劉愛華

哈藥集團(tuán)三精制藥有限公司 150000

高效液相色譜法測(cè)定金銀花連翹提取物中綠原酸、咖啡酸的含量

劉愛華

哈藥集團(tuán)三精制藥有限公司 150000

金銀花是通過(guò)一種常見的中藥藥材，藥性甘、寒，因?yàn)榫哂星鍩峤舛镜寞熜?，臨床醫(yī)學(xué)中常被用以治療風(fēng)寒感冒、熱毒血痢等疾病。高效液相色譜法由于其獨(dú)有的先進(jìn)性和科學(xué)性，常被化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)等領(lǐng)域用來(lái)進(jìn)行成分分離和檢定工作。本文將對(duì)采用高效液相色譜法測(cè)定金銀花連翹提取物中綠原酸、咖啡酸的含量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹和分析，希望能為廣大醫(yī)療工作者的工作提供幾點(diǎn)值得參考的意見。

高效液相色譜法；金銀花；連翹；提取物；綠原酸；咖啡酸；含量

金銀花作為一種常見的中藥藥材，在臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用。而金銀花的連翹部位，由于其含有綠原酸和咖啡酸等物質(zhì)，在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中，也有其特殊用途。本文將對(duì)才有高效液相色譜法測(cè)定金銀花連翹提取物中綠原酸、咖啡酸的含量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行簡(jiǎn)要分析，希望可以得出有用的結(jié)論。

金銀花也被成為忍冬，由于其開花時(shí)獨(dú)特的顏色變化而得名金銀花。金銀花在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用非常廣泛，由于其能夠清熱解毒、抗炎、凝血等作用，常被用于治療外寒感冒、溫病發(fā)熱等疾病。與此同時(shí)，金銀花也可以與其他藥材搭配，緩解人體口干、煩悶等不良癥狀，也可以用于呼吸道類疾病的治療。金銀花這味藥材有多種入藥形式，其中提取物的形式在目前的制藥過(guò)程中被最為廣泛的使用。通常情況下，金銀花提取物可以直接以煎煮的形式，通過(guò)半成品的形式被使用。另一方面，也可以通過(guò)一定的手段對(duì)金銀花的含有藥效的部位進(jìn)行提取之后，再入藥使用。為了保證藥品中金銀花提取物的含量，通過(guò)科學(xué)的方法及相關(guān)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確的測(cè)量其有效部位提取物中的綠原酸和咖啡酸的含量非常有必要。

1.驗(yàn)儀器與藥品的選擇

合理的選擇實(shí)驗(yàn)所用的儀器和藥品樣品，將能夠?qū)?zhǔn)確測(cè)得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)起到一定的保障作用，因此，選擇過(guò)程必須嚴(yán)格遵循相關(guān)規(guī)定。

Agilent 1100 series高效液相色譜儀(G 1322A排氣閥,G 1311A泵,G 1316A柱溫箱,G 1314A紫外檢測(cè)器),chemistation色譜工作站,KromasilC18色譜柱,超聲提取器(KQ 3200DE型數(shù)控超聲儀昆山市超聲儀器有限公司);綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品鑒定所,批號(hào)110753- 200212),金銀花提取物(本實(shí)驗(yàn)室自制),乙腈,磷酸均為分析純;水為雙蒸水。

2 實(shí)驗(yàn)的方法、過(guò)程與結(jié)果

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法的合理應(yīng)用能夠比較科學(xué)、準(zhǔn)確地測(cè)出實(shí)驗(yàn)所需數(shù)據(jù)，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇應(yīng)用高效液相色譜法。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，必須滿足該方法的應(yīng)用要求。

液相色譜和質(zhì)譜連接，可以增加額外的分析能力，能夠準(zhǔn)確鑒定和定量像細(xì)胞和組織裂解液，血液，血漿，尿液和口腔液等復(fù)雜樣品基質(zhì)中的微量化合物。高效液相色譜質(zhì)譜系統(tǒng)（ABSciex Eksigent LC / MS和LC / MS / MS）提供了一些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，包括：

(1)快速分析和流轉(zhuǎn)所需的最少樣品準(zhǔn)備

(2)高靈敏度并結(jié)合可分析多個(gè)化合物能力，甚至可以跨越化合物的種類

(3)高精確度，高分辨率鑒定和量化目標(biāo)分析物

高效液相色譜法有“四高一廣”的特點(diǎn)：

①高壓：流動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液加高壓。

②高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在 15～30分鐘，有些樣品甚至在 5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)。

③高效：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。

④高靈敏度：紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在μL數(shù)量級(jí)。

⑤應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)。

⑥柱子可反復(fù)使用：用一根柱子可分離不同化合物

⑦樣品量少、容易回收：樣品經(jīng)過(guò)色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，與氣相色譜相比各有所長(zhǎng)，相互補(bǔ)充。高效液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢測(cè)器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測(cè)池等）中，如果流動(dòng)相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會(huì)顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測(cè)器的靈敏度不及氣相色譜。

2.1.1 色譜

高效液相色譜法的應(yīng)用，對(duì)色譜有著比較高的要求。本實(shí)驗(yàn)選用了我國(guó)制造生產(chǎn)的KromasilC18液相色譜柱。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，控制了色譜柱溫度保持在25攝氏度，選用12單位的乙腈和88單位的0.4%的磷酸作為實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。與此同時(shí)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，流速控制在1ml/min的狀態(tài)下，實(shí)驗(yàn)使用的檢測(cè)波長(zhǎng)為327nm。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)環(huán)境

由于實(shí)驗(yàn)的環(huán)境 ph值，將對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。因此必須對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的控制。由于綠原酸是有機(jī)酸的化學(xué)特性。在進(jìn)行高效液相色譜法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，為避免出現(xiàn)前沿或拖尾峰的現(xiàn)象，需要在實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相中加入某種酸性物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相中加入乙酸和磷酸的情況進(jìn)行了對(duì)比，可知選用 0.4%的磷酸，能夠得到所需的色譜峰形。

2.1.3 色譜系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

在選定條件下,綠原酸和樣品中其他組分可基線分離,綠原酸與其相鄰色譜峰的分離度大于1.5,理論塔板數(shù)(N)為5 000以上。結(jié)果見圖1。

圖1 金銀花提取物高效液相色譜法圖譜

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對(duì)照品適量,置棕色量瓶中,加 50%甲醇制成每毫升含35.8μg的溶液,即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取本提取物10mg,置100ml容量瓶中,雙蒸水溶解,超聲2min后,再用雙蒸水定容至刻度,搖勻,過(guò)0.45μg微孔濾膜,取續(xù)濾液即得。

2.4 線性范圍的考察及其標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取對(duì)照品溶液 2, 4,6,10,14,18μl,分別注入液相色譜儀。按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積積分值(A)對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行回歸,得回歸曲線方程:Y=2468.4X-16.205,r= 0.9996。結(jié)果表明,綠原酸在0.071 6～ 0.644 4μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見圖2。

圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液10μl,按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄各組綠原酸峰面積值,結(jié)果平均峰面積為:840.5,RSD為0.69%(n=6)。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液,分別于0,2,4,6,8h進(jìn)樣10μl,測(cè)得綠原酸的平均峰面積值為:680.24,RSD為:0.38%(n= 5),表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批號(hào)(070204)樣品 6份,按含量測(cè)定方法測(cè)定,結(jié)果綠原酸平均含量為28.01%,RSD為1.07%(n=6)。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量的金銀花提取物6份,分別精密添加綠原酸對(duì)照品適量,按供試品溶液的方法制備,測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定

取 3批樣品,按照上述方法制備供試品溶液,進(jìn)樣 10μl,依照已確定的色譜條件測(cè)定,按峰面積值用外標(biāo)法計(jì)算樣品中綠原酸的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%）

3 討論

金銀花提取物以有機(jī)酸為有效成分,本實(shí)驗(yàn)以綠原酸含量作為金銀花提取物的質(zhì)量控制指標(biāo),同時(shí)測(cè)定了 3批金銀花提取物中綠原酸的含量,通過(guò)計(jì)算,其含量均在 20%以上。本文所建立的方法簡(jiǎn)便、快捷,重復(fù)性及穩(wěn)定性均較好,可在實(shí)際生產(chǎn)中用于該提取物的質(zhì)量控制。本文所做的工作為開發(fā)金銀花的相關(guān)產(chǎn)品提供了質(zhì)量監(jiān)控方法。

金銀花是一種常見且應(yīng)用廣泛的中藥藥材，對(duì)其合理的運(yùn)用能夠以相對(duì)低廉的價(jià)格進(jìn)行多種疾病的治療。而連翹作為金銀花的主要藥效部位，對(duì)其合理的運(yùn)用，能夠使其中的綠原酸和咖啡酸發(fā)揮出應(yīng)有的效果。在臨床醫(yī)學(xué)中，醫(yī)學(xué)工作者應(yīng)加強(qiáng)對(duì)金銀花的了解，使這種藥材發(fā)揮出它能起到的最大的藥理作用。

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R 473.5

A< class="emphasis_bold">[文章編號(hào)]1

1672-5018（2017）03-035-02