涂政軍 鄒國興 黃李超 陳龍 代麗萍 高易宏 冷語佳 朱麗 張光恒胡江 任德勇 高振宇 董國軍 陳光 郭龍彪 錢前,* 曾大力,*

(1中國水稻研究所 水稻生物學(xué)國家重點實驗室, 杭州 310006；2江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所, 南昌 330200;#共同第一作者;*通訊聯(lián)系人, E-mail: dalizeng@126.com; qianqian188@hotmail.com)

水稻淡綠葉基因PGL11的鑒定與精細定位

涂政軍1,#鄒國興2,#黃李超1陳龍1代麗萍1高易宏1冷語佳1朱麗1張光恒1胡江1任德勇1高振宇1董國軍1陳光1郭龍彪1錢前1,*曾大力1,*

(1中國水稻研究所 水稻生物學(xué)國家重點實驗室, 杭州 310006；2江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所, 南昌 330200;#共同第一作者;*通訊聯(lián)系人, E-mail: dalizeng@126.com; qianqian188@hotmail.com)

【目的】葉片是水稻進行光合作用的主要場所，葉片顏色的變化與水稻的生長發(fā)育直接相關(guān)。發(fā)掘水稻葉色突變體，是水稻功能基因組學(xué)研究的重要遺傳基礎(chǔ)?！痉椒ā坷肊MS誘變?nèi)毡厩绔@得一個能穩(wěn)定遺傳的淡綠葉突變體，暫命名為pgl11(pale green leaf 11)。在不同生育期測定野生型與突變體的葉綠素含量。在苗期，取野生型與突變體葉片進行葉綠體結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察。在分蘗期，測定野生型與突變體的光合參數(shù)并觀察氣孔結(jié)構(gòu)。在成熟期，測定野生型和pgl11的主要農(nóng)藝性狀。以pgl11為母本，南京6號為父本構(gòu)建相應(yīng)的F2群體，采用圖位克隆的方法，對該基因進行定位?！窘Y(jié)果】從苗期開始，突變體pgl11的每一片新葉均表現(xiàn)為淡綠色，葉綠素含量顯著降低，葉綠體發(fā)育異常。隨著葉片的生長，葉色由淡綠逐漸轉(zhuǎn)綠，至抽穗期時葉綠素含量亦無明顯差異。pgl11還表現(xiàn)光合速率、氣孔導(dǎo)度明顯下降，胞間CO2濃度上升。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，突變體pgl11的氣孔發(fā)育異常。與野生型相比，突變體的農(nóng)藝性狀如株高、劍葉寬、二次枝梗數(shù)、每穗粒數(shù)、粒長、粒寬、千粒重以及結(jié)實率等均顯著降低。對葉綠素合成、光合作用以及質(zhì)體發(fā)育相關(guān)基因的表達量測定表明，突變體pgl11中參與葉綠體轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)基因的表達量顯著升高，而葉綠素合成和光合作用相關(guān)基因的表達量顯著下降。遺傳分析表明，該突變表型受一對隱性核基因控制。通過圖位克隆的方法將該基因定位于第1染色體上的C6和C8標記之間，物理距離約為110 kb?！窘Y(jié)論】該定位區(qū)間內(nèi)未見有葉色相關(guān)基因報道，推測PGL11基因可能是一個新的水稻葉色基因。

水稻；淡綠葉；葉綠體；遺傳分析；基因定位

葉綠素是光合器官的重要組成部分，在植物生長發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用[1]。除了為植物提供綠色的外觀之外，葉綠素在光合作用中負責(zé)接收捕獲光能，同時驅(qū)動電子通過電子傳遞鏈轉(zhuǎn)移到光合反應(yīng)中心[2]，完成光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的過程[3]。水稻葉綠素含量的增加可以提高光合作用率[4]，增加光合有機物的積累，并最終提高水稻的產(chǎn)量[5-6]。葉色相關(guān)基因的突變，會引起葉綠素的含量及葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最終形成白化、黃化、條紋、淺綠和斑點等類型的突變[7]。目前，在水稻[8-9]、擬南芥[10]、玉米[11]、棉花[12]，小麥[13]、油菜[14]等多種植物葉均發(fā)現(xiàn)有葉色突變體的存在。

迄今為止，已有不少于80個水稻葉色突變體得到鑒定，且多個已被克隆。其中包括NTRC[15]、OsClpP5[16]、SGR[17]、OsDVR[18]、OsChlH/I/D[19-20]、YGL1[21]、OsCAO1[22]、OsCAO2[23]、YSA[24]、OsRpoTp[25]、OsCHR4[26]、OsPPR1[27]以及OsPDS[28]等。這些基因克隆和功能分析豐富了水稻葉色相關(guān)遺傳調(diào)控機理的闡述，水稻葉色突變體的表型一般是受核基因或細胞質(zhì)基因控制，其中，以隱性核基因控制的情況居多[29-31]。根據(jù)水稻葉色突變體的形成機制可分為葉綠素代謝途徑受阻[22,23]、葉綠體發(fā)育進程受阻[9,25]、光敏色素調(diào)控受阻[32]、血紅素反饋調(diào)節(jié)紊亂等[33]，而以葉綠素合成途徑的研究報道最為深入。通過對雙子葉植物(如擬南芥)的研究發(fā)現(xiàn)，高等植物葉綠素生物合成通常需要通過一系列復(fù)雜的反應(yīng)[34]，參與葉綠素合成的27個基因及其編碼的酶都已被鑒定[35]。水稻中目前也已克隆9個編碼葉綠素合成途徑相關(guān)酶的基因，分別為編碼鎂離子螯合酶三個D、I、H小亞基的OsChlD、OsChlI和OsChlH基因[19,20]、編碼聯(lián)乙烯還原酶的OsDVR基因[18]、編碼NADPH-原葉綠素酸酯氧化還原酶A和B的OsPORA和OsPORB基因[36,37]、編碼葉綠素合酶的YGL1基因[21]以及編碼葉綠素酸酯a加氧酶的OsCAO1和OsCAO2基因[22,23]。這些基因的突變都會對水稻葉色及生長產(chǎn)生影響。

目前，對葉色突變體形成的分子機制的研究仍然不是十分清楚，主要是因為其形成過程十分復(fù)雜，牽涉到多方面的生理生化反應(yīng)。與葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的突變不僅直接影響葉綠體的發(fā)育，同時也會間接影響葉綠素的合成。水稻葉色基因V2的突變導(dǎo)致葉綠體的分化受到抑制，尤其在葉片發(fā)育早期破壞了葉綠體的轉(zhuǎn)錄/翻譯機制，最終造成葉綠體發(fā)育遲滯，葉綠素含量降低，表現(xiàn)出白化表型[38]。V3和St1分別編碼核糖核酸還原酶RNR的大、小亞基，其突變體植株的核糖核苷酸還原酶活性顯著下降，導(dǎo)致與質(zhì)體發(fā)育及光合作用相關(guān)基因的表達量發(fā)生了改變，進而影響葉綠體的發(fā)育[39]。三角狀五肽重復(fù)區(qū)蛋白(PPR)在水稻葉綠體發(fā)育過程中起著重要的作用，OsPPR1是第一個報道的參與水稻葉綠體形成的PPR蛋白。抑制該基因的表達，植株表現(xiàn)出缺綠的突變表型，甚至還會出現(xiàn)白化致死現(xiàn)象[27]。

本研究從粳稻日本晴EMS突變體庫中篩選到一個能夠穩(wěn)定遺傳的淡綠葉突變體，暫命名為pgl11。從表型、生理、遺傳和基因表達等方面分析了pgl11的特征，圖位克隆將pgl11定位在第1染色體上110 kb的物理距離。這些結(jié)果將為最終分離PGL11基因，闡明其遺傳調(diào)控機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 突變體來源及種植

EMS誘變粳稻品種日本晴，經(jīng)多代自交性狀穩(wěn)定，獲得淡綠葉突變體pgl11。pgl11與培矮64S和南京6號雜交獲得的F1及F2群體用于基因的遺傳分析與精細定位。所有材料(包括野生型日本晴)均種植于中國水稻研究所富陽和海南試驗基地。

1.2 農(nóng)藝性狀調(diào)查

在水稻抽穗期測定野生型和突變體pgl11的劍葉長、劍葉寬，在完熟期測定野生型和突變體pgl11的株高、分蘗數(shù)、穗長、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、每穗粒數(shù)、粒長、粒寬、千粒重與結(jié)實率等主要農(nóng)藝性狀，每個性狀10次重復(fù)，并采用t檢驗法分析突變體與野生型之間的差異顯著性。

1.3 葉綠素含量的測定取相同生長時期野生型和突變體的葉片0.05 g，浸入5 mL的丙酮提取液(v95%丙酮∶v無水乙醇=2∶1)中，在26℃黑暗條件下充分浸提24 h[40]。利用 DU800UV/Vis分光光度計分別測定三個不同波長(470 nm、645 nm和663 nm)下浸提液的吸光度值，根據(jù)公式[41]計算出對應(yīng)的葉綠素a、葉綠素 b及類胡蘿卜素含量，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.4 光合參數(shù)的測定

水稻分蘗盛期，在晴好天氣的上午9點到11點時間段內(nèi)，用便攜式光合測定儀Li-6400到田間對野生型及突變體的劍葉進行光合測定。選取位于種植小區(qū)中間部分且長勢基本一致的野生型和突變體pgl11植株，分別測定其凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率等參數(shù)，測定部位為劍葉中上部，共測定5個重復(fù)。結(jié)果取平均值。

1.5 葉片的掃描電鏡觀察

為了觀察葉綠體的結(jié)構(gòu)，分別取野生型和突變體幼苗的新出葉，剪成小片，于2.5%的戊二醛溶液中抽真空。固定后分別用 50%、70%、80%、95%和100%的乙醇和丙酮進行逐級脫水，最后用環(huán)氧化樹脂包埋，樣品經(jīng)過切片、醋酸鈾染色后，在透射電子顯微鏡下進行觀察[42]。

1.6 突變體pgl11的遺傳分析與基因定位

當年夏季，將突變體pgl11與培矮64和南京6號雜交，同年冬季，將雜交種F1種植于海南陵水基地，并觀察兩個組合的F1表型，自交獲得F2種子。次年夏季將這兩個F2群體種植于浙江杭州富陽實驗基地，并分別調(diào)查野生型表型和突變體表型植株的數(shù)目，考查性狀的分離比并通過卡方檢驗驗證，完成遺傳分析。

利用本實驗室保存的均勻分布于12條染色體的232對引物對雙親和F1進行多態(tài)性篩選，從中獲得136對多態(tài)性的標記用于pgl11的連鎖分析和初定位。并利用秈稻9311序列(http://www.rise. genomics.org.cn)和粳稻日本晴(NPB)序列(http://rgp.dna.affrc.go.jp)，在目標區(qū)間開發(fā)多態(tài)性標記，進一步擴大pgl11與南京6號的F2群體，進行精細定位。

1.7 RNA的提取及定量RT-PCR

利用Qiagen公司的總RNA提取試劑盒(RNeasy plant mini kit)對野生型和突變體pgl11的總RNA進行提取，并以RNase-free DNaseⅠ處理過的總RNA為模板，采用ToYoBo公司的cDNA合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。利用Applied Biosystems公司的ABI7900對野生型和突變體中相關(guān)基因的表達量進行測定。以基因Ubiqutin作為內(nèi)參基因。10 μL RT-PCR體系包括cDNA模板1 μL，2×SYBR qPCR Mix(ToYoBo) 5 μL，正反引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O補足至10 μL。RT-PCR擴增程序如下：95℃下預(yù)變性1.5 min；95℃下10 s，60℃下30 s，72℃下20 s，共40個循環(huán)。以2－ΔΔCT法計算各基因的相對表達量[43]。RT-PCR中相關(guān)基因檢測所用引物見表1。

表1 實時定量PCR引物Table 1. Primers used in real-time PCR.

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體pgl11表型及農(nóng)藝性狀分析

在自然生長條件下，突變體pgl11從出芽開始葉片即表現(xiàn)淡綠(圖1-A)，隨著葉片的發(fā)育，新葉從葉尖到葉基部逐漸變綠(圖1-B)，到抽穗期葉片顏色完全恢復(fù)綠色(圖1-C)。調(diào)查結(jié)果顯示，突變體的抽穗期較野生型推遲一周，其農(nóng)藝性狀除分蘗數(shù)、劍葉長、穗長及一次枝梗數(shù)未發(fā)生明顯變化外，株高、劍葉寬、二次枝梗數(shù)、每穗粒數(shù)、粒寬、千粒重以及結(jié)實率等性狀均存在極顯著差異(表2)。

2.2 突變體pgl11葉綠素含量的變化

由于突變體pgl11葉片顏色在發(fā)育過程中出現(xiàn)轉(zhuǎn)綠現(xiàn)象，因此，我們對野生型和突變體pgl11苗期、分蘗期和抽穗期葉片的葉綠素含量進行了測定。結(jié)果表明，在苗期突變體葉綠素含量顯著下降；到分蘗期，二者差異減小；抽穗期時，野生型與突變體的葉綠素含量則無明顯差異。其中，突變體pgl11苗期的葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量分別較野生型下降了77.25%、80.06%和51.88%(圖2-A)。在分蘗期，突變體pgl11的葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量則分別降低了22.2%、28.7%和12.5%(圖2-B)。而到了抽穗期，野生型與突變體pgl11的光合色素含量差異不顯著(圖2-C)。

2.3 突變體pgl11的光合參數(shù)分析

圖1 野生型和突變體pgl11在不同生育期的表型Fig. 1. Phenotypes of the wild type(WT) and the pgl11 mutant at various growth stage.

表2 野生型WT和突變體pgl11的基本農(nóng)藝性狀(平均數(shù)±標準差, n=3)Table 2．Agronomic traits of the wild type(WT) and pgl11 mutant(Mean±SD, n=3).

為了分析突變體pgl11光合作用是否受到影響，我們對分蘗期野生型和突變體pgl11劍葉的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速度等4個光合指標進行測定。結(jié)果表明，突變體除了胞間CO2濃度有所增加外，其余3個參數(shù)均出現(xiàn)顯著下降。其中，突變體pgl11劍葉凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度分別下降了約32.3%、34.3%和21.9%，差異均達極顯著水平，而胞間CO2濃度上升了16.84%(表3)。掃描電鏡觀察野生型和突變體pgl11葉片氣孔結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，突變體pgl11的氣孔收縮并呈帶狀下陷，且下陷的氣孔口周圍沒有硅質(zhì)化乳突，部分氣孔發(fā)育不完全(圖3)。說明PGL11突變后導(dǎo)氣孔發(fā)育異常，光合作用受到明顯影響，主要體現(xiàn)在胞間CO2濃度顯著提高，而凈光合速率和氣孔導(dǎo)度顯著降低。

表3 分蘗盛期野生型和突變體pgl11的劍葉光合參數(shù)(平均數(shù)±標準差, n=5)Table 3．Photosynthetic parameters of flag leaf of wild type(WT) and pgl111 mutant at the tillering stage(Mean±SD, n=5).

圖2 野生型與突變體pgl11的葉綠素含量比較Fig. 2. Comparison of chlorophyll contents between WT and pgl11.

圖3 分蘗盛期野生型和突變體pgl11葉片氣孔結(jié)構(gòu)Fig. 3. Leaf stomatal structure of wild type(WT) and pgl11 at the tillering stage.

2.4 葉綠體結(jié)構(gòu)的顯微觀察

為了進一步確定突變體pgl11葉綠體發(fā)育是否異常，我們分別對野生型與突變體pgl11的4葉期葉片進行透射電鏡觀察。結(jié)果表明，野生型葉肉細胞中葉綠體數(shù)目較多且體積較大，基質(zhì)較濃厚，基粒片層垛疊正常，具有正常的片層結(jié)構(gòu)(圖4-A,B)，而突變體pgl11中葉肉細胞中的葉綠體數(shù)目明顯減少且體積減小，沒有正常的基粒垛疊及成形的淀粉粒堆積，甚至有的細胞中沒有葉綠體結(jié)構(gòu)(圖4-C,D)。該結(jié)果表明PGL11基因突變影響了水稻葉肉細胞中葉綠體結(jié)構(gòu)的正常發(fā)育。

2.5 PGL11的遺傳分析和基因定位

為了進一步明確突變體pgl11的遺傳特性，將突變體pgl11分別與秈稻品種培矮64和南京6號進行雜交。結(jié)果表明，突變體pgl11與培矮64的F1為正常表型，F(xiàn)2分離出的正常表型和淡綠葉表型植株分別為413株和141株，經(jīng)卡方檢驗符合3∶1(χ2=0.0602＜；與南京6號雜交后，F(xiàn)1為正常表型，F(xiàn)2分離出正常表型和淡綠葉表型植株分別為504株和167株，經(jīng)卡方檢驗符合3∶1(χ2=0.0045＜(表4)，表明突變體pgl11的淡綠葉表型受一對隱性核基因控制。

圖4 野生型和突變體pgl11葉片葉綠體的超微結(jié)構(gòu). Fig. 4. Chloroplast ultrastructure of wild type and pgl11.

利用本實驗室保存的均勻分布在水稻12條染色體上的232對SSR和STS標記對雙親和F1進行多態(tài)性分析，從中獲得136對多態(tài)性的標記用于pgl11的初定位。根據(jù)連鎖分析，將目標基因初步定位在第1染色體短臂上的M1和M2兩個標記之間。為了對PGL11進行精細定位，我們擴大pgl11與南京6號的F2群體，并挑選出1 328株有突變表型的單株。根據(jù)水稻粳稻品種日本晴及秈稻品種93-11的序列差異，在M1與M2之間開發(fā)了多個在雙親具有多態(tài)性的標記(表5)。根據(jù)染色體步移的方法，最終將PGL11定位于標記C6和C8之間，物理距離約為110 kb的范圍內(nèi)，此區(qū)間包含2個BACs(AP000836和AP000837)(圖5)。該范圍內(nèi)共有10個開放閱讀框，包括8個編碼假定蛋白、1個編碼表達蛋白的基因及1個已被克隆的基因。已被克隆的基因為一個編碼MYB結(jié)構(gòu)域蛋白的CSA基因。

2.6 葉綠素合成、葉綠體發(fā)育及光合作用相關(guān)基因的表達

由于突變體葉片表現(xiàn)出明顯的淡綠葉表型, 且色素含量及光合速率均下降，葉綠體結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出異常。因此，葉綠素合成、光合作用及葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達可能會受到一定程度的影響。利用實時熒光定量PCR對突變體pgl11及野生型中與葉綠素合成相關(guān)基因HEMA1(谷氨酰-tRNA還原酶)、CHLH(鎂離子螯合酶)、PORA(NADPH-原葉綠素酸酯氧化還原酶a)、PORB(NADPH-原葉綠素酸酯氧化還原酶b)、CAO1(葉綠素酸酯氧化酶)、光合作用相關(guān)基因LhcP2(捕光復(fù)合蛋白)、LhcB1/B4(葉綠素a/b結(jié)合光捕獲蛋白)、葉綠體發(fā)育過程相關(guān)基因PsaA(光系統(tǒng)Ⅰ葉綠素脫輔基蛋白)、PsbA(光系統(tǒng)Ⅱ醌結(jié)合蛋白)、Rps15(核糖體小亞基蛋白15)、OsSig2A(質(zhì)體RNA聚合酶)的表達水平進行測定(圖6)。結(jié)果表明，與野生型相比，突變體的葉綠素代謝相關(guān)基因CHLH和HEMA的表達量明顯上升，而PORA、PORB及CAO1的表達水平顯著下降。光合作用相關(guān)基因LhcB1、LhcP2的表達量無明顯變化，而LhcB4的表達量則顯著降低。葉綠體發(fā)育相關(guān)基因PsaA、PsbA的表達量顯著降低。與葉綠體轉(zhuǎn)錄/翻譯相關(guān)基因Rps15和OsSig2A的表達量則顯著上升。這些結(jié)果表明，PGL11的突變導(dǎo)致與葉綠素合成、光合作用以及葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達發(fā)生明顯改變。

表4 突變體基因PGL11的遺傳分析Table 4．Genetic analysis of PGL11.

表5 本研究中精細定位所用引物Table 5．Primers used for fine mapping in the study.

圖5 PGL11基因的分子定位Fig. 5. Molecular mapping of PGL11.

圖6 野生型(WT)與突變體pgl11中葉綠素合成、光合作用及葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達Fig. 6. Expression analysis of genes associated with chlorophyll biosynthesis, photosynthesis and chloroplast development in the wild type(WT) and pgl11 mutant.

3 討論

水稻是一種重要的單子葉模式植物，隨著水稻全基因組測序的完成，通過水稻葉色突變體來研究水稻的功能基因組學(xué)越來越受到大家的關(guān)注。葉色突變體是水稻突變體中十分常見且容易通過觀察辨別的突變類型，是研究水稻葉綠體功能、葉綠素代謝及高光效育種的重要的遺傳材料。在已經(jīng)報道的水稻葉色突變體中，存在著許多轉(zhuǎn)綠類型的突變體。如突變體v4在3葉期表現(xiàn)出白化表型，葉綠體發(fā)育異常，4葉期后，葉片則逐漸變綠[44]。白化突變體ysa在3葉期前生長白化葉，之后葉片逐漸變綠，直到6葉期葉片完全恢復(fù)成正常綠色[24]。YGL1基因編碼葉綠素合成酶，水稻黃綠葉突變體ygl1生長發(fā)育前期葉片為黃色，中期葉色開始轉(zhuǎn)綠，后期葉色則接近野生型[21]。與以上突變體表型相似，本研究的pgl11突變體也是一個典型的水稻轉(zhuǎn)綠類型的突變體。生長前期，葉片淡綠甚至黃化，中期葉片逐漸轉(zhuǎn)綠，后期葉片恢復(fù)為正常綠色。

基因PGL11定位于水稻第1染色體上，而在前人的研究中，水稻第1染色體上已克隆的葉色基因只有4個，分別是NYC1[45]、WLP1[46]、YGL8[47]和OsHAP3A[48]。NYC1編碼葉綠素b還原酶基因。NYC1的突變造成葉綠素降解途徑受抑制，突變體nyc1的葉片在衰老時仍然保持綠色。WLP1編碼一個葉綠體核糖體L13蛋白，是葉綠體核糖體的主要組成成分。低溫條件下，wlp1突變體葉綠素合成受阻，在4葉期前葉片白化，4葉期以后轉(zhuǎn)為綠色，且wlp1的株高較野生型更高。YGL8基因編碼鎂原卟啉Ⅸ單酯環(huán)化酶(MgPME)的一個催化亞基。ygl8突變體在幼苗期、分蘗期和抽穗期均表現(xiàn)出明顯的黃綠葉表型，葉片中葉綠素含量降低，生長后期葉片逐漸轉(zhuǎn)綠，抽穗期遲滯，分蘗數(shù)、千粒重與結(jié)實率等產(chǎn)量性狀顯著降低。OsHAP3A編碼一個CAAAT-box結(jié)合復(fù)合體HAP3亞基。反義表達OsHAP3A的植株葉綠體發(fā)育異常，葉綠素含量降低，葉綠體降解，葉片出現(xiàn)淺綠色表型。其中只有ygl8突變體在整個生育期的表型與pgl11較為相似，但二者在染色體上的位置完全不同。進一步將基因PGL11定位在標記C6與C8之間，遺傳距離約為110 kb。該范圍內(nèi)共含有10個開放閱讀框。其中已被克隆的基因為一個編碼MYB結(jié)構(gòu)域蛋白的CSA基因[49]。CSA是一個在水稻雄性生殖發(fā)育過程中調(diào)控糖分配的重要的轉(zhuǎn)錄因子，該基因突變最終導(dǎo)致植株雄性不育。另外，LOC_Os01g16730編碼一個C端催化域包含蛋白質(zhì)，該蛋白屬于類泛素(ulp1)蛋白酶家族，主要參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解；LOC_Os01g16750預(yù)測為編碼一個黃素單氧酶，參與水稻IAA的生物合成；LOC_Os01g16770預(yù)測編碼一個擴增前體蛋白，參與細胞的擴增；LOC_Os01g16840預(yù)測編碼一個微線蛋白sm70；LOC_Os01g16800編碼一個表達蛋白；另外4個為編碼轉(zhuǎn)座蛋白的基因。在前人的研究中，在該區(qū)間內(nèi)尚未報道過與控制pgl11突變表型相似的基因，這進一步說明了PGL11可能是一個控制水稻葉色的新基因。

本研究的突變體材料pgl11的葉綠體結(jié)構(gòu)異常，結(jié)合其葉色的變化，推測可能是由于其葉綠體發(fā)育過程與野生型不同，突變體的葉綠體可能經(jīng)歷了前質(zhì)體到白色體再到葉綠體這樣一個較長的發(fā)育過程[50]，所以突變體在生長前期，葉綠體發(fā)育緩慢、滯后。到生長后期，葉綠體逐漸發(fā)育完全，葉色開始轉(zhuǎn)綠。同時我們在轉(zhuǎn)錄水平分析突變基因?qū)χ仓甑挠绊憽T-PCR結(jié)果表明，葉綠素合成途徑的前期參與基因HEMA、CHLH的表達量上升，而合成后期的基因PORA、PORB、CAO1的表達量則顯著下降，產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能是基因突變引起了這個過程的某一個酶的活性改變，從而影響了葉綠素合成的進程，這與葉綠素含量的測定值相吻合。質(zhì)體內(nèi)存在兩種類型的RNA酶：質(zhì)體編碼的RNA聚合酶(PEP)與核編碼的RNA聚合酶(NEP)。核基因OsSig2A編碼質(zhì)體RNA聚合酶的一個調(diào)控亞基，參與質(zhì)體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。質(zhì)體基因Rps15編碼葉綠體核糖體S15小亞基，負責(zé)質(zhì)體翻譯過程中的識別功能。結(jié)果表明，基因OsSig2A與rps15的表達水平顯著上升，特別是基因rps15，其表達水平增加了約5.4倍，表明基因PGL11的突變影響質(zhì)體的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。葉綠體編碼的基因PsaA、PsbA、LhcB1/B4及LhcP2與葉綠體的光合器官形成有關(guān)。這些基因的表達能夠激活葉綠體內(nèi)光合器官的光合作用能力，促進葉綠體的發(fā)育成熟。除LhcB1表達水平未發(fā)生明顯變化外，其他4個基因的表達水平均顯著降低，這也很好地解釋了突變體葉綠體發(fā)育的異常及光合速率的下降。

突變體pgl11不僅有葉色的變化，也有株高、劍葉寬、二次枝梗數(shù)、每穗粒數(shù)、粒寬、千粒重以及結(jié)實率等性狀的變化，說明基因PGL11的突變是一因多效的。pgl11植株的抽穗期較野生型晚約一周，可能是由于基因突變使水稻的葉色變淺，葉綠體發(fā)育異常，光合速率下降，導(dǎo)致源器官的能量供給不足，從而引起抽穗期的延后。氣孔是植物體與外部環(huán)境進行水和氣體交換的重要通道，能夠維持植物體的溫度、代謝穩(wěn)定及光合作用的正常進行。突變體pgl11葉片的氣孔形態(tài)與結(jié)構(gòu)異常，局部的氣孔出現(xiàn)成片的下陷，這些氣孔周圍沒有任何的乳突結(jié)構(gòu)。氣孔的發(fā)育直接影響葉片中的碳同化進程，這可能是其光合作用下降的重要原因。本研究的突變體材料可為研究水稻葉片葉綠素合成、葉綠體發(fā)育及提高水稻光合效率與產(chǎn)量提供重要的種質(zhì)資源，同時為該基因的最終克隆提供參考。

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Identification and Fine Mapping of Pale Green Leaf PGL11 in Rice

TU Zhengjun1,#, ZOU Guoxing2,#, HUANG Lichao1, CHEN Long1, DAI Liping1, GAO Yihong1, LENG Yujia1, ZHU Li1, ZHANG Guangheng1, HU Jiang1, REN Deyong1, GAO Zhenyu1, DONG Guojun1, CHEN Guang1, GUO Longbiao1, QIAN Qian1,*, ZENG Dali1,*

(1State Key Laboratory for Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;2Rice Research Institute, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: dalizeng@126.com; qianqian188@hotmail.com)

【Objective】 Leaf is the main site of photosynthesis in rice. The change of leaf color is directly related to the growth and development of rice. The research of leaf color mutants is an important genetic basis for the study of rice functional genomics. 【Method】We identified a pale green leaf mutant termed pgl11(pale green leaf 11) from japonica cultivar Nipponbare by ethyl methylsulfonate (EMS) treatment. The chlorophyll content of wild type(WT) and mutant was measured at different growth stages. At the seedling stage, the chloroplast structure of the leaves of the WT and the mutant were observed with a transmission electron microscopy. At the tillering stage, the photosynthetic parameters of WT and pgl11 were measured and the stomatal structure was observed. At the mature stage, the main agronomic traits of WT and pgl11 were determined. F2population derived from pgl11/Nanjing 6 was used to map this gene by position cloning approach.【Result】At seedling stage, every new leaf of the mutant pgl11 was pale green. As the leaves matured, the leaf color gradually turned green. Compared with wild type, the chlorophyll content in pgl11 decreased at seedling stage. However, there was no significant difference at heading stage. In addition, the photosynthetic rate and stomatal conductance of pgl11 were significantly decreased, but the intercellular CO2concentration was apparently increased. The

stomata was abnormal in pgl11. The agronomic traits including plant height, flag leaf width, secondary rachis branch number, grain number per panicle, grain length, grain width, 1000-grain weight and seed setting rate decreased significantly in pgl11 compared with wild type. The expression of genes associated with chloroplast transcription and translation were upregulated in pgl11, while the expression of chlorophyll synthesis and photosynthesis related genes were downregulated. Genetic analysis showed that the mutant phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene, and PGL11 was mapped to a 110kb region between the markers C6 and C8 on the short arm of chromosome 1. 【Conclusion】It was suggested that PGL11 gene would be a putative novel pale green leaf gene.

rice; pale green leaf; chloroplast; genetic analysis; gene mapping.

Q755; S511.03

A

1001-7216(2017)05-0489-11

2017-04-11; 修改稿收到日期：2017-05-12。

中央級公益性科研院所專項；中國農(nóng)科院科技創(chuàng)新工程資助項目；國家自然科學(xué)基金資助項目(31661143006，91435105)。