劉智化，趙曉曉，楊 明，唐 亮

宣城市人民醫(yī)院普外科，安徽 宣城 242000

SiRNA干擾LOX基因對胃癌BGC-823細胞增殖、遷移和侵襲的影響

劉智化，趙曉曉，楊 明，唐 亮

宣城市人民醫(yī)院普外科，安徽 宣城 242000

目的探討siRNA靶向干擾賴氨酰氧化酶(LOX)基因對胃癌BGC-823細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。方法采用脂質體轉染法建立LOX-siRNA的BGC-823細胞株和陰性對照BGC-823細胞株。應用RT-PCR法檢測胃癌細胞轉染前后LOX mRNA水平，應用Western blotting法檢測胃癌細胞轉染前后的LOX蛋白表達水平。MTS法檢測BGC-823細胞的增殖情況；Transwell遷移和侵襲實驗檢測干擾LOX基因對BGC-823細胞遷移及侵襲能力的影響。結果與NC-siRNA組及空白組比較，LOX-siRNA轉染組LOX mRNA和蛋白表達明顯下降(P<0.05)，細胞增殖、遷移、侵襲能力明顯下降(P<0.05)。結論LOX基因對胃癌BGC-823細胞增殖、侵襲及遷移有一定的促進作用。

BGC-823細胞；LOX；增殖；遷移；侵襲

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居全球第二，尤其在我國，其發(fā)病率和死亡率是僅次于肺癌的常見腫瘤之一[1]。臨床上，手術切除是早期癌癥首選的治療方法，并能治愈。但是，大量的胃癌患者確診時即進入了中晚期，失去了手術治療的最佳時期[2]。對于這些患者，全身化療是主要的治療選擇，但由于化療藥物的嚴重不良反應，患者的生存質量未得到明顯改善，且生存率仍然很低。因此，尋找新的治療靶點對胃癌治療具有十分重要的意義。研究[3-5]發(fā)現，賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。本研究通過采用siRNA干擾技術下調BGC-823中LOX的表達，并觀察其對胃癌細胞體外增殖、遷移和侵襲能力的影響，旨在探討LOX能否為臨床治療的靶點提供新的理論依據及成為胃癌早期診斷的標志物。

1 材料與方法

1.1材料人胃癌細胞系BGC-823由安徽醫(yī)科大學藥學院實驗室贈予。LipofectamineTM2000 Transfection Reagent、OPTI-MEM、Trizol 試劑均購自Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自Thermo公司；GoTaq?qPCR Master Mix購自Promega公司；RIPA 裂解液(強)、PMSF(100 mmol/L)、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所；LOX抗體購自英國Abcam公司；鼠抗兔二抗購自北京中杉金橋公司；ECL發(fā)光試劑盒購自Pierce公司；Cell Titer 96 ?AQueous單溶液細胞增殖檢測試劑盒 (MTS)購自普洛麥格北京生物技術有限公司；Transwell小室購自Corning Costar公司(美國)；Matrigel基質膠購自BD公司。

1.2LOXsiRNA的構建LOX基因的ID: 4015(由Pubmed數據庫獲得)，針對該基因的3種不同siRNA由上海吉瑪生物制藥有限公司合成純化。合成純化的siRNA-LOX序列分別為：(1)正義鏈：5′-GCACAAGAU-AUUCCUGGGATT-3′，反義鏈：3′-UCCCAGGAAUAUCUUGGUCTT-5′；(2)正義鏈：5′-GAAACUAUAUCCUAA-AGGUTT-3′，反義鏈:3′-ACCUUUAGGAUAUAGUUUC-TT-5′;(3)正義鏈：5′-UCGGCACAAUUUCACCGUATT-3′,反義鏈:3′-UACGGUGAAAUUGUGCAGCTT-5′。

1.3細胞培養(yǎng)與轉染BGC-823細胞復蘇后加入DMEM高糖培養(yǎng)基(含100 g/L胎牛血清，20 U/ml的青霉素和鏈霉素)，置條件培養(yǎng)箱培養(yǎng)(溫度37 ℃，體積分數為5%的CO2)。轉染前1 d，細胞濃度為(4～5)×104個/孔接種于24孔板上，使用0.5 ml含100 g/L胎牛血清及20 U/ml青霉素和鏈霉素的Opti-MEM，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞密度應能在24 h內使細胞匯合70%～90%。按LipofectamineTM2000 Reagent說明書進行轉染。轉染后6～8 h更換含血清的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.4Real-timePCR檢測將實驗分為3組，實驗組(LOX-siRNA轉染組)、陰性對照組(NC-siRNA轉染組)及空白組。各組同時檢測目的基因和管家基因(GAPDH)的Ct值。分別提取各組轉染后24 h細胞總RNA，根據試劑盒將總RNA進行反轉錄成cDNA，通過RT-PCR擴增目的基因。采用2-△△Ct法分析目的基因mRNA的相對表達水平。引物序列為：GAPDH: 5′-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3′(forward)，5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3′(reverse)；LOX基因引物序列為：5′-ACGACAACCCTTATTACAAC-3(forward)，5′-GTTACATGGAACATCTTCTGC-3′(reverse)。實驗重復3次。

1.5Westernblotting檢測實驗分組同上，轉染24 h后，提取各組蛋白，通過BCA試劑盒測定蛋白濃度。取各組等量的總蛋白進行10% SDS-PAGE電泳，用濕轉法轉膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，PBST洗3次，每次15 min，加入一抗孵育過夜，洗膜同上，二抗孵育后同法洗膜，顯影，實驗重復3次。所加一抗分別為：LOX(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)。將所得結果分別進行分析。

1.6MTS法檢測細胞增殖抑制情況實驗分組同上，轉染24 h后，收取各組細胞，采用無血清培養(yǎng)基傳代于96孔板中培養(yǎng)，細胞密度以貼壁后細胞匯合50%～60%為宜，培養(yǎng)過夜，每組設6個復孔。處理12、24、48 h后，相應時間加入MTS/PMS的混合物20 μl，30 min后，490 nm波長下測定各孔吸光度值(optical density，OD)。采用Graphpad prism軟件進行分析。實驗重復3次。

1.7細胞遷移實驗實驗分組同上，分別收取各組轉染24 h后的LOX-siRNA細胞、NC-siRNA細胞及空白組BGC-823細胞，采用DMEM重懸。下室加入500 ml含200 g/L胎牛血清的DMEM，置于37 ℃，體積分數為5%的CO2箱孵育30 min后取出備用。上室加入100 ml細胞懸液(3×105ml-1)。8 h后取出小室，用濕棉簽輕柔的擦去上室未穿膜細胞，甲醇固定20 min，過濾的結晶紫染色液染色10 min，用清水沖洗染色后的小室，風干，于倒置顯微鏡隨機選取5個視野(100×)，計穿膜細胞數，并取其平均值用來表示腫瘤細胞遷移能力。實驗重復3次。

1.8細胞侵襲實驗實驗分組同上。實驗前將槍頭、24孔板置于4 ℃冰箱預冷、DMEM培養(yǎng)基、Transwell小室，-20 ℃保存的Matrigel于4 ℃冰箱過夜融化，用DMEM培養(yǎng)基按1∶8比例稀釋，取50 μl平鋪于Transwell板上室37 ℃，30 min備用。具體方法同遷移實驗。實驗重復3次。

2 結果

2.1轉染siRNA后BGC-823細胞中LOXmRNA水平和蛋白水平的變化正義鏈：5′-GCACAAGAUAUUCCUGGGATT-3′，反義鏈：3′-UCCCAGGAAUAUCUUGGUCTT-5′的轉染效率最佳。LOX-siRNA轉染組較NC-siRNA組及空白組BGC-823細胞中LOX mRNA水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖1)。轉染24 h后，提取各組細胞的蛋白進行Western blotting檢測，與NC-siRNA組及空白組比較，LOX-siRNA轉染組細胞中LOX蛋白水平下降(見圖2)。

注：與LOX-siRNA組比較，*P<0.05。

圖1轉染后各組胃癌BGC-823中LOXmRNA的表達

Fig1ExpressionofLOXmRNAingastriccancerBGC-823aftertransfection

圖2轉染后各組胃癌BGC-823中LOX蛋白的表達

Fig2ExpressionofLOXproteiningastriccancerBGC-823aftertransfection

2.2轉染后BGC-823細胞增殖能力的變化細胞培養(yǎng)12 h后，各組間細胞增殖能力無明顯差異。LOX-siRNA轉染組24 h后，與NC-siRNA組比較，OD值明顯降低，且48 h后差異更明顯，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，NC-siRNA轉染組與空白組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖3)。

2.3轉染后BGC-823細胞遷移能力的變化轉染成功后，LOX-siRNA轉染組細胞遷移數較NC-siRNA組和空白組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而NC-siRNA轉染組與空白組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖4)。

2.4轉染后BGC-823細胞侵襲能力的變化轉染成功后進行侵襲實驗，LOX-siRNA轉染組穿過Transwell小室基底膜的細胞數較NC-siRNA轉染組和空白組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，NC-siRNA轉染組與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖4)。

注：與NC-siRNA組比較，*P<0.05。

圖3轉染后各組胃癌BGC-823中細胞增殖的情況

Fig3CellproliferationingastriccancerBGC-823aftertransfection

圖4轉染后各組胃癌BGC-823中遷移及侵襲能力的表達A： 電鏡圖(100×)； B：條形圖

Fig4ExpressionofmigrationandinvasionongastriccancerBGC-823ineachgroupaftertransfectionA：electron microscope(100×)； B: bar chart

3 討論

腫瘤細胞異常增殖是胃癌的主要發(fā)生機制之一，轉移和侵襲是胃癌患者死亡的主要原因，也是臨床手術治療失敗的關鍵。腫瘤的侵襲及轉移是一個多步驟、復雜的過程，腫瘤細胞可破壞由細胞間基質和基底膜組成的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)。ECM主要由間質膠原蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白、纖維粘連蛋白、蛋白多糖等組成。ECM在腫瘤細胞生長的微環(huán)境中處于不斷代謝更新、降解重塑的動態(tài)平衡中，可維持腫瘤細胞的生長，并可調節(jié)腫瘤細胞的基因表達，從而影響腫瘤的代謝、生長及轉移。

腫瘤轉移、侵襲與ECM的動態(tài)平衡失調密切相關[6-7]，因此ECM的降解和重建對細胞遷移、侵襲過程至關重要。維系這種動態(tài)平衡的關鍵酶包括金屬蛋白水解酶(matrix metalloproteinases，MMP)和LOX。在以往的研究中已經證實，MMP能夠水解ECM，涉及較多的是MMP-2和MMP-9[8]，為腫瘤的轉移和侵襲掃清前進的障礙。另外，也有研究[9-10]表明，LOX在ECM的重塑與合成中發(fā)揮重要作用，與腫瘤轉移、侵襲密切相關。

LOX是一種銅依賴性單胺氧化酶，在Cu2+協助下參與催化ECM中膠原蛋白與彈性蛋白發(fā)生共價交聯，從而維持ECM的穩(wěn)定性。另外，最新研究[11-12]發(fā)現，LOX的異常表達與腫瘤發(fā)生發(fā)展、惡性轉化和侵襲性等密切相關，在乳腺癌、大腸癌及胃癌等惡性腫瘤中，LOX家族蛋白表達增加，并促進腫瘤轉移[13-14]。Baker等[15]證實了LOX的活性抑制劑能夠有效地抑制大腸癌的轉移。楊華偉等[16]構建LOX基因的特異性慢病毒干擾載體(LOX-RNAi-LV),穩(wěn)定轉染至乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞后，可有效干擾細胞中LOX mRNA和蛋白的表達，進而抑制腫瘤細胞的侵襲、轉移。因此，以LOX蛋白為靶點，研究其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用對腫瘤的治療可能是一個新的領域和方向。

本研究通過siRNA干擾技術，下調BGC-823細胞中LOX表達，觀察LOX水平降低對BGC-823細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響。轉染培養(yǎng)24 h后采用RT-PCR檢測轉染效率，結果顯示，LOX mRNA及蛋白表達明顯下降，BGC-823細胞增殖、遷移、侵襲能力均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義。表明抑制LOX表達可明顯降低BGC-823細胞的增殖、遷移及侵襲能力。以上研究結果表明，LOX的抑制可能為臨床上治療胃癌提供新思路及靶點。

綜上所述，LOX在胃癌發(fā)生、發(fā)展的過程中可能通過表達量增加來促進胃癌的增殖、轉移及侵襲。若抑制LOX的表達，在胃癌發(fā)展、轉移和侵襲的防治上可能成為重要途徑之一，檢測LOX有望在預測胃癌的病程進展和轉移潛能及預后評估等方面存在潛在價值，成為胃癌發(fā)生和轉移的標志物。

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(責任編輯：馬 軍)

Effect of siRNA interfering LOX gene on proliferation, migration and invasion of gastric cancer cell line BGC-823

LIU Zhihua, ZHAO Xiaoxiao, YANG Ming, TANG Liang

Department of General Surgery, People’s Hospital of Xuancheng, Xuancheng 242000, China

ObjectiveTo investigate the effect of siRNA interfering LOX gene on proliferation, migration and invasion of gastric cancer cell line BGC-823.MethodsBGC-823 cells line of LOX-siRNA group and negative control group were constructed by liposome transfection. LOX mRNA levels of gastric cancer cells before and after transfection were detected by RT-PCR assay. Western blotting was used to detect the expression of LOX protein of gastric cancer cells before and after transfection, and the proliferation of BGC-823 cells was detected by MTS. Transwell migration and invasion test was used to detect the interference of LOX gene on the migration and invasion ability of BGC-823 cells.ResultsCompared with negative control group and blank control group, expression of LOX mRNA and protein were decreased significantly in LOX siRNA transfection group (P<0.05), and cell proliferation, migration and invasion were significantly inhibited (P<0.05).ConclusionLOX gene can effectively promote the proliferation, migration and invasion of gastric cancer BGC-823 cell.

BGC-823 cell; LOX; Proliferation; Migration; Invasion

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.09.005

R735.2

：A

：1006-5709(2017)09-0977-04

：2016-07-12

劉智化，碩士研究生，研究方向：胃腸病。E-mail: 414425392@qq.com

唐亮，本科，普外科主任，研究方向：胃腸病