林云志，唐 浩，周亞龍，趙曉彪，曾 凱

解放軍第187醫(yī)院肝膽外科，海南 ?？?571158

DEK基因在肝癌中的表達及靶向抑制其表達對肝癌細胞增殖及凋亡的影響

林云志，唐 浩，周亞龍，趙曉彪，曾 凱

解放軍第187醫(yī)院肝膽外科，海南 ?？?571158

目的探討DEK基因在肝癌中的表達及RNA干擾抑制其表達對肝癌細胞增殖及凋亡的影響及機制。方法以人正常肝細胞HL-7702作為對照，RT-PCR檢測人肝癌HepG2、Huh-7、SMMC-7721、SNU-475細胞中DEK mRNA表達；DEK-siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞，同時轉(zhuǎn)染陰性對照和空白對照，轉(zhuǎn)染48 h后Western blotting檢測各組細胞中DEK、Cleaved caspase 3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表達；CCK8實驗和流式細胞儀分別檢測細胞的增殖及凋亡情況。結(jié)果各個肝癌細胞中DEK mRNA表達均顯著高于正常細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);DEK基因在HepG2細胞中表達最高，選擇作為后續(xù)研究對象；轉(zhuǎn)染DEK-siRNA后DEK蛋白表達顯著降低；DEK-siRNA組細胞存活率及β-catenin、Cyclin D1蛋白表達顯著低于空白對照組和陰性對照組，細胞凋亡率和Cleaved caspase 3蛋白表達顯著高于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論抑制肝癌HepG2細胞中DEK基因可降低癌細胞的增殖及誘導(dǎo)細胞凋亡，其機制與Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控有關(guān)。

肝癌；DEK基因；增殖；凋亡；Wnt/β-catenin信號通路

肝癌是常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一，具有早期診斷困難、發(fā)展迅速、惡性程度高、治療困難、病死率高等特點，對人類的健康和生存造成了嚴重的威脅[1]。肝癌的發(fā)生是多種因素協(xié)同作用的結(jié)果，與多種基因的表達異常有直接或間接聯(lián)系。因此，尋找引發(fā)肝癌發(fā)生的關(guān)鍵分子并探索治療手段成為目前肝癌研究領(lǐng)域的熱點。DEK基因位于人類6號染色體短臂上，是一個磷酸化的蛋白[2]。最近的研究[3-4]表明，DEK基因在結(jié)腸癌、宮頸癌等多種人類腫瘤中有高表達，其表達與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，可能作為腫瘤生物治療的新靶點。但DEK基因?qū)Ω伟┑挠绊懠白饔脵C制尚不明確。因此，本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默肝癌細胞中DEK基因的表達，并研究沉默后肝癌細胞的增殖及凋亡情況，并進一步探討其機制，以期為該病的分子診斷及靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器人肝癌HepG2、Huh-7、SMMC-7721、SNU-475細胞及人正常肝細胞HL-7702購自中國科學(xué)院細胞庫；胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素、RPMI 1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；siRNA購自美國Santa Cruz公司；CCK8細胞增殖試劑盒、BCA試劑盒、Annexin V-FITC凋亡試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；熒光定量試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takala；Cleaved caspase-3、β-catenin、Cyclin D1抗體購自美國Abcam公司；酶標儀購自美國Bio-Rad公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2細胞培養(yǎng)人肝癌HepG2、Huh-7、SMMC-7721、SNU-475細胞及人正常肝細胞HL-7702在含有100 g/L胎牛血清、100 mg/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液，置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的 CO2、95%飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長融合度達到80%時用2.5 g/L的胰蛋白酶消化細胞，完全培養(yǎng)基終止消化，根據(jù)實驗需要傳代。取對數(shù)生長期的細胞用于實驗研究。

1.3肝癌細胞中DEKmRNA表達檢測收集生長至對數(shù)期的人肝癌HepG2、Huh-7、SMMC-7721、SNU-475細胞及人正常肝細胞HL-7702，RNA提取試劑盒提取各個細胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA。利用Oligo7設(shè)計DEK及內(nèi)參GAPDH的RT-PCR引物。所有引物由上海生工合成。DEK引物序列：上游引物：5′-CCAGGCACTGTGTCCTCATT-3′，下游引物：5′-GGCAATGGTTTGCCAGAAGG-3′。GAPDH引物序列：上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s；56 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。最后72 ℃延伸15 min，4 ℃保存。每個樣品設(shè)置6個重復(fù)，利用2-△△Ct法計算肝癌細胞中DEK mRNA相對表達量。2-△△Ct為基因相對表達，△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。

1.4細胞siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞分為空白對照組(不經(jīng)任何處理)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染10 nmol/L的無關(guān)干擾序列)、DEK沉默組(轉(zhuǎn)染10 nmol/L的DEK-siRNA)。取生長至對數(shù)期的HepG2細胞，轉(zhuǎn)染前以1×106個/孔將細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，細胞生長密度達到90%時進行轉(zhuǎn)染，整個轉(zhuǎn)染過程嚴格按照美國Invitrogen 公司LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明進行操作。

1.5轉(zhuǎn)染后的DEK基因表達檢測收集轉(zhuǎn)染48 h的細胞，加入細胞裂解液冰上反應(yīng)30 min，4 ℃，14 000 r/min離心15 min，收集蛋白。BCA試劑盒對蛋白進行定量。按照1∶5的比例充分混勻蛋白樣品與上樣緩沖液，100 ℃沸水中煮沸變性5 min，每孔中加入40 μg變性蛋白置于120 g/L的SDS-PAGE分離，電泳后PVDF轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉，以1∶500稀釋的DEK和1∶1 000稀釋的GAPDH作為一抗，4 ℃孵育過夜，加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃孵育1 h。TBST清洗后化學(xué)發(fā)光增強劑(ECL)顯色、顯影、定影。以GAPDH作為內(nèi)參，分析DEK的蛋白表達水平。

1.6CCK8檢測細胞增殖情況收集轉(zhuǎn)染后細胞，以2 000個/孔細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔，置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細胞，每孔中加入CCK8試劑10 μl，37 ℃條件下孵育細胞4 h。酶標儀測定各孔吸光度前用空白對照孔凋零，凋零完成后在570 nm波長處測定并記錄各組的吸光度A。實驗重復(fù)3次。計算細胞增殖率，細胞增殖率(%)=(轉(zhuǎn)染組細胞A/對照組細胞A)×100%。

1.7流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的siRNA，預(yù)冷的PBS洗滌細胞3次，結(jié)合緩沖液重懸細胞，制成單細胞懸液。根據(jù)細胞凋亡試劑盒的說明檢測細胞的凋亡情況，計算細胞凋亡率。

1.8Westernblotting檢測Cleavedcaspase3、β-catenin、CyclinD1蛋白表達收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的siRNA，提取細胞中的蛋白，按照1.5方法檢測凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase 3及Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin和Cyclin D1的蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1DEK基因在肝癌細胞中的表達RT-PCR檢測人肝癌HepG2、Huh-7、SMMC-7721、SNU-475細胞及人正常肝細胞HL-7702中DEK mRNA表達，結(jié)果顯示，與人正常肝細胞HL-7702比較，各肝癌細胞中DEK mRNA表達均顯著升高(P<0.01)。DEK基因在HepG2細胞中的表達最高，選擇作為后續(xù)研究對象(見圖1)。

2.2轉(zhuǎn)染siRNA后DEK基因的表達各組siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，Western blotting檢測細胞中DEK蛋白表達，結(jié)果顯示，DEK-siRNA組DEK蛋白表達顯著低于空白對照組(P<0.01)，空白對照組與陰性對照相比，DEK蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖2)。

2.3轉(zhuǎn)染DEK-siRNA對肝癌細胞增殖的影響CCK8實驗檢測細胞增殖結(jié)果顯示，DEK-siRNA組細胞存活率顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01，見圖3)。

2.4轉(zhuǎn)染DEK-siRNA促進肝癌細胞凋亡流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染siRNA后各組細胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，DEK-siRNA組細胞凋亡率顯著高于空白對照組和陰性對照組(P<0.01，見圖4)。

注：與HL-7702細胞比較，**P<0.01。 注：與DEK-siRNA組比較，**P<0.01。

圖1DEK基因在肝癌細胞中的表達；圖2轉(zhuǎn)染siRNA后DEK基因的表達A：Western blotting檢測結(jié)果；B：蛋白的相對表達量

Fig1ExpressionofDEKgeneinhepatocellularcarcinomacells;Fig2ExpressionofDEKgeneaftertransfectedsiRNAA: Western blotting detection results; B: relative expression of protein

注：與DEK-siRNA組比較，**P<0.01。

圖3轉(zhuǎn)染DEK-siRNA對肝癌細胞增殖的影響

Fig3TheproliferationofhepatocellularcarcinomacellsaftertransfectedDEK-siRNA

2.5轉(zhuǎn)染DEK-siRNA對Cleavedcaspase3、β-catenin、CyclinD1蛋白表達的影響Western blotting檢測各組細胞中凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase 3及Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin和Cyclin D1蛋白表達，結(jié)果顯示，DEK-siRNA組Cleaved caspase 3蛋白表達顯著高于空白對照組和陰性對照組，β-catenin和Cyclin D1的蛋白表達顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01,見圖5)。

注：與DEK-siRNA組比較，**P<0.01。

注：與DEK-siRNA組比較，**P<0.01。

圖5轉(zhuǎn)染DEK-siRNA對Cleavedcaspase3、β-catenin、CyclinD1蛋白表達的影響A：Western blotting檢測結(jié)果；B：蛋白相對表達量Fig5ExpressionsofCleavedcaspase3,β-catenin,CyclinD1proteinsaftertransfectedDEK-siRNAA: Western blotting detection results; B: relative expression of protein

3 討論

惡性腫瘤具有無限、快速增殖能力，對人類的生命健康造成嚴重的威脅，其發(fā)生是一個多因素、多步驟的復(fù)雜生理病理過程，隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)等的不斷發(fā)展，多種腫瘤的生物標記物在腫瘤中的作用受到了廣泛關(guān)注[5]。DEK基因是一個高度保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，已被研究[6-7]證實,DEK是一個原癌基因，在膀胱癌、惡性膠質(zhì)瘤等多種人類腫瘤中均出現(xiàn)過表達，研究[8-9]顯示，通過RNA干擾技術(shù)沉默結(jié)腸癌、宮頸癌等腫瘤細胞中DEK基因的表達可降低細胞增殖及誘導(dǎo)凋亡。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈RNA介導(dǎo)的能使基因在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生沉默的現(xiàn)象，具有高度的有效性、特異性，對于基因功能研究、基因治療等有重要作用[10]。

本研究通過RNAi技術(shù)沉默肝癌細胞中DEK基因表達，CCK8實驗和流式細胞術(shù)分別檢測細胞的增殖及凋亡情況，結(jié)果顯示，細胞的增殖明顯受到抑制，凋亡增加。細胞凋亡是機體為調(diào)控自身細胞的增殖與凋亡平衡、維持自身組織穩(wěn)定及由基因控制的細胞的主動性死亡過程，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[11]。Caspase家族在細胞凋亡過程中有重要作用，Caspase 3是Caspase級聯(lián)反應(yīng)下游的關(guān)鍵酶，也是凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，正常情況下以無活性的狀態(tài)存在，在受到凋亡刺激信號后被激活，從而誘導(dǎo)細胞凋亡，其活化是凋亡進入不可逆階段的標志，因此被稱為“凋亡的執(zhí)行者”[12-13]。本研究結(jié)果顯示，抑制DEK基因表達可顯著上調(diào)Cleaved caspase 3蛋白的表達。

Wnt/β-catenin信號通路是Wnt信號通路中的一條經(jīng)典信號通路，是一條高度保守的信號傳導(dǎo)通路，與腫瘤、衰老和退化、骨質(zhì)疏松等疾病密切相關(guān)，參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡、分化等過程[14]，在多種惡性腫瘤中均有異常表達，如人類胃癌、肺癌、肝癌等，其表達加速了腫瘤的發(fā)生及發(fā)展進程[15-17]，也有研究指出，抑制Wnt/β-catenin信號通路可降低腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[18]。本研究通過RNAi抑制DEK的表達后檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、Cyclin D1的蛋白表達，結(jié)果顯示，β-catenin、Cyclin D1的蛋白表達均顯著下調(diào)。

綜上所述， 抑制肝癌HepG2細胞中DEK基因表達可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路降低癌細胞的增殖及誘導(dǎo)細胞凋亡。該研究為肝癌的分子診斷及靶向治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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(責任編輯：王全楚)

Expression of DEK gene in hepatocellular carcinoma and the effect of targeted inhibition gene expression on the proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma cells

LIN Yunzhi, TANG Hao, ZHOU Yalong, ZHAO Xiaobiao, ZENG Kai

Department of Hepatobiliary Surgery, the 187 Hospital of People’s Liberation Army, Haikou 571158, China

ObjectiveTo investigate the expression of DEK in hepatocellular carcinoma (HCC) and the effect of RNA interference on the proliferation and apoptosis of HCC cells.MethodsHuman normal liver cell line HL-7702 was as the control, expressions of DEK gene mRNA in human HCC HepG2, Huh-7, SMMC-7721, SNU-475 cells were detected by RT-PCR; DEK-siRNA was transfected into HepG2 cells, meanwhile negative control group and blank control group were transfected. Expressions of DEK, Cleaved caspase 3, β-catenin, Cyclin D1 protein after transfection for 48 hours were detected by Western blotting; CCK8 assay and flow cytometry were used to detect the proliferation and apoptosis of cells.ResultsThe expression of DEK mRNA in various HCC cells was significantly higher than that in normal cells (P<0.01), the expression of DEK gene was highest in HepG2 cells and it was selected as follow up study. The expression of DEK was significantly decreased after transfected DEK-siRNA. Cell survival rate and expressions of β-catenin, Cyclin D1 protein were significantly lower than those in blank control group and negative control group, the apoptosis rate and the expression of Cleaved caspase 3 protein were significantly higher than those in blank control group and negative control group (P<0.01).ConclusionDEK gene can inhibit the proliferation and induce apoptosis of human HCC cell line HepG2, and its mechanism is related to the regulation of Wnt/β-catenin signaling pathway.

Hepatocellular carcinoma; DEK gene; Proliferation; Apoptosis; Wnt/β-catenin signaling pathway

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.09.011

R735.7

：A

：1006-5709(2017)09-1002-04

：2017-04-26

林云志，本科，主治醫(yī)師，研究方向：肝膽胰外科。E-mail:Swf1301@126.com