邢 苑，韓鈞凌，俞力軍，陳和萍，張 宏

中國人民解放軍第一八七醫(yī)院消化內(nèi)科，海南 ?？?571159

論著·胃癌

DEK基因在胃癌中的表達(dá)及調(diào)控Notch1信號通路對胃癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響

邢 苑，韓鈞凌，俞力軍，陳和萍，張 宏

中國人民解放軍第一八七醫(yī)院消化內(nèi)科，海南 ?？?571159

目的探討DEK基因的表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響及機(jī)制。方法RT-PCR檢測胃癌細(xì)胞中DEK mRNA的表達(dá)；DEK-siRNA、NC-siRNA轉(zhuǎn)染人胃癌BGC-823細(xì)胞，不作任何處理的細(xì)胞作為對照組，轉(zhuǎn)染48 h后，Western blotting檢測DEK、MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)；CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況；Transwell小室檢測細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果DEK基因在人胃癌MNK-28、SGC-7901、BGC-823細(xì)胞中的mRNA表達(dá)均顯著高于GES-1細(xì)胞(P<0.01)，DEK基因在胃癌BGC-823細(xì)胞的mRNA表達(dá)最高，選擇作為后續(xù)研究對象；DEK-siRNA轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞后DEK的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與對照組及NC-siRNA組比較，DEK-siRNA組細(xì)胞存活率、細(xì)胞侵襲數(shù)及MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01)。結(jié)論RNA干擾(RNAi)抑制胃癌細(xì)胞中DEK基因的表達(dá)后可抑制細(xì)胞的增殖及侵襲能力，其機(jī)制與Notch1信號通路的調(diào)控有關(guān)。

胃癌；DEK基因；增殖；侵襲；Notch1信號通路

胃癌是常見的消化道腫瘤之一，尤其是晚期胃癌，治療非常棘手，尋求有效的治療方法是解決目前問題的關(guān)鍵[1]。腫瘤基因是目前的研究熱點(diǎn)。人類DEK蛋白在急性粒細(xì)胞白血病亞型中作為一種融合蛋白，在一些蛋白及多細(xì)胞生物中普遍存在[2]。有研究[3-5]指出，DEK是一種原癌基因，在多種惡性腫瘤中有高表達(dá)，如肺癌、膀胱癌、黑色素瘤等。腫瘤的發(fā)生與基因的表達(dá)密切相關(guān)，可能作為治療腫瘤的生物新靶點(diǎn)。但關(guān)于DEK基因?qū)ξ赴┑挠绊懷芯可胁磺宄NA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA介導(dǎo)的能使基因在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生沉默，具有高度的有效性、特異性，對基因功能研究、基因治療等是很好的途徑[6]。本研究中通過RNAi技術(shù)沉默胃癌細(xì)胞中DEK基因的表達(dá)，研究抑制其表達(dá)后細(xì)胞的增殖及侵襲情況，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，以期為該病的分子診斷及靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料和試劑人胃癌MNK-28、SGC-7901、BGC-823細(xì)胞及胃黏膜正常細(xì)胞GES-1均購自中科院上海細(xì)胞庫；胰蛋白酶、RPMI 1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物制品公司；siRNA購自美國Santa Cruz公司；RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara；BCA試劑盒、CCK8試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；Transwell小室購自美國Millipore公司；DEK、MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1抗體購自美國Abcam公司；倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS；電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀均購自Bio-Rad公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國SIM公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染GES-1細(xì)胞及MNK-28、SGC-7901、BGC-823細(xì)胞在含有100 g/L胎牛血清RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液(100 mg/L青霉素及100 mg/L鏈霉素)中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、95%飽和濕度的恒溫孵育箱中傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h將生長至對數(shù)期的BGC-823細(xì)胞以1×106個/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，生長密度為70%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。BGC-823細(xì)胞分為DEK siRNA組(細(xì)胞中轉(zhuǎn)染干擾DEK 表達(dá)的siRNA)、NC-siRNA組(細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不具有任何干擾作用的siRNA)、對照組(不作任何處理)。整個轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照美國Invitrogen公司LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明進(jìn)行操作。

1.3RT-PCR檢測胃癌細(xì)胞株中DEK基因的表達(dá)按照Trizol說明書的說明提取MNK-28、SGC-7901、BGC-823細(xì)胞及GES-1細(xì)胞中的總RNA，紫外分光光度計進(jìn)行定量，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用Primer premier 6.0軟件設(shè)計引物。所有引物由上海生工合成。DEK引物序列：上游引物：5′-TGTTAAGAAAGCAGATAGCAGCACC-3′，下游引物：5′-ATTAAAGGTTCATCATCTGAACTATCCTC-3′。GAPDH引物序列：上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s；58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。最后72 ℃延伸15 min，4 ℃保存。每個樣品設(shè)置6個重復(fù)，利用2-△△Ct法計算DEK mRNA相對表達(dá)量。2-△△Ct為基因相對表達(dá)，△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。

1.4DEK-siRNA轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞后干擾DEK表達(dá)效果檢測對照組、NC-siRNA組和DEK-siRNA組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，加入細(xì)胞裂解液置于冰上反應(yīng)30 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度。按照總蛋白30 μg的量在上樣緩沖Buffer中煮沸變性10 min，于120 g/L的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)DEK蛋白和GAPDH蛋白至PVDF膜上，在含50 g/L的脫脂奶粉的TBST溶液中室溫封底90 min，以1∶500稀釋的DEK抗體和1∶1 000稀釋的內(nèi)參GAPDH作為一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，隨后加入二抗反應(yīng)90 min，37 ℃孵育1 h。TBST清洗后化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑(ECL)顯色，顯影，定影。以GAPDH作為內(nèi)參，分析DEK的蛋白表達(dá)水平。

1.5細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CCK8法) 取轉(zhuǎn)染后的上述三組細(xì)胞，以濃度為1×104ml-1接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，每孔加入10 μl的CCK8試劑，37 ℃孵育4 h。酶標(biāo)儀測定570 nm波長處各組的吸光度A。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率(%)=(轉(zhuǎn)染組細(xì)胞A/對照組細(xì)胞A)×100%。

1.6細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)上述三組細(xì)胞，每組設(shè)置6個侵襲小室個體，基質(zhì)膠(Matrigel膠)4 ℃中處理24 h，使基質(zhì)膠變?yōu)橐簯B(tài)，預(yù)冷的無血清RPMI 1640將Matrigel膠稀釋成1∶8比例，取35 μl鋪在小室內(nèi)，常溫放置1～15 min風(fēng)干。取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的上述三組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105ml-1，上室中加入200 μl的細(xì)胞懸液，下室中加入600 μl的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基(含有100 g/L的胎牛血清)，于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后取出小室，PBS洗滌小室膜2～3次，50 g/L的戊二醛固定20 min，1 g/L的結(jié)晶紫200 μl浸染30 min，PBS洗滌2次，用棉簽輕輕擦掉上層的細(xì)胞，置于室溫直至風(fēng)干。顯微鏡下隨機(jī)取6個不同的視野觀察并記錄穿膜的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計算侵襲細(xì)胞的平均數(shù)。

1.7MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)檢測收集轉(zhuǎn)染48 h的上述細(xì)胞，提取細(xì)胞中的蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。根據(jù)1.4方法檢測MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1胃癌細(xì)胞中DEKmRNA的表達(dá)DEK基因在人胃癌MNK-28、SGC-7901、BGC-823細(xì)胞中的mRNA表達(dá)均顯著高于GES-1細(xì)胞(P<0.01)。DEK基因在胃癌BGC-823細(xì)胞的mRNA表達(dá)最高，選擇作為后續(xù)研究對象(見圖1)。

注：與GES-1細(xì)胞比較，**P<0.01。

2.2DEK-siRNA轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞降低DEK的蛋白表達(dá)與對照組比較，NC-siRNA組DEK的蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，DEK-siRNA組DEK蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01，見圖2)。

2.3轉(zhuǎn)染DEK-siRNA降低BGC-823細(xì)胞增殖與對照組及NC-siRNA組比較，DEK-siRNA組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01，見圖3)。

2.4轉(zhuǎn)染DEK-siRNA降低BGC-823細(xì)胞侵襲能力與對照組及NC-siRNA組比較，DEK-siRNA組細(xì)胞侵襲數(shù)顯著減少(P<0.01)。進(jìn)一步檢測侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，DEK-siRNA組MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)均顯著低于對照組及NC-siRNA組(P<0.01，見圖4)。

2.5轉(zhuǎn)染DEK-siRNA對Notch1、Hes1蛋白表達(dá)的影響與對照組及NC-siRNA組比較，DEK-siRNA組Notch1、Hes1的蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.01，見圖5)。

注：與對照組比較，**P<0.01。 注：與對照組比較，**P<0.01。

圖2DEK-siRNA轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞對DEK蛋白表達(dá)的影響A：轉(zhuǎn)染DEK-siRNA后的BGC-823細(xì)胞中DEK蛋白表達(dá)；B：DEK蛋白的相對表達(dá)量;圖3轉(zhuǎn)染DEK-siRNA對BGC-823細(xì)胞增殖的影響

Fig2EffectofDEK-siRNAtransfectedBGC-823cellsontheexpressionofDEKproteinA: expression of DEK protein in BGC-823 cells transfected with DEK-siRNA detected by Western blotting; B: relative expression of DEK protein;Fig3EffectoftransfectionofDEK-siRNAonproliferationofBGC-823cells

注：與對照組比較，**P<0.01。

圖4轉(zhuǎn)染DEK-siRNA對BGC-823細(xì)胞侵襲能力的影響A：轉(zhuǎn)染DEK-siRNA后細(xì)胞的侵襲能力；B：MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)；C：MMP-2、MMP-9蛋白的相對表達(dá)量

Fig4EffectoftransfectionofDEK-siRNAoninvasionofBGC-823cellsA: cells invasion after transfection of DEK-siRNA; B: expressions of MMP-2, MMP-9 protein; C: relative expressions of MMP-2, MMP-9 protein

注：與對照組比較，**P<0.01。

圖5轉(zhuǎn)染DEK-siRNA對Notch1、Hes1蛋白表達(dá)的影響A：Notch1、Hes1蛋白表達(dá)；B：Notch1、Hes1蛋白的相對表達(dá)量

Fig5EffectsoftransfectionofDEK-siRNAontheexpressionsofNotch1andHes1proteinA: expressions of Notch1 and Hes1; B: relative expressions of Notch1 and Hes1

3 討論

胃癌的發(fā)生、發(fā)展與抑癌基因失活、原癌基因激活、凋亡、相關(guān)基因異常表達(dá)等有緊密關(guān)系，了解引起胃癌發(fā)生的原因具有重要意義。DEK蛋白是一種原癌蛋白，是一個高度保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，由375個氨基酸組成，目前發(fā)現(xiàn)DEK蛋白有2個功能性的DNA結(jié)合域。通過參與干擾DNA修復(fù)、細(xì)胞分裂、抑制細(xì)胞的凋亡、分化、衰老而發(fā)揮生物學(xué)作用，也可通過影響p53、ki67等基因的表達(dá)影響多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[7-8]。研究[9]顯示，在宮頸癌、肺癌等腫瘤中DEK的表達(dá)異常升高，宮頸癌細(xì)胞中通過靶向沉默DEK的表達(dá)后可顯著降低細(xì)胞的增殖能力，阻滯細(xì)胞于G0/G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；肺癌細(xì)胞中抑制DEK的表達(dá)可降低細(xì)胞的增殖及侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[10]。胃癌中DEK的表達(dá)高于正常胃黏膜，其表達(dá)與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度有關(guān)[11]。DEK表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響及機(jī)制研究尚不明確。

本研究通過RNAi技術(shù)沉默胃癌細(xì)胞中DEK的表達(dá)，檢測抑制其表達(dá)后細(xì)胞的增殖及侵襲能力，結(jié)果顯示，細(xì)胞的增殖及侵襲能力均顯著降低。腫瘤的侵襲是一個多步驟、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過程，受到多種因素的影響，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)家族成員對細(xì)胞的侵襲和遷移能力有重要影響。MMPs幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白，破壞細(xì)胞侵襲過程中的組織學(xué)屏障，從而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移能力[12]。MMP-2和MMP-9是該家族兩個重要的成員，參與降解基底膜、血管形成等[13]。研究[14-15]顯示，在胃癌、腦膠質(zhì)瘤等腫瘤中可通過下調(diào)MMP-2和MMP-9表達(dá)降低癌細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果顯示，MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。

Notch1是Notch基因家族中的一員，廣泛存在于從果蠅到哺乳動物等多種生命體中，是在進(jìn)化上高度保守的信號傳導(dǎo)途徑，參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等過程[16]。近年來，Notch1信號通路與腫瘤的關(guān)系受到廣泛關(guān)注。研究[17-18]顯示，在宮頸癌、胃癌等多種腫瘤中均出現(xiàn)Notch1信號通路的異常表達(dá)，影響腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。因此，該信號通路可作為治療腫瘤的新靶點(diǎn)。也有研究[19]指出，抑制腫瘤中Notch1信號通路可降低腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Hes1是Notch1信號通路最重要的靶基因，其表達(dá)是Notch1信號通路是否激活的重要標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示，Notch1和Hes1蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。

綜上所述，RNA抑制胃癌細(xì)胞中DEK表達(dá)后可通過調(diào)控Notch1信號通路降低癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力。該研究為胃癌的分子診斷及靶向治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Expression of DEK gene in gastric cancer and the effect of Notch1signaling pathway on proliferation and invasion of gastric cancer cells

XING Yuan, HAN Junling, YU Lijun, CHEN Heping, ZHANG Hong

Department of Gastroenterology, the 187th Hospital of PLA, Haikou 571159, China

ObjectiveTo investigate the effect and its mechanism of DEK gene expression on proliferation and invasion of gastric cancer cells.MethodsExpression of DEK mRNA in gastric cancer cells was detected by RT-PCR; DEK-siRNA, NC-siRNA were transfected into BGC-823 cells, and the cells without any treatment were as the control group, the expressions of DEK, MMP-2, MMP-9, Notch1 and Hes1 protein after transfected for 48 hours were detected by Western blotting. Cell proliferation was detected by CCK8 assay, and cell invasion was detected by Transwell assay.ResultsThe expression of DEK mRNA in human gastric cancer MNK-28, SGC-7901 and BGC-823 cells was significantly higher than that in GES-1 cells (P<0.01); DEK gene was highly expressed in gastric cancer cell line BGC-823, and selected as the following research object. The expression of DEK in BGC-823 cells was decreased significantly after transfection with DEK-siRNA (P<0.01). Compared with the control group and NC-siRNA group, the cell survival rate, cell invasion and expressions of MMP-2, MMP-9, Notch1 and Hes1 protein in DEK-siRNA group were significantly reduced (P<0.01).ConclusionRNA interference (RNAi) can inhibit the expression of DEK gene, proliferation and invasion of gastric cancer cells decrease, the mechanism is related to the regulation of Notch1 signaling pathway.

Gastric cancer; DEK gene; Proliferation; Invasion; Notch1 signaling pathway

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.09.004

R735.2

：A

：1006-5709(2017)09-0973-04

：2017-05-17

邢苑，本科，主治醫(yī)師，研究方向：胃腸病、肝病。E-mail: vipzhangli@sohu.com