崔 宏， 楊楠木， 賀 濤， 萬百順， 韓 風(fēng)

河南省腫瘤醫(yī)院 鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰腺外科，河南 鄭州 450052

論著·肝相關(guān)疾病

YAP調(diào)控Wnt信號通路影響肝癌細胞凋亡的研究

崔 宏， 楊楠木， 賀 濤， 萬百順， 韓 風(fēng)

河南省腫瘤醫(yī)院 鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰腺外科，河南 鄭州 450052

目的探討Yes相關(guān)蛋白(Yes associated protein, YAP)對肝癌細胞凋亡的影響。方法Western blotting方法檢測人肝癌細胞HuH-7、HepG2、SNU-449和人正常肝細胞7702中YAP的表達水平。在肝癌細胞中轉(zhuǎn)染YAP小干擾RNA1(YAP siRNA1組)和YAP小干擾RNA2(YAP siRNA2組)，同時轉(zhuǎn)染對照siRNA(siRNA-NC組)，未轉(zhuǎn)染組只加入轉(zhuǎn)染試劑，培養(yǎng)48 h后，Western blotting檢測細胞中YAP水平，篩選出干擾效率較高的YAP siRNA2繼續(xù)研究。MTT檢測細胞增殖，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，激光掃描共聚焦顯微鏡法檢測活性氧(ROS)水平，Western blotting檢測細胞中β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、Wnt信號通路下游靶基因(C-myc)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)蛋白水平。結(jié)果人肝癌細胞HuH-7、HepG2、SNU-449中YAP表達水平均高于人正常肝細胞7702，且在HepG2細胞中YAP的表達水平最高。YAP siRNA1、YAP siRNA2能夠成功干擾肝癌細胞中YAP的表達水平，且YAP siRNA2的干擾效率最高。YAP siRNA2組細胞存活率和細胞中β-catenin、C-myc水平均低于未轉(zhuǎn)染組，凋亡率和細胞中Cleaved Caspase-3、ROS水平均高于未轉(zhuǎn)染組(P<0.01)。結(jié)論干擾YAP表達后能夠促進肝癌細胞凋亡，抑制肝癌細胞增殖，Wnt信號通路是其可能的作用機制之一。

肝癌；凋亡；增殖；Yes相關(guān)蛋白

肝細胞癌又稱為肝癌,是目前世界范圍內(nèi)的第5大惡性腫瘤[1]。肝癌在中國的死亡率在全部惡性腫瘤中位居第2位[2]。肝癌的發(fā)生與癌基因有關(guān)，這些癌基因能夠促進肝癌細胞的增殖，抑制肝癌細胞的凋亡導(dǎo)致肝癌細胞中癌癥發(fā)生有關(guān)的信號通路異常激活引起肝癌的惡化[3-4]。Yes相關(guān)蛋白(Yes associated protein, YAP)是一種癌基因，在宮頸癌、肝癌、腎癌等多種癌癥的形成過程中發(fā)揮促進作用[5-7]。YAP能夠促進癌細胞的增殖，抑制癌細胞的凋亡，抑制癌細胞中YAP的表達能夠抑制癌細胞的生長[8]。本研究中，以人肝癌細胞為研究對象，小RNA干擾肝癌細胞中YAP表達，探討YAP對肝癌細胞生長和凋亡的作用及機制。

1 材料與方法

1.1細胞人肝癌細胞HuH-7、HepG2、SNU-449和人正常肝細胞7702均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞庫。

1.2主要試劑及儀器β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體、Wnt信號通路下游靶基因(C-myc)抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3, Cleaved Caspase-3)抗體、β肌動蛋白(β-actin)抗體均購自上?；馍锟萍加邢薰荆灰鹊鞍酌纲徸悦绹鳶igma；胎牛血清購自美國GIBCO；激光掃描共聚焦顯微鏡購自杭州赫貝科技有限公司；2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate, H2DCFDA)購自上海開放生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS)、噻唑藍(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)、二甲基亞砜(Dimethyl sulphoxide, DMSO)均購自碧云天生物技術(shù)研究所；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司；酶標(biāo)儀購自美國Thermo。

1.3細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)方法參照參考文獻[9]，人肝癌細胞HuH-7、HepG2、SNU-449和人正常肝細胞7702用含有100 g/L胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)條件為37 ℃，體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱。取出保存在液氮中的細胞，放在37 ℃水浴鍋中在1 min內(nèi)將細胞融化，用細胞培養(yǎng)液懸浮細胞后，接種到細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細胞密度達到90%時，棄去培養(yǎng)液上清，用PBS洗滌細胞兩次后，加入2.5 g/L的胰蛋白酶消化1 min，1 000 r/min離心10 min(離心半徑r=10 cm)后，用細胞培養(yǎng)液懸浮細胞后，根據(jù)不同的實驗需求接種到細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.4Westernblotting檢測細胞中YAP表達水平收集人肝癌細胞HuH-7、HepG2、SNU-449和人正常肝細胞7702，用冰預(yù)冷的PBS洗滌細胞兩次后，每以1×106個細胞加入100 μl的細胞裂解液，放在冰上裂解30 min后，將蛋白上清轉(zhuǎn)移至EP管中，用BCA定量檢測試劑盒檢測提取的蛋白濃度。將蛋白樣品與2×的Loading buffer按照1∶1的比例混合后，置于100 ℃煮沸5 min。取變性蛋白樣品加入到凝膠上樣孔中，每孔加入50 μl的蛋白樣品，80 V電壓電泳觀察溴酚藍進入到分離膠頂端時，把電壓升高到120 V直到溴酚藍進入分離膠底部。將凝膠上的蛋白在90 V電壓轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜時間為90 min。用50 g/L脫脂奶粉在室溫下封閉90 min后，與1∶500稀釋的一抗在4 ℃反應(yīng)過夜后，置于1∶2 000稀釋后的二抗中，室溫環(huán)境下孵育90 min。滴加顯色液，圖像分析軟件分析目的蛋白相對于β-actin的表達水平。同時用Western blotting方法處理按照以上方法處理48 h后的各組細胞中β-catenin、C-myc、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平。

1.5細胞轉(zhuǎn)染人肝癌細胞分為4組，依次為未轉(zhuǎn)染組、siRNA-NC組、YAP siRNA1組、YAP siRNA2組。siRNA-NC組、YAP siRNA1組、YAP siRNA2組細胞中依次轉(zhuǎn)染(YAP siRNA1與YAP siRNA2是兩條不同的YAP小干擾RNA,其序列不同)，未轉(zhuǎn)染組中只加入轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine?2000說明書。轉(zhuǎn)染后48 h，Western blotting檢測細胞中YAP蛋白水平。

1.6MTT檢測細胞增殖取轉(zhuǎn)染后的各組肝癌細胞，以每孔3 000個細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜后，在每孔中加10 μl的5 mg/ml的MTT溶液，在37 ℃條件下孵育4 h。吸除上清液，在細胞中加入150 μl的DMSO溶液。設(shè)置空白組，空白組中不加入細胞，每組設(shè)置8個復(fù)孔。酶標(biāo)儀上檢測每孔的光密度值(optical density,OD)，計算每組細胞存活率。細胞存活率(%)=(轉(zhuǎn)染組OD值-空白組OD值)/(未轉(zhuǎn)染組OD值-空白組OD值)×100%。

1.7流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡取轉(zhuǎn)染后的各組肝癌細胞培養(yǎng)48 h，用胰蛋白酶消化后，收集1×106個細胞，用冰預(yù)冷的PBS重懸洗滌細胞2次，加入500 μl的結(jié)合緩沖液后，混合均勻，加10 μl的膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)，放置于避光條件下，室溫環(huán)境反應(yīng)30 min，加入碘化丙啶(propidium iodide, PI) 5 μl，避光孵育5 min。流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.8激光掃描共聚焦顯微鏡法檢測ROS水平取轉(zhuǎn)染后的各組肝癌細胞，接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔中加入4 000個細胞培養(yǎng)48 h后，用移液槍把培養(yǎng)液上清去除后，每孔中加入5 μmol/L的100 μl的H2DCFDA染液，在避光環(huán)境下反應(yīng)30 min后，用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細胞熒光強度，激發(fā)波長和吸收波長分別為488 nm和490 nm。細胞中ROS水平越高，熒光強度越高。

2 結(jié)果

2.1細胞中YAP表達檢測結(jié)果Western blotting檢測人肝癌細胞HuH-7、HepG2、SNU-449和人正常肝細胞7702中YAP表達水平。人肝癌細胞HuH-7、HepG2、SNU-449中YAP表達水平均明顯高于人正常肝細胞7702，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。HepG2細胞中YAP表達最高，后續(xù)選用HepG2細胞繼續(xù)研究(見圖1)。

注：1：人正常肝細胞7702；2：人肝癌細胞HuH-7；3：人肝癌細胞HepG2；4：人肝癌細胞SNU-449；與1相比，aP<0.01；與2相比，bP<0.01；與4相比，cP<0.01。

圖1YAP在各肝細胞組中的表達水平A：細胞中YAP表達水平；B：YAP相對表達水平

Fig1ExpressionofYAPineachgroupA： the expression of YAP detected by Western blotting; B: relative expression of YAP

2.2轉(zhuǎn)染后細胞中YAP表達檢測結(jié)果人肝癌細胞轉(zhuǎn)染siRNA-NC、YAP siRNA1、YAP siRNA2后，檢測細胞中YAP表達水平。siRNA-NC組中YAP表達水平與未轉(zhuǎn)染組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。YAP siRNA1組、YAP siRNA2組細胞中YAP表達水平明顯低于未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。YAP siRNA2組細胞中YAP水平明顯低于YAP siRNA1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。后續(xù)選用YAP siRNA2干擾肝癌細胞中YAP水平(見圖2)。

2.3細胞增殖、凋亡檢測結(jié)果YAP siRNA2組細胞存活率明顯低于未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見圖3A)。YAP siRNA2組細胞凋亡率高于未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見圖3B、3C)。

2.4細胞中ROS水平檢測結(jié)果YAP siRNA2組ROS水平高于未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。干擾YAP后能夠促進肝癌細胞產(chǎn)生ROS(見圖4)。

注：1：未轉(zhuǎn)染組；2：siRNA-NC組；3：YAP siRNA1組；4：YAP siRNA2組；與1相比，aP<0.01；與3相比，bP<0.01。

圖2轉(zhuǎn)染后各肝細胞組中YAP表達A：細胞中YAP表達水平；B：YAP相對表達水平

Fig2ExpressionofYAPintransfectedcellsineachgroupA: the expression of YAP detected by Western blotting; B: relative expression of YAP

2.5細胞中β-catenin、C-myc、CleavedCaspase-3水平檢測結(jié)果YAP siRNA2組細胞中β-catenin、C-myc表達水平低于未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。YAP siRNA2組細胞中Cleaved Caspase-3表達水平高于未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見圖5)。

3 討論

YAP基因參與組織器官的生長過程，在腫瘤組織中發(fā)揮癌基因的作用。前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等癌癥組織中均存在YAP的表達上調(diào)[10-11]。有研究[12-14]表明，沉默人胃癌細胞BGC823、人甲狀腺癌細胞TPC-1中YAP基因的表達能夠抑制癌細胞的生長，促進癌細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，YAP在人肝癌細胞中的表達水平均高于人正常肝細胞，并且HepG2細胞在3株肝癌細胞中的表達水平最高。進一步運用小RNA干擾技術(shù)干擾肝癌細胞中YAP的表達水平，MTT檢測了細胞增殖情況，結(jié)果顯示，干擾YAP后的肝癌細胞的存活率顯著下降。這與之前的研究報道相符[12]。

細胞凋亡受多種基因的一系列復(fù)雜調(diào)控[15]。與細胞凋亡相關(guān)的蛋白稱為細胞凋亡蛋白。Caspase蛋白酶家族在細胞凋亡過程中發(fā)揮促進作用，當(dāng)?shù)蛲鲂盘柊l(fā)出時，能夠激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，促進Caspase-3的活化，導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生[16-17]。有研究[18]表明，Caspase-3是凋亡的執(zhí)行因子，Caspase-3的激活標(biāo)志著細胞凋亡進入了一個不可逆的階段。細胞內(nèi)ROS水平異常升高也能夠促進細胞凋亡的發(fā)生[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾YAP后的肝癌細胞凋亡率升高，細胞中Caspase-3活化水平及ROS水平也明顯升高。

注：1：未轉(zhuǎn)染組；2：siRNA-NC組；3：YAP siRNA2組；與1相比，aP<0.01。

Fig3EffectofYAPoncellproliferationandapoptosisA: cell viability; B: apoptotic rate; C: apoptosis detected by flow cytometry

注：1：未轉(zhuǎn)染組；2：siRNA-NC組；3：YAP siRNA2組；與1相比，aP<0.01。

圖4YAP對細胞中ROS水平的影響
Fig4TheeffectofYAPonthelevelofROSincells

細胞生長和凋亡受細胞內(nèi)多種信號通路的共同調(diào)控。Wnt信號通路是一種廣泛存在于多種組織和器官中的與細胞生長有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Wnt信號通路的中心是β-catenin，而C-myc是Wnt信號通路的下游靶基因[20]。有研究[21]表明，Wnt信號通路在腫瘤組織中異常激活，β-catenin、C-myc在腫瘤組織中表達異常升高，沉默β-catenin、C-myc后的腫瘤生長受到抑制。本研究中，干擾YAP后肝癌細胞中Caspase-3活化及ROS水平增多，細胞內(nèi)β-catenin、C-myc表達降低，提示干擾YAP可能通過作用于Wnt信號通路，進而調(diào)控Caspase-3的激活，使細胞產(chǎn)生大量的ROS，從而導(dǎo)致肝癌細胞生長受到抑制，凋亡增多。

注：1：未轉(zhuǎn)染組；2：siRNA-NC組；3：YAP siRNA2組；與1相比，aP<0.01。

圖5YAP對細胞中β-catenin、C-myc、CleavedCaspase-3水平影響結(jié)果A：以β-actin為內(nèi)參，目的蛋白相對表達水平;B：Western blotting結(jié)果

Fig5TheeffectofYAPontheexpressionsofβ-catenin,C-myc,CleavedCaspase-3incellsA: β-actin for reference, the relative expression of target protein; B: Western blotting results

綜上所述，YAP在肝癌細胞中表達上調(diào)。干擾YAP表達后能夠抑制肝癌細胞增殖，促進肝癌細胞凋亡，作用機制可能與Wnt信號通路調(diào)控Caspase-3活化及ROS水平有關(guān)。這為后續(xù)在體外研究YAP對肝癌發(fā)生和發(fā)展的作用機制奠定了基礎(chǔ)，為肝癌細胞治療和早期診斷提供了新思路。

致謝

本研究感謝鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室和導(dǎo)師趙國強教授的幫助和支持。

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(責(zé)任編輯：王全楚)

Regulation of Wnt signaling pathway by YAP on apoptosis of hepatocellular carcinoma cells

CUI Hong, YANG Nanmu, HE Tao, WAN Baishun, HAN Feng

Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, the Cancer Hospital of He’nan, the Tumor Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China

ObjectiveTo investigate the effects of Yes associated protein (YAP) on apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.MethodsWestern blotting method was used to detect the expression of YAP in human hepatocellular carcinoma cell line HuH-7, HepG2, SNU-449 and human normal liver cell 7702.YAP small interfering siRNA1 (YAP siRNA1 group) and YAP small interfering RNA2 (YAP siRNA2 group) were transfected into hepatocellular carcinoma cells, at the same time, the control siRNA (siRNA-NC group) was transfected into hepatocellular carcinoma cells, the transfection group was only transfected with transfection reagent. After culturing 48 hours, YAP protein level in cells was detected by Western blotting, YAP siRNA2 with higher interference efficiency was screened out. Cell proliferation was detected by MTT. Cell apoptosis was detected by flow cytometry. ROS was detected by laser scanning confocal microscopy. β-catenin, C-myc and Cleaved Caspase-3 protein levels in cells were detected by Western blotting.ResultsThe expression of YAP in human hepatocellular carcinoma cells HuH-7, HepG2 and SNU-449 was higher than that in normal human hepatocytes 7702, the highest expression of YAP was observed in HepG2 cells. YAP siRNA1 and YAP siRNA2 could successfully interfere with the expression of YAP in hepatocellular carcinoma cells, the interference efficiency of YAP siRNA2 was the highest. The cell survival rate and β-catenin, C-myc levels in the YAP group were lower than those in the siRNA2 group, the apoptosis rate and the level of Cleaved Caspase-3, ROS in the cells were higher than those in the non-transfected group (P<0.01).ConclusionInterfering with the expression of YAP can promote the apoptosis of hepatoma cells, inhibite proliferation of hepatoma cells, Wnt signaling pathway is one of the possible mechanisms.

Hepatocellular carcinoma; Apoptosis; Proliferation; Yes associated protein

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.09.010

R735.7

：A

：1006-5709(2017)09-0997-05

：2017-03-17

崔宏，碩士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：肝膽胰基礎(chǔ)和臨床。E-mail：dcm138@126.com

韓風(fēng)，碩士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：肝膽胰基礎(chǔ)和臨床。E-mail：lqiong159@126.com