趙慶喆，梁 超，莫蓓莘

1)深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060；2)深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東省表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060

【生物工程/Bioengineering】

擬南芥microRNA通路中新因子的篩選和突變體分析

趙慶喆1，梁 超2，莫蓓莘1

1)深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060；2)深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東省表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060

小核糖核酸(micro ribonucleic acid, miRNA)是一類長度為20～24 核苷酸(nucleotide, nt)的非編碼的核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)，在植物生長發(fā)育過程中具有重要作用．為鑒定參與植物miRNA合成、降解和運(yùn)輸?shù)韧返囊蜃樱脭M南芥轉(zhuǎn)基因株系SUC2:amiR-SUL進(jìn)行正向遺傳篩選體系，通過對該株系進(jìn)行甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone, EMS)誘變篩選獲得SUP-E45突變體．對該突變體進(jìn)行表型觀察、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和全基因組測序?qū)嶒?yàn)．結(jié)果顯示，突變的基因?yàn)锳go1(Argonaute1)， 該基因編碼的AGO1蛋白是miRNA通路中至關(guān)重要的蛋白，成熟的miRNA與AGO1蛋白結(jié)合形成miRISC沉默復(fù)合體 (miRNA-induced silencing complex, miRISC)從而對靶基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控．驗(yàn)證了該篩選體系的可行性．通過該篩選體系可篩選出其他參與miRNA合成、影響miRNA 活性或miRNA運(yùn)輸?shù)韧返囊蜃樱瑸楹罄m(xù)擬南芥miRNA通路的研究奠定了基礎(chǔ)．

分子生物學(xué)；轉(zhuǎn)基因株系SUC2:amiR-SUL； 擬南芥；正向遺傳篩選；小核糖核酸；AGO1蛋白；EMS誘變；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；全基因組測序

小核糖核酸(micro ribonucleic acid, miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼、長度約20～24核苷酸(nucleotide, nt)的單鏈小RNA分子，主要參與動(dòng)植物基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[1-2]．植物中miRNA的生物合成過程包括轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后的加工成熟及功能復(fù)合體的裝配3個(gè)步驟．植物miRNA基因首先由非編碼的核基因在RNA聚合酶II(RNA polymerase II，Pol II)的作用下轉(zhuǎn)錄成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的5′帽子和3′多聚腺苷酸尾巴的初級miRNA(primary miRNA，pri-miRNA)，pri-miRNA在DICER-LIKE1(DCL1)、SERRATE(SE)和HYPONASTIC LEAVES1(HYL1)等蛋白組成的dicingbody(D-body)復(fù)合體的作用下剪切形成miRNA前體(precusor miRNA，pre-miRNA)[3-6]．pre-miRNA很不穩(wěn)定，在細(xì)胞核內(nèi)直接由D-body復(fù)合物剪切成雙鏈互補(bǔ)的miRNA和miRNA*的結(jié)構(gòu)．miRNA和miRNA*雙鏈在HUA ENHANCER1(HEN1)作用下其3′端甲基化，并通過HASTY(HST)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核[7-8]．在細(xì)胞質(zhì)中miRNA和miRNA*首先被含有 AGO1和RNA解旋酶的沉默復(fù)合體(RNA induce silencing complex, RISC)募集，其中一條miRNA會成為成熟的miRNA，另一條miRNA*被降解．

成熟的miRNA主要通過兩種機(jī)制對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控．植物miRNA介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制可以是對靶基因的信使RNA(messenger RNA, mRNA)進(jìn)行剪切，比如miR156通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合squamosa promoter binding protein-like (SPL3)的3′UTR，使SPL3的mRNA降解[9]；或者阻遏靶基因mRNA翻譯的，比如miR172的靶基因apetala2(ap2)在翻譯成蛋白質(zhì)的過程中，miR172與AP2蛋白的mRNA結(jié)合抑制其翻譯[10]．miRNA對靶基因抑制的機(jī)制主要取決于植物miRNA與其靶mRNA序列互補(bǔ)的程度．

miRNA在植物細(xì)胞間可以運(yùn)動(dòng)．植物的根主要由中柱、基本組織和表皮組成，基本組織包裹著中柱．文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道，在擬南芥根的基本組織的內(nèi)皮層中轉(zhuǎn)錄生成的成熟miR165/miR166能夠以非細(xì)胞自主性的方式運(yùn)動(dòng)到根的中柱細(xì)胞，形成一個(gè)由內(nèi)皮層朝向中柱活性遞減的梯度，并靶向PHABULOSA (PHB)蛋白的miRNA，從而使PHB蛋白的表達(dá)產(chǎn)物形成了相反的濃度梯度．PHB蛋白在中柱的木質(zhì)部表達(dá)并影響木質(zhì)部的分化．這些生理現(xiàn)象說明miR165/miR166不僅影響了根部木質(zhì)部的形成，還有后生木質(zhì)部和原生木質(zhì)部的分化也有調(diào)控功能．同時(shí)，miRNA還能夠通過運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)植物體內(nèi)礦物質(zhì)的平衡，有報(bào)道稱miR399作為信號分子能夠調(diào)節(jié)根部對于磷離子的攝入[13]．而miR395和miR398則分別調(diào)節(jié)SO42-和Cu2+的吸收[14]，miR172通過運(yùn)動(dòng)參與光周期對馬鈴薯塊莖形成的誘導(dǎo)過程[15]．這些例子都說明miRNA的運(yùn)動(dòng)不僅參與了植物的生長發(fā)育的調(diào)節(jié)，在植物對環(huán)境因子的生理應(yīng)激反應(yīng)也有一定的作用．

近年研究發(fā)現(xiàn)了很多參與miRNA的生物合成、降解、運(yùn)動(dòng)和作用機(jī)制的重要蛋白質(zhì)[16]，本研究旨在確定一種有效的鑒定miRNA途徑中重要基因的方法．首先通過EMS誘變處理SUC2:amiR-SUL植株篩選得到SUP-E45突變體植株，對其進(jìn)行一系列研究，發(fā)現(xiàn)該突變體是由于AGO1蛋白發(fā)生突變所導(dǎo)致的．AGO1蛋白是miRNA沉默復(fù)合體中的效應(yīng)物．雖然本研究篩選到的是已知功能的基因，但該結(jié)果恰好說明采用正向遺傳篩選體系是可行的．通過這種篩選體系將獲得更多的突變體，有助深入研究miRNA通路．

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

Col-0背景下的擬南芥(Arabidopsisthaliana)轉(zhuǎn)基因植株SUC2:amiR-SUL由DetlefWeigel教授惠贈，SUP-E45突變體由本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得．

1.2方 法

1.2.1EMS誘變與篩選

將約10000粒SUC2:amiR-SUL種子用質(zhì)量濃度為3g/L的EMS溶液誘變處理后種植，根據(jù)表型觀察，篩選出可穩(wěn)定遺傳的葉脈處白化消失或者擴(kuò)大的植株．

將確定的候選擬南芥突變體與SUC2:amiR-SUL(母本)進(jìn)行雜交，得到雜交后第1代(F1)種子；F1代植株自交，獲得F2代植株．從F2代的植物中挑選與候選突變體表型相一致的植株作為克隆群體，通常需要50～100棵左右的植株．

1.2.2擬南芥基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)的提取

選取上述F2代植株30d苗60株，采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethyammoniumbromide，CTAB)的方法提取基因組DNA．將提取的基因組脫DNA用RNA酶消化，并用NanoDrop2000c測DNA樣品的濃度，選取D(260)/D(A280)比值在1.8～2.0的基因組DNA樣品50個(gè)，等量混合成100ng/μL濃度的混合基因組樣品，由深圳華大基因研究院進(jìn)行全基因組測序．

1.2.3測序數(shù)據(jù)的分析及驗(yàn)證

運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)和手段，將測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除接頭、組裝和拼接，并與擬南芥背景植株基因組進(jìn)行比對，利用單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)計(jì)算出突變體植株發(fā)生點(diǎn)突變的概率．運(yùn)用dCAPs(derivedcleavedamplifiedpolymorphicsequences)方法設(shè)計(jì)引物并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，從而驗(yàn)證具體的突變位點(diǎn)．

1.2.4植物總RNA的提取

分別提取對照植株和突變體15d大小的小苗約100mg，按照TRIzol(Invitrogen,USA)說明書提取總RNA，提取過程中用到的所有試劑均用超純水配制，所用器具都沒有污染RNA酶．將提取的RNA用DNA酶I(DNaseI) (ThermoScientific) 消化總RNA中的基因組DNA，凍存-80℃?zhèn)溆茫?/p>

1.2.5利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測miRNAs及其靶基因的表達(dá)量

采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara6110A)完成miRNA和RNA的反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄的體系均為20μL．miRNA利用莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄PCR(stem-loopreversedtranscriptPCR,莖環(huán)RT-PCR)的方法反轉(zhuǎn)錄，莖環(huán)RT-PCR所用到的引物見表1．

實(shí)時(shí)熒光定量PCR按照TakaraSYBRpremixextaq(RR820A)試劑說明書操作．反應(yīng)體積10μl，包含5μL的SYBRpremixextaqⅡ(2×)；0.2μL，ROXreferencedye(50×)；2μL，cDNA模板；正向引物，反向引物各0.2μL．PCR反應(yīng)程序：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s；共40個(gè)循環(huán)．miRNA的表達(dá)量以U6為內(nèi)參，靶基因的表達(dá)量以Ubiquitin5為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)用到的引物見表2和表3．

表1 莖環(huán)RT-PCR檢測成熟miRNA的引物序列Table 1 Stem-loop RT-PCR primers for identification of mature miRNAs

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測成熟miRNAs的引物序列

表3 熒光定量PCR檢測成熟miRNAs靶標(biāo)的引物序列

2 結(jié)果分析

2.1EMS篩選獲得SUP-E45突變體及其表型描述

本研究通過EMS誘變獲得了一個(gè)突變體SUP-E45， 與轉(zhuǎn)基因株系SUC2:amiR-SUL相比，SUP-E45突變體葉脈葉斑明顯縮?。送猓琒UP-E45還具有其他明顯的表型：真葉呈鋸齒狀，葉柄較長，葉片呈長橢圓形，側(cè)枝多于SUC2:amiR-SUL的側(cè)枝，果莢呈環(huán)狀生長等多種表型，如圖1(a)、(b)和(c)．此外還發(fā)現(xiàn)，SUP-E45植株一般第4片真葉就出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛，而對照植株SUC2:amiR-SUL卻要到第9片真葉才出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛，如圖1(d)，且SUP-E45植株的莖生葉明顯多于SUC2:amiR-SUL植株的莖生葉，如圖1(e)．

2.3SUP-E45突變體熒光定量PCR的分析

SUP-E45突變體的表型和一些已知的影響miRNA合成的突變體表型相似，利用莖環(huán)RT-PCR的方法分別反轉(zhuǎn)錄了SUP-E45突變體和SUC2:amiR-SUL植株在14d和26d時(shí)amiR-SUL和峰度較高的內(nèi)源miRNAs，如miR156、miR165和miR168．結(jié)果顯示，植株生長到14d(小苗)時(shí)，相對SUC2:amiR-SUL，SUP-E45突變體中amiR-SUL和miR166的含量明顯上升，miR390的含量明顯下降，但miR156、miR164、miR165、miR168和miR319的含量并未改變，如圖2(a)．利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測SUP-E45突變體和SUC2:amiR-SUL植株中靶標(biāo)基因表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示，SUP-E45突變體中miR156的靶標(biāo)spl3和spl10含量明顯下降；miR168的靶標(biāo)ago1的含量也明顯下降；miR165/miR166的靶標(biāo)phb和phv的含量明顯上升；csd2(copper/zincsuperoxidedismutare2)的含量也明顯上升；其他檢測的靶標(biāo)都沒有變化，如圖2(b)．同時(shí)，以生長到26d時(shí)植株的葉子作為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)．結(jié)果顯示，miR156的表達(dá)量沒有顯著變化，miR165和miR168的表達(dá)量下降，如圖2(c)，amiR-SUL的靶標(biāo)sul的表達(dá)量不變，miR165相對應(yīng)的靶標(biāo)phv和rev表達(dá)量相對升高，但phb的表達(dá)量卻是下降的，如圖2(d)．

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，突變體SUP-E45植株中的amiR-SUL、內(nèi)源miRNA及其靶mRNA表達(dá)量并沒有明顯的上升或下降趨勢，突變體SUP-E45的表型變化也許并非miRNA的合成途徑中基因發(fā)生突變引起的，發(fā)生突變的基因可能是在其他途徑如miRNA活性或者是miRNA運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮功能的基因．

2.4突變位點(diǎn)的檢測與鑒定

對SUP-E45突變體進(jìn)行全基因組測序，通過基因組比對找到突變位點(diǎn)．結(jié)果顯示，突變基因是ago1， 突變位點(diǎn)為一個(gè)堿基鳥嘌呤(G)突變成了腺嘌呤(A)，從而使相對應(yīng)的甘氨酸變成了色氨酸，如圖3(a)和(b)．

*表示P≤0.05； **表示P≤0.01； ***表示P≤0.001圖2 SUP-E45突變體中amiR-SUL和內(nèi)源miRNA及其靶mRNA的相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression level of the amiR-SUL, endogenous miRNAs and target mRNAs’ in SUP-E45 mutant

圖3 全基因組測序的結(jié)果Fig.3 Result of whole genome sequencing

利用dCAPSFinder2.0在線設(shè)計(jì)鑒定突變體的引物(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)， 如圖3(b)，對SUC2:amiR-SUL×SUP-E45F2代植株進(jìn)行基因型鑒定，鑒定結(jié)果如圖3(c)，結(jié)果顯示，突變體的PCR產(chǎn)物不能夠被內(nèi)切酶NdeⅠ切開，只有SUC2:amiR-SUL植株的PCR產(chǎn)物能夠被內(nèi)切酶NdeⅠ切開．

AGO1蛋白在miRNA途徑的功能是已知的，但AGO1基因突變位點(diǎn)不同又會形成很多不同的突變表型，ago1-25突變體在2002年就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，Morel[17]等對ago1突變體進(jìn)行分析鑒定，并對不同點(diǎn)突變的ago1突變體進(jìn)行了分類：第1類突變體是因?yàn)閍go1基因發(fā)生突變導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)途徑缺陷，致使植株發(fā)育受到嚴(yán)重缺陷，并且不育(突變體ago1-1到突變體ago1-24)； 第2類突變體是ago1基因突變雖然也引起了PTGS途徑的缺陷，但植株的表型相對于野生型矮小，且不育(突變體ago1-26)； 第3類突變體是ago1基因突變使得PTGS途徑缺陷，但突變體植株是可育的，而且出現(xiàn)多種發(fā)育表型(突變體ago1-25，ago1-27)[17]． 本文篩選到的SUP-E45突變體就屬于第3類ago1突變體．AGO1蛋白作為一個(gè)功能蛋白在PTGS途徑中和植物生長發(fā)育方面發(fā)揮的作用可能是獨(dú)立的，而且參與到這兩個(gè)途徑中的AGO1蛋白的結(jié)構(gòu)要求也不一樣，從而導(dǎo)致了如此多的突變體的不同表型[17]．

3 討 論

植物中構(gòu)成miRNA通路，包括在該通路中起作用的蛋白的基本框架已建立起來．隨著對miRNA通路研究的深入，不斷發(fā)現(xiàn)有其他蛋白參與miRNA通路的相關(guān)報(bào)道．如Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)DNA結(jié)合蛋白CDC5(celldivisioncycle5)可以與MIR基因的啟動(dòng)子區(qū)域相互作用，幫助PolII對MIR基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，CDC5的缺失會導(dǎo)致PolII在MIR基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合減弱，從而降低MIR基因啟動(dòng)子的活性；MOS2(modifierofSNC1)蛋白可以結(jié)合pri-miRNA和pre-miRNA，并輔助DCL1進(jìn)行加工[19]等．miRNA通路包括miRNA的合成、降解、運(yùn)動(dòng)和發(fā)揮功能等途徑，為進(jìn)一步了解miRNA通路的分子機(jī)制，研究人員希望通過該正向遺傳篩選的方法發(fā)現(xiàn)新的參與miRNA通路中的因子，以補(bǔ)充和完善目前已有的miRNA通路的框架．

本研究獲得了SUP-E45的突變體，通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)該突變體是編碼AGO1蛋白的基因發(fā)生了突變，與ago1-25突變體的突變位點(diǎn)一樣．在擬南芥中AGO蛋白家族有10個(gè)成員，這些AGO蛋白都含有3個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域：PAZ、MID和PIWI．最保守的PAZ結(jié)構(gòu)域能結(jié)合miRNA并使RISC能夠準(zhǔn)確定位到靶mRNA，MID-PIWI形成一個(gè)結(jié)合“口袋”，錨定在單鏈小核糖核酸 (smallRNA,sRNA)的5′磷酸基上，PIWI結(jié)構(gòu)域具有RNA內(nèi)切核酸酶的活性[20]．正是AGO蛋白這些重要的結(jié)構(gòu)域，從而決定了其在形成的復(fù)合物RISC中的重要作用，也是miRNA的重要因子．

目前，利用SUC2:amiR-SUL正向遺傳篩選體系不僅獲得了ago1突變體，還獲得了miRNA通路中其他一些已知的突變體，如dcl1和hyl1等，這些結(jié)果證明了該體系的可行性．另外，本研究還獲得了一些具有預(yù)期表型的突變體，這些突變體中發(fā)生突變的基因在miRNA途徑中的功能尚未見報(bào)道，我們將進(jìn)一步研究這些基因與miRNA途徑的關(guān)系．a(chǎn)go1突變體等已知突變體的獲得證明了該系統(tǒng)的可行性，利用該系統(tǒng)將篩選和鑒定更多參與miRNA通路的新因子，闡明miRNA通路的分子機(jī)制．

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【中文責(zé)編：晨兮；英文責(zé)編：艾琳】

IdentificationofnovelcomponentsofArabidopsismiRNApathwayandmutantanalysis

ZhaoQingzhe1,LiangChao2,andMoBeixin1

1)CollegeofLifeSciencesandOceanography,ShenzhenUniversity,ShenzhenKeyLaboratoryofMicrobiologyandGeneEngineering,Shenzhen518060,GuangdongProvince,P.R.China2)CollegeofLifeSciencesandOceanography,ShenzhenUniversity,GuangdongProvincialKeyLaboratoryforPlantEpigenetics,Shenzhen518060,GuangdongProvince,P.R.China

Micro ribonucleic acids (miRNAs) are20-24nucleotides non-coding RNAs that play key regulatory roles in developmental and physiological processes in plants. In order to screen the new components that are involved in miRNA biogenesis, turnover and movement, we establish a forward genetic screening system usingArabidopsisthalianatransgenic line (SUC2:amiR-SUL). After ethylmethylsulfone (EMS) mutagenesis onSUC2:amiR-SUL, one stable mutant line (SUP-E45) is isolated. The result of phenotype observation, quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and whole genome sequencing on theSUP-E45mutant plants indicates that the altered phenotype is caused by the mutation inArgonaute1(Ago1) gene. AGO1protein encoded byago1gene is crucial in the miRNA pathways, which recruits mature miRNA to form miRISC silence complex (miRNAs-induced silencing complex, miRISC) to negatively regulate the expression of target genes. The screening system can be used to select other factors that participate in the processing such as miRNA synthesis, miRNA’s activity or miRNA transport. The research can lay the foundation on the subsequentArabidopsismiRNA pathway.

molecular biology;SUC2:amiR-SUL;Arabidopsisthaliana; forward genetic screening system; microRNA (miRNA); AGO1protein; EMS mutagenesis; quantitative real-time PCR(qRT-PCR); whole genome sequencing

2017-02-16；Revised：2017-05-25；Accepted：2017-06-07

Professor Mo Beixin．E-mail: bmo@szu.edu.cn

Q 946.2

：Adoi：10.3724/SP.J.1249.2017.05464

Foundation：National Natural Science Foundation of China (31571332)

：Zhao Qingzhe, Liang Chao, Mo Beixin. Identification of novel components ofArabidopsismiRNA pathway and mutant analysis[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(5): 464-470.(in Chinese)

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31571332)

趙慶喆(1990—)，女，深圳大學(xué)碩士研究生．研究方向：植物表觀遺傳．E-mail：491325646@qq.com

引文：趙慶喆，梁 超，莫蓓莘. 擬南芥microRNA通路中新因子的篩選和突變體分析[J]. 深圳大學(xué)學(xué)報(bào)理工版，2017，34(5)：464-470.