCTATGACCCTACCACCTACGAGATGAAGGTCAACCCGCTGGGGAAGTACAGCTTTGGTGCCACCTGTGTCAAGAAGTGTCCCCGTAACTATGTGGTGACAGACCACGGCTCATGCGTCCGCGCCTGCAGTTCTGACAGCCAGGAGGTAGAAGAGGATGGTGTCCGCAAGTGTAAAAAGTGTGACGGGCCTTGTGGCAAAGTTTGTAACGGAATAGGAATCGGTGAGTT.

M．DL2000 DNA marker；1-3為馴鹿EGFR基因部分cDNA擴(kuò)增片段。

圖2馴鹿EGFR基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

M．DL2000 DNA Marker；1-15為EGFR基因部分cDNA克隆片段。

2.3 馴鹿EGFR基因序列同源性比較

為進(jìn)一步了解馴鹿與其他哺乳動(dòng)物EGFR基因的同源性，將獲得的馴鹿EGFR基因序列在GenBank中經(jīng)Blast對(duì)比，并下載與其他哺乳動(dòng)物同源區(qū)段，結(jié)合DNAman綜合對(duì)比分析，馴鹿EGFR部分cDNA序列與其他物種序列的綜合對(duì)比見(jiàn)圖4，結(jié)果顯示其與?？苿?dòng)物中印度水牛、野牛、家牛同源性最高，為97%，其次為羊96%、小須鯨92%、野豬89%、馬88%、人86%。這就說(shuō)明馴鹿EGFR基因在進(jìn)化上是相對(duì)保守且和偶蹄目動(dòng)物具有高度相似性。

圖4 馴鹿EGFR基因與其他哺乳動(dòng)物基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 馴鹿EGFR基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

根據(jù)馴鹿EGFR基因部分cDNA序列，經(jīng)Blast對(duì)比后從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載與馴鹿此段序列同源的人、牛、羊、馬、野豬、小須鯨的序列經(jīng)分析整理，運(yùn)用Mega5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)。由圖4可見(jiàn)，馴鹿EGFR基因與牛、羊親緣關(guān)系最近，與人和馬親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，與小須鯨的親緣關(guān)系較近、野豬次之，這一結(jié)論符合經(jīng)典分類學(xué)規(guī)律。

2.5 馴鹿EGFR基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

根據(jù)測(cè)序獲得的馴鹿EGFR基因部分cDNA序列，運(yùn)用在線分析軟件ViennaRNA Web Services對(duì)EGFR基因的cDNA相應(yīng)的mRNA進(jìn)行最小自由能二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 MFE二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討論

鹿茸周期性生長(zhǎng)和神奇的增殖速度使得其一直成為生命研究領(lǐng)域較為熱門的話題，隨著研究的不斷深入(從早期鹿茸表形態(tài)研究到現(xiàn)在分子作用機(jī)理以及基因表達(dá)層面的研究)，使得研究成果不斷向?qū)嵺`轉(zhuǎn)化，為攻克目前生物醫(yī)學(xué)難題奠定基礎(chǔ)。EGFR基因作為生命活動(dòng)的重要受體基因之一，對(duì)于生命活動(dòng)的正常運(yùn)行起著至關(guān)重要的作用。馴鹿作為唯一雌雄都長(zhǎng)角的鹿科動(dòng)物，對(duì)于某些功能基因在雌雄之間的探索區(qū)別其他單一性別長(zhǎng)角的鹿科動(dòng)物，這就使得本研究具有特殊的生物學(xué)意義。

在本研究中成功克隆獲得馴鹿EGFR基因的部分cDNA序列，其片段大小為910 bp，通過(guò)Blast、DNAman、DNAstar、MEGA5.0分析得到EGFR基因在物種進(jìn)化中比較保守，與其他動(dòng)物如牛、羊、豬、馬等的同源性均在85%以上，是重要的功能基因。2015年楊曉光在馬鹿鹿茸頂端茸皮和軟骨組織轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)，EGFR基因在茸皮組織中表達(dá)，且表達(dá)量相對(duì)較高；通過(guò)KEGG信號(hào)通路分析，EGFR基因與鹿茸生長(zhǎng)有著重要的聯(lián)系[14]。本研究運(yùn)用DNAman的多序列對(duì)比功能將獲得的馴鹿EGFR基因的部分序列與牛、羊、馬、鯨、豬、人對(duì)比，發(fā)現(xiàn)7個(gè)物種EGFR基因部分cDNA序列僅在211、235、253、453、481、604、604、652、664、709、841 bp十個(gè)基因位點(diǎn)有明顯差異，其他位點(diǎn)堿基同源性極高；在MEGA5.0系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建中發(fā)現(xiàn)馴鹿EGFR基因與牛的親緣關(guān)系最近，與人親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，其中羊、小須鯨、野豬、馬與馴鹿的親緣關(guān)系介于牛和人之間，依據(jù)分類學(xué)特點(diǎn)理論上應(yīng)該是牛、羊、野豬同屬偶蹄目其親緣關(guān)系應(yīng)該較馬、鯨、人與馴鹿近，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明野豬EGFR基因在分子層面與馴鹿EGFR基因的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；最后在用在線分析軟件ViennaRNA Web Services對(duì)馴鹿EGFR基因部分cDNA對(duì)應(yīng)的mRNA進(jìn)行最小自由能二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖5)，從圖中可以看出，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)莖區(qū)和環(huán)區(qū)分布比較合理，結(jié)構(gòu)相對(duì)比較穩(wěn)定，是快速生長(zhǎng)期馴鹿茸表皮組織EGFR基因穩(wěn)定表達(dá)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

基于前人對(duì)EGFR基因研究，筆者認(rèn)為通過(guò)對(duì)馴鹿EGFR基因的探索，尤其對(duì)EGFR基因序列分析、調(diào)控作用原理以及信號(hào)通路的研究，對(duì)于鹿茸快速生長(zhǎng)機(jī)理的深入了解和生物模型的構(gòu)建有著廣闊的前景，且能為后續(xù)鹿茸生長(zhǎng)發(fā)育分子生物學(xué)研究提供可供參考的試驗(yàn)依據(jù)。

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CloningandSequenceAnalysisofEGFRGeneinReindeer//

Wang Qianghui, Zhai Jiancheng, Xia Yanling, Liu Weishi, Li Heping
(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(9)：77-80.

Reindeer；EGFRgene； RT-PCR； Molecular cloning； Bioinformatics

Q781

1)國(guó)家林業(yè)局珍稀瀕危物種野外救護(hù)與繁育項(xiàng)目(2012)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2572016AA42)。

王強(qiáng)輝，男，1994年8月生，東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，碩士研究生。E-mail：wangqianghui@nefu.edu.cn。

李和平，東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，教授。E-mail：lihepinghrb2002@nefu.edu.cn。

2017年3月24日。

責(zé)任編輯：程 紅。

The epidermal tissue of antler-tip of male reindeer was used as the research materials, and total RNA was extracted from it. The homologous primers were designed according to the epidermal growth factor receptor (EGFR) gene sequence of cattle and sheep in GenBank database. Part cDNA sequences EGFR gene in coding region, which had 910 base pairs in length, was first obtained by RT-PCR and the molecular cloning technique. TheEGFRgene homology between reindeer and cattle, sheep, horse, human, whale, and wild boar respectively was 97%, 96%, 88%, 86%, 92% and 89% by the bioinformatics and Blast analysis. The homologies, all of them, were above 85%. The reindeerEGFRgene was more conserved in its evolution. In the construction of phylogenetic tree, the genetic relationship of reindeer EGFR gene with cattle was the closest, and with human was the furthest. The minimum free energy secondary structure of theEGFRgene sequence was predicted by the online analysis software.