陳 吉，崔 宏，段 聿，高美麗，牛昊書

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院)消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古 包頭 014010

AIF和HSP70在胃息肉及胃癌中的表達及其相關(guān)性研究

陳 吉，崔 宏，段 聿，高美麗，牛昊書

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院)消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古 包頭 014010

目的檢測凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)及熱休克蛋白70(HSP70)mRNA在胃癌及胃息肉中的表達，探討其對胃癌的發(fā)生、發(fā)展的影響。方法收集內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院120例活檢標(biāo)本，依據(jù)病理分為胃增生性息肉組、胃腺瘤性息肉組、胃癌組、正常胃黏膜組，每組30例。采用實時熒光定量PCR檢測相應(yīng)胃黏膜組織中AIF mRNA與HSP70 mRNA的表達水平。結(jié)果在胃增生性息肉、胃腺瘤性息肉及胃癌組織中，AIF及HSP70 mRNA的表達呈逐漸上升趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在胃腺瘤性息肉組及胃癌組中，AIF mRNA與HSP70 mRNA的表達呈正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論AIF及HSP70基因可能與胃癌形成有關(guān)，均可作為胃癌早期診斷的臨床指標(biāo)，AIF mRNA和HSP70 mRNA可能在胃癌的形成及發(fā)展過程中發(fā)揮協(xié)同作用，可能為基因的協(xié)同治療提供新靶點。

凋亡誘導(dǎo)因子；熱休克蛋白70；胃息肉；胃癌

胃癌發(fā)生是細胞增殖與分化異常所致，除此之外，細胞凋亡過程出現(xiàn)異常也是癌變的重要原因之一。凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor, AIF)是一種凋亡效應(yīng)分子[1]，其介導(dǎo)的凋亡可不依賴于Caspase途徑[2]。正常生理狀態(tài)下，AIF位于線粒體的膜間隙，具有氧化還原酶活性，細胞受到凋亡刺激后，AIF從線粒體易位到胞漿及細胞核中，在細胞核中與染色體結(jié)合，從而引起細胞凋亡[3-4]。熱休克蛋70(Heat-shock protein70, HSP70)是熱休克蛋白家族中最重要一類，具有分子伴侶作用。在應(yīng)激狀態(tài)下，HSP70可與蛋白質(zhì)結(jié)合，保護蛋白質(zhì)，參與其折疊和裝配并介導(dǎo)該蛋白的定位和轉(zhuǎn)運；同時為了防止蛋白質(zhì)的積聚，HSP70也參與蛋白質(zhì)的水解過程。HSP70可通過與癌基因或抑癌基因蛋白的作用，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[5]。作為分子伴侶，HSP70保護腫瘤細胞免受大范圍的凋亡，并通過與原癌基因和抑癌基因及其相應(yīng)蛋白的相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、分化。在許多腫瘤組織和細胞中HSP70呈高表達，并且與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。故HSP70與腫瘤細胞的增生及凋亡關(guān)系密切。在胃癌、胃息肉中聯(lián)合檢測AIF mRNA及HSP70 mRNA的表達目前尚無文獻報道，本實驗旨在通過檢測AIF及HSP70在胃癌及胃息肉中表達，探討它們對胃癌發(fā)生、發(fā)展的影響，從而為胃癌的早期診斷和治療提供一些新的方法和思路。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2013年7月-2014年7月在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院)內(nèi)鏡中心行胃鏡檢查并活檢的標(biāo)本共90例，分為正常胃黏膜組30例，男11例，女19例，年齡(41.0±8.8)歲(35～52歲)(為健康體檢者或僅以腹脹、腹部不適糾正，行13C呼氣試驗排除H.pylori感染，就診4周內(nèi)均未服用質(zhì)子泵抑制劑、抗菌素、鉍劑及非甾體抗炎藥物，均無飲酒史)；增生性息肉組30例，男9例，女21例，年齡(38.6±11.2)歲(26～60歲)；腺瘤性息肉組30例，男17例，女13例，年齡(42.4±6.8)歲(40～53歲)；選取同期在本院內(nèi)窺鏡中心行胃鏡活檢的及普通外科、腫瘤外科手術(shù)切除的胃腺癌標(biāo)本30例，男14例，女16例，年齡(52.2±12.0)歲(44～70歲)。

1.2實驗方法

1.2.1 標(biāo)本的采集：標(biāo)本均經(jīng)胃鏡下通過活檢取得或手術(shù)切除獲得，所有組織標(biāo)本采集前需經(jīng)患者同意并簽署知情同意書，標(biāo)本分成兩份，一份送病理科證實為相應(yīng)分組病理類型，另一份作為實驗用標(biāo)本。

1.2.2 標(biāo)本的存放：將標(biāo)本放入凍存管中(預(yù)先裝有保護劑)，凍存于-196 ℃液氮中。

1.2.3 Real Time PCR檢測AIF與HSP70 mRNA的表達：將超低溫凍存的組織樣品迅速轉(zhuǎn)移至事先用液氮作預(yù)冷處理的研缽中，研杵研磨，期間不斷加入液氮，直至將樣品研磨成粉末狀，充分勻漿，再將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管，在4 ℃環(huán)境中，12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入1 ml 750 g/L的乙醇洗滌沉淀，再次4 ℃，12 000 r/min離心5 min獲得RNA，從所得的RNA溶液中分裝出5.0 μl NanoDrop核酸蛋白測定儀nd 1000測定核算濃度及純度，剩余RNA置于-80 ℃保存用于后續(xù)實驗。之后在冰上操作去除RNA中的DNA，接著進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃孵育15 min，85 ℃加熱5 s，獲得的cDNA模板置于-20 ℃保存，然后以改cDNA為模板進行Real Time PCR相對定量，檢測AIF及HSP70 mRNA的表達水平。

2 結(jié)果

2.1AIFmRNA在各組中的表達AIF mRNA在各組中的擴增曲線顯示，不同組織中AIF基因的起峰時間不同，說明不同組織中該基因的表達存在差異，AIF mRNA在增生性息肉組、胃腺瘤性息肉組和胃癌組較正常對照組表達升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，胃癌組較胃腺瘤性息肉組表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖1、表1)。

注：從左到右依次為胃癌、腺瘤、息肉和正常組。

圖1正常胃黏膜、胃增生性息肉、胃腺瘤性息肉及胃癌組織中AIF擴增曲線

Fig1AIFamplificationcurveinnormalgastricmucosa,gastrichyperplasticpolyp,gastricadenomatouspolypandgastriccancertissues

2.2HSP70mRNA在正常胃黏膜、胃增生性息肉、胃腺瘤性息肉及胃癌組織中的表達HSP70 mRNA在各組中的擴增曲線顯示，不同組織中HSP70基因的起峰時間不同，說明不同組織中該基因的表達存在差異，HSP70 mRNA在增生性息肉組、胃腺瘤性息肉組和胃癌組較正常對照組表達升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，胃癌組較胃腺瘤性息肉組表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05、見圖2、表1)。

注：從左到右依次為胃癌、腺瘤、息肉和正常組。

圖2正常胃黏膜、胃增生性息肉、胃腺瘤性息肉及胃癌組織中HSP70擴增曲線

Fig2HSP70amplificationcurveinnormalgastricmucosa,gastrichyperplasticpolyp,gastricadenomatouspolypandgastriccancer

組別AIFmRNAHSP70mRNA正常黏膜組0.011±0.0020.045±0.007胃增生性息肉組0.043±0.0110.088±0.012胃腺瘤性息肉組0.074±0.0130.229±0.028胃癌組0.142±0.0400.280±0.068

2.3AIF與HSP70mRNA在胃腺瘤及胃癌組織中表達的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析檢驗胃腺瘤及胃癌組織中AIF與HSP70的相關(guān)性。在胃腺瘤性息肉組中，AIF mRNA與HSP70 mRNA的表達呈正相關(guān)(r=0.672，P<0.01)；在胃癌組中，AIF mRNA與HSP70 mRNA的表達呈正相關(guān)(r=0.741，P<0.01，見圖3)。

圖3AIF與HSP70mRNA在各組表達的相關(guān)性

Fig3CorrelationbetweentheexpressionsofAIFmRNAandHSP70mRNAineachgroup

3 討論

胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，我國是胃癌的高發(fā)地區(qū)之一。在我國，胃癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第2位，死亡率占惡性腫瘤第3位[6]，嚴(yán)重影響著我國公民的生活質(zhì)量和生命安全。雖然胃癌的診斷、治療技術(shù)在不斷進步，但據(jù)近20年的調(diào)查顯示，目前我國的胃癌發(fā)病率和死亡率仍在逐年上升[7]，且有發(fā)病低齡化趨勢。由于胃癌早期缺乏典型癥狀，臨床上發(fā)現(xiàn)多為中晚期，故手術(shù)、放療、化療質(zhì)量效率較低，治療效果差，患者痛苦大。因此，尋找到一種能在早期診斷胃癌的方法尤為重要。胃息肉為胃黏膜層凸向胃腔的隆起，目前研究表明，胃增生性息肉及胃腺瘤性息肉均有癌變傾向[8-9]，屬于胃癌的癌前病變，故探討胃息肉癌變的機制，對早期胃癌的診斷和治療有重要意義。胃癌的發(fā)生為細胞增殖與分化異常及細胞凋亡過程出現(xiàn)異常所致。所謂凋亡，是由基因控制下的細胞程序性主動死亡的過程，在正常情況下，細胞增殖和凋亡保持一個動態(tài)平衡，一旦平衡被打破，便有可能導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。人類細胞凋亡大部分由Caspase(半胱天冬酶)家族酶介導(dǎo)和執(zhí)行，包括外源性和內(nèi)源性兩條途徑[10]。AIF是一種不依賴于Caspase途徑介導(dǎo)的凋亡的凋亡效應(yīng)分子。在正常生理狀態(tài)下，AIF是一種氧化還原酶，僅位于線粒體膜間隙；當(dāng)細胞受到凋亡信號的刺激后，AIF便從線粒體釋放到細胞漿中，在胞漿中接受凋亡信號刺激后，再通過復(fù)雜的定位過程移動到細胞核中，直接引起染色體的凝集和DNA呈大片段(50 kb)斷裂，導(dǎo)致細胞凋亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，AIF mRNA在各組織中表達呈逐漸上升的趨勢，增生性息肉組、胃腺瘤性息肉組和胃癌組較正常對照組表達升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，胃癌組較胃腺瘤性息肉組表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這與Lee等[11]對60例胃腺癌患者的組織和趙悅等[12]對胃癌組織和相對應(yīng)的癌旁正常組織AIF mRNA表達水平檢測的結(jié)果相吻合。

HSP70是分子量在70 kD左右的一類熱休克蛋白，是廣泛存在于各種人體組織的高度保守的胞質(zhì)蛋白質(zhì),它與腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫識別和凋亡有密切聯(lián)系。在熱休克蛋白家族中，HSP70最為保守，但也是最為重要的一族,在細胞應(yīng)激后反應(yīng)也最為激烈,故其對細胞結(jié)構(gòu)的維持和細胞對應(yīng)激的耐受起到非常重要的作用。作為分子伴侶，HSP70優(yōu)先表達于腫瘤細胞中，通過與其客戶蛋白(client proteins)相互作用，在細胞信號傳導(dǎo)、周期調(diào)控、分化及凋亡過程中發(fā)揮重要作用，從而保護腫瘤細胞，使其避免大范圍的凋亡；HSP70還可與原癌基因和抑癌基因相互作用調(diào)節(jié)細胞周期，同時與上述基因的蛋白產(chǎn)物互相調(diào)節(jié)，使惡性腫瘤呈持續(xù)增殖狀態(tài)，有研究[13]發(fā)現(xiàn)，選擇性地去除HSP70的惡性腫瘤細胞增殖明顯變慢；HSP70的過表達會干擾腫瘤細胞中磷脂酶A2的信號轉(zhuǎn)運過程，使其細胞毒性大大下降，從而減少腫瘤壞死因子對特定腫瘤細胞的殺傷作用，使腫瘤細胞避免被免疫系統(tǒng)清除；HSP70參與抗原提呈過程，可控制細胞呈遞抗原，將抗原分解成特異性肽段并提供與之結(jié)合的蛋白協(xié)同參與抗原加工、轉(zhuǎn)運及免疫球蛋白裝配，在人體多種不同腫瘤組織和細胞中的表達均明顯升高，在乳腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和膀胱癌細胞中呈過度表達，使抗腫瘤治療效果欠佳[14]，選擇性下調(diào)腫瘤細胞中的HSP70可抑制腫瘤細胞快速增殖，甚至是誘導(dǎo)凋亡，提示HSP70可能作為一種重要的基因控制著腫瘤細胞的增殖和凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)，HSP70 mRNA在正常生性息肉組、胃腺瘤性息肉組和胃癌組較正常對照組表達升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，胃癌組較胃腺瘤性息肉組表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這與劉重元[15]和左東升等[16]的研究基本一致。

研究[17]表明，HSP70可與AIF分子結(jié)合抑制非Caspases依賴凋亡通路，通過抑制凋亡小體的形成參與調(diào)控凋亡通路。由于AIF介導(dǎo)的凋亡不依賴Caspase途徑，故其促凋亡活性不受Caspase抑制劑的抑制，也不受Bcl-2過表達的影響，但是在AIF與Caspases通路間也存在多個水平的交叉，活化的Caspase-2,8,以及t-Bid(被Caspase激后)等都可觸發(fā)線粒體釋放AIF分子[18]。而HSP70是AIF途徑與Caspase途徑之間的另一個重要的交會點[19]。HSP70 Caspase活化通路的抑制劑之一，但其通過Apaf-1發(fā)揮作用，因為AIF與Apaf-1競爭性結(jié)合HSP70，故理論上，AIF與HSP70結(jié)合有可能間接地解除對Caspase級聯(lián)激活的抑制，所以Caspase依賴的細胞凋亡和依賴AIF的細胞凋亡過程中既各自獨立又互相依賴，刺激信號的不同，決定它們對細胞凋亡的貢獻，同樣，細胞類型的不同，也決定細胞凋亡的途徑。AIF對細胞凋亡起促進作用，但對腫瘤細胞的凋亡有選擇性，其機制可能是部分腫瘤細胞有抵抗AIF凋亡的作用，另一個可能性就是AIF在細胞中發(fā)揮消除自由基和清除過氧化毒性的作用，使細胞避免過氧化而得以繼續(xù)存活。本研究顯示，在胃腺瘤性息肉組中，AIF與HSP70 mRNA的表達呈正相關(guān)，在胃癌組中，AIF與HSP70 mRNA的表達呈正相關(guān)，提示AIF及HSP70基因可能與胃癌形成有關(guān)，HSP70可能對AIF有協(xié)同作用。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Expressions of apoptosis inducing factor and Heat-shock protein70in gastric polyps and gastric cancer and their correlation with gastric cancer

CHEN Ji, CUI Hong, DUAN Yu, GAO Meili, NIU Haoshu

Department of Gastroenterology, the Third Hospital of Inner Mongolia Medical University (Baogang Hospital), Baotou 014010, China

ObjectiveTo explore the effects of AIF and HSP70 in the occurrence and development of gastric cancer by detecting their mRNA levels in gastric polyps and gastric cancer， and provide a new way and insight for the early diagnosis and treatment of gastric cancer.MethodsGastric biopsy samples of 120 patients in the Third Hospital of Inner Mongolia Medical University were collected. According to their pathological characteristics, the samples were divided into four groups as followed: normal gastric mucosa group (n=30), gastric hyperplastic polyps group (n=30), polypoidabenoma group (n=30) and gastric cancer group (n=30). The expressions of AIF and HSP70 mRNA were detected by real-time PCR.ResultsThe expressions of AIF and HSP70 mRNA were gradually increased in gastric hyperplastic polyps, gastril adenomatous polyp and gastric cancer, the difference was significant (P<0.05). In the tissues of adenomatous polyp and gastric cancer, the expression of AIF mRNA was positively correlated with HSP70 mRNA (P<0.01).ConclusionAIF and HSP70 are correlated with the development of gastric cancer. AIF and HSP70 may act synergistically in the development of gastric cancer. Both of them can be used as markers for the diagnosis of gastric cancer.

AIF; HSP70; Gastric polyps; Gastric cancer

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.09.008

R573；R735.2

：A

：1006-5709(2017)09-0990-04

：2016-12-26

陳吉，主任醫(yī)師，博士，研究方向：消化系統(tǒng)疾病診治。E-mail: chenji2847@163.com

崔宏，主任醫(yī)師，研究方向：消化系統(tǒng)疾病診治。E-mail: 736650182@qq.com