蔡年俊 郭留明 李靜 項(xiàng)聰英 羊健 陳劍平,* 張恒木,*

(1浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 金華321004；2浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，杭州 310021；*通訊聯(lián)系人，E-mail：zhhengmu@tsinghua.org.cn)

一個(gè)水稻小熱休克蛋白的異源表達(dá)及寡聚特性分析

蔡年俊1,2郭留明1,2李靜2項(xiàng)聰英1,2羊健2陳劍平2,*張恒木2,*

(1浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 金華321004；2浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，杭州 310021；*通訊聯(lián)系人，E-mail：zhhengmu@tsinghua.org.cn)

【目的】在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室已克隆了一個(gè)水稻小熱休克蛋白基因(OsSHSP17.6)，并發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)明顯受到熱激和病毒侵染調(diào)控，表明該蛋白可能在逆境脅迫過程中起重要作用。本研究的目的在于進(jìn)一步明確OsSHSP17.6的特性?！痉椒ā吭诒狙芯恐校M(jìn)一步將該基因亞克隆至原核表達(dá)載體pET-32a并導(dǎo)入大腸桿菌E. coli BL21(DE3)pLysS誘導(dǎo)表達(dá)，通過親和層析的方法純化了該重組蛋白，進(jìn)一步用于非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western blotting分析。【結(jié)果】異源表達(dá)的重組OsSHSP17.6能減輕IPTG對(duì)宿主菌的毒害。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western blotting分析顯示純化的重組OsSHSP17.6蛋白在體外能形成同源二聚體和寡聚體?！窘Y(jié)論】這些結(jié)果支持OsSHSP17.6是一個(gè)有功能的分子伴侶蛋白并表明該蛋白可能通過形成同源寡聚體的方式參與逆境脅迫反應(yīng)，這為進(jìn)一步明確OsSHSP17.6的功能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

小熱休克蛋白；異源表達(dá)；寡聚化作用

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一類高度保守的、分子量在10～200 kD之間的分子伴侶蛋白，其中小熱休克蛋白(small heat shock protein，SHSP)的分子量大小一般在15～30 kD，且在充當(dāng)分子伴侶時(shí)不依賴ATP[1,2]。SHSP廣泛存在于各類生物細(xì)胞中且含量豐富，在重金屬、干旱、冷凍和氧化脅迫等諸多非生物逆境以及細(xì)胞凋亡、分化等發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能[3-5]。作為動(dòng)植物抗逆過程中的一道防線，SHSP在進(jìn)化過程中呈現(xiàn)復(fù)雜性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，哺乳動(dòng)物中含有4個(gè)SHSP，果蠅中有4個(gè)SHSP，細(xì)菌中有2個(gè)SHSP[6]，而擬南芥中至少有19個(gè)SHSP[7]，表明植物SHSP種類更為豐富多樣。根據(jù)進(jìn)化樹分析，植物SHSP至少被分為14個(gè)亞類(subfamilies)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，這些SHSP可能定位于不同的細(xì)胞器，包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物體[7]。SHSP在不同細(xì)胞器中定位至少在一定程度上反應(yīng)植物SHSP的功能多樣性。最近的報(bào)道顯示，植物SHSP不僅參與保護(hù)植物免受非生物逆境的傷害，還可能參與病毒等生物逆境響應(yīng)過程[8]，但對(duì)于它們的功能機(jī)制仍然了解很少。

在前期的研究中，本實(shí)驗(yàn)室在研究水稻條紋病毒與水稻互作的過程中首次發(fā)現(xiàn)病毒侵染可改變SHSP在水稻細(xì)胞內(nèi)的定位和分布模式，并且水稻條紋病毒復(fù)制酶可特異性地與水稻中一個(gè)SHSP在細(xì)胞質(zhì)中相互作用，表明SHSP參與病毒與水稻間的互作過程[8]?；蚩寺¤b定顯示，該SHSP分子量大小約17.6 kD；序列分析顯示該類SHSP在不同的植物中是保守的，在分類上隸屬于CI類；實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blotting分析顯示熱激處理和病毒侵染都顯著影響該基因的表達(dá)，且該蛋白可能存在寡聚體的形式[9]。為了進(jìn)一步確定該SHSP的生物學(xué)功能，本研究進(jìn)一步通過異源重組表達(dá)并利用純化蛋白分析該蛋白的寡聚特性。

1 材料與方法

1.1 材料

所用的水稻品種為日本晴。大腸桿菌菌株DH5α由北京全式金生物有限公司提供；pGEM-T Easy載體購(gòu)自Promega公司；SDS-PAGE低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Invitrogen公司；T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；HSP20抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備保存；表達(dá)載體pET-32a(+)購(gòu)自Novagen 公司；本實(shí)驗(yàn)所需的引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 三維結(jié)構(gòu)分析

通過HOMCOS程序(http://homcos.pdbj.org/)對(duì)蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并采用Rasmol軟件(http://www.openRasmol.org)對(duì)模型結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.3 原核表達(dá)載體構(gòu)建

OsSHSP17.6擴(kuò)增及其克隆參照項(xiàng)聰英等[9]。取水稻cDNA(約1～5 ng)作模板，采用基因特異性上游引物OsSHSP-F(CGCGGATCCATGTCGCTG ATCCGCCGCAG，劃線部位為BamH Ⅰ識(shí)別位點(diǎn))和下游引物OsSHSP-R(GCGAGCTCCTAGCCGG AGATCTGGATG，劃線部位為SacⅠ識(shí)別位點(diǎn))，按項(xiàng)聰英等[9]的方法和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR并構(gòu)建克隆載體。獲得克隆載體后取1～2 μg，依次加入2 μL 10 ×酶切反應(yīng)緩沖液、1 μL BamH Ⅰ和Sac Ⅰ及ddH2O至終體積為20 μL，在37℃水浴條件下酶切3 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收純化目的基因片段，然后將其連接至同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pET-32a質(zhì)粒上，連接反應(yīng)體系如下：7 μL目的片段(50～200 ng)、1 μL表達(dá)載體pET-32a質(zhì)粒(約50 ng)、1 μL 10×連接反應(yīng)緩沖液、1 μL T4DNA連接酶，總體系10 μL，4℃下連接反應(yīng)約12 h；并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過菌液PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定篩選含有目的基因片段的重組子。

1.4 原核表達(dá)及重組蛋白純化

將含有目的基因的表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)菌株E. coli BL21(DE3)pLysS，接種于含氨芐抗生素的固體LB培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)過夜；第2天轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600值約0.6時(shí)加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1～3 h。然后離心收集菌體，加入苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)至其終濃度為1 mmol/L；菌體經(jīng)超聲波裂解后，4℃、12 000 r/min下離心25 min，收集上清；再按照商家說明使用Ni柱從上清液中親和層析純化目的重組蛋白。

1.5 非變性PAGE、SDS-PAGE和Western blot分析

ProtParam程序分析(http://web. expasy. org/ protparam/)顯示OsSHSP17.6蛋白為酸性蛋白，因此我們選用分離酸性蛋白的緩沖液[10× Tris-Gly電泳緩沖液： 0.25 mol/L三羥甲基氨基甲烷(Trisbase)，1.92 mol/L甘氨酸，pH 8.8]、4%濃縮膠[0.5 mL丙烯酰胺(30%)、1.25 mL Tris-HCl(0.5 mol/L，pH 6.8)、3.2 mL ddH2O、50 μL 10%過硫酸銨、5 μL四甲基乙二胺]、9%分離膠[3 mL丙烯酰胺(30%)、2.5 mL Tris-HCl (1.5 mol/L，pH 8.8)、4.5 mL ddH2O、50 μL 10%過硫酸銨、5 μL四甲基乙二胺]進(jìn)行非變性凝膠電泳；SDS-PAGE參照梁國(guó)棟[10]的方法進(jìn)行?？偟鞍谆蚣兓闹亟M蛋白經(jīng)電泳分離后，通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用OsSHSP17.6兔抗作為一抗，參照梁國(guó)棟[10]的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，利用eECL Western Blot試劑盒按照商家說明進(jìn)行顯色反應(yīng)，應(yīng)用Amersham imager 600(美國(guó)GE公司)成像系統(tǒng)獲取圖像信號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsSHSP17.6結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

為了研究OsSHSP17.6蛋白的特性，首先利用該蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列(158 aa)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示該蛋白含有3個(gè)α-螺旋，8個(gè)β-折疊；其C-端部分(52-143 aa)的α-晶體蛋白結(jié)構(gòu)域(α-crystallin domain，ACD)(92 aa)[11]中含有7個(gè)β-折疊(圖1-A)，這與其他小熱休克蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相似[6]；因此，我們進(jìn)一步采用同源建模方式分析該蛋白的三維結(jié)構(gòu)(圖1-B～D)，表明OsSHSP17.6蛋白中不僅存在α-螺旋(紅色部分)、β-折疊(黃色部分)結(jié)構(gòu)，還存在β-轉(zhuǎn)角(Turn)(淡藍(lán)色部分)以及其他無定形結(jié)構(gòu)(白色部分)。在結(jié)構(gòu)模型中，該蛋白還能夠形成同源二聚體(圖1-C)或寡聚體(圖1-D)，表明該蛋白可能以同源聚合的方式發(fā)揮作用。在二聚體結(jié)構(gòu)模型中，鄰近的2個(gè)OsSHSP17.6蛋白分子的ACD結(jié)構(gòu)域均形成反向平行的β-折疊且相互靠近，表明ACD結(jié)構(gòu)域及其中的β-折疊在同源互作形成二聚體過程中可能起關(guān)鍵作用；在同源十二聚體中，一個(gè)單體N-端的α-螺旋和C-端無規(guī)則區(qū)域和相鄰單體也相互靠近，表明OsSHSP17.6蛋白的N-和C-端也可能在形成寡聚體過程中起一定作用。

2.2 OsSHSP17.6載體構(gòu)建及其重組蛋白的表達(dá)分析

為了構(gòu)建OsSHSP17.6基因的原核表達(dá)載體，我們首先通過雙酶切實(shí)驗(yàn)從其克隆載體上切下目的片段，再亞克隆至原核表達(dá)載體質(zhì)粒pET-32a并導(dǎo)入大腸桿菌DH5α，雙酶切、PCR鑒定(圖2-A)一致表明插入片段大小與預(yù)期一致，測(cè)序分析進(jìn)一步表明所篩選的重組子含有目的基因片段，且閱讀框架正確，表明我們獲得正確的重組原核表達(dá)載體質(zhì)粒pET-OsSHSP17.6。為了表達(dá)OsSHSP17.6重組蛋白，重組質(zhì)粒pET-OsSHSP17.6轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株E coli BL21 (DE3) pLysS，并且在含有IPTG的條件下誘導(dǎo)表達(dá)1-3 h；收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液用于提取總蛋白，采用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)分析結(jié)果顯示(圖2-B)，在含重組質(zhì)粒pET-OsSHSP17.6的表達(dá)菌株樣品中均存在一條分子量約36 kD的條帶，這與預(yù)期重組蛋白的大小一致(推測(cè)的目的蛋白分子量約為17.6 kDa，此外表達(dá)載體 pET-32a 載體上還有一段包含有Trx-、His-、S-Tag分子量近18.2 kD的融合肽段，因此，重組蛋白的分子量約36 kD)，表明重組OsSHSP17.6蛋白已在大腸桿菌中高水平表達(dá)。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，重組蛋白的表達(dá)量也略有增加(圖2-B，第7～9泳道)。

2.3 重組OsSHSP17.6蛋白對(duì)宿主菌的保護(hù)作用分析

圖1 OsSHSP17.6二級(jí)及高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 1. Secondary and tertiary structure predictions of OsSHSP17.6.

為了確定原核表達(dá)重組OsSHSP17.6蛋白是否有活性，我們進(jìn)一步比較分析IPTG處理?xiàng)l件下含載體pET-32a和pET-OsSHSP17.6宿主菌的生長(zhǎng)特點(diǎn)。當(dāng)液體培養(yǎng)基中不加IPTG時(shí)，含pET-32a的宿主菌和含pET-OsSHSP17.6宿主菌的生長(zhǎng)曲線基本一致；當(dāng)加入IPTG時(shí)，二者的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制(圖3-A)，很顯然攜帶載體pETOsSHSP17.6宿主菌要比含pET-32a的宿主菌生長(zhǎng)得快。利用固體培養(yǎng)基進(jìn)行IPTG的處理實(shí)驗(yàn)也得到相似結(jié)果(圖3-B)，以上表明原核表達(dá)的重組OsSHSP17.6蛋白具有生物學(xué)活性，且可大幅減輕IPTG對(duì)宿主菌的生長(zhǎng)抑制作用；證實(shí)OsSHSP17.6蛋白和其他植物小熱休克蛋白相似[2,12-14]，具有增強(qiáng)細(xì)胞抗逆境脅迫能力的推測(cè)[9]。

圖2 重組質(zhì)粒pET-OsSHSP17.6的鑒定(A)及其重組表達(dá)分析(B)Fig. 2. Identification of recombinant plasmid pET-OsSHSP17.6(A) and detection of recombinant OsSHSP17.6 (B) in E. coli.

圖3 重組OsSHSP17.6蛋白的活性分析Fig. 3. Activity assays of recombinant OsSHSP17.6 protein in E. coli.

2.4 重組OsSHSP17.6蛋白的聚合特性分析

重組表達(dá)的OsSHSP17.6具有生物活性，且結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示該蛋白可能具有形成寡聚體的特性。為了確定該蛋白的存在形式，我們又采用親和層析的方法從宿主菌超聲波裂解液的上清液中提取并純化重組表達(dá)的蛋白。檢測(cè)結(jié)果顯示純化產(chǎn)物在SDS-PAGE中僅有一條與預(yù)期大小一致的特異條帶(圖4-A)，進(jìn)一步通過Western blot分析顯示該條帶可與OsSHSP17.6特異性多克隆抗體發(fā)生強(qiáng)烈的免疫學(xué)反應(yīng)(圖4-B)，表明我們獲得了純化的重組OsSHSP17.6蛋白。為了驗(yàn)證該重組蛋白是否具有同源聚合活性，我們又對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行了非變性(native)PAGE分析，結(jié)果顯示該產(chǎn)物在約70 kD處存在一條特異性條帶(圖4-C)，但在約36 kD處并沒有條帶；當(dāng)通過Western blotting檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在純化產(chǎn)物中在36 kD處也未發(fā)現(xiàn)條帶，除了在約70 kD處存在一條特異性主要條帶之外，還在高分子量(約200 kD)處存在一條弱帶(圖4-D)，根據(jù)分子量估計(jì)，推測(cè)可能是少量的同源六聚體。這些結(jié)果一致性地表明在純化的重組OsSHSP17.6蛋白不是以單體形式存在，而是主要以同源二聚體形式存在，小部分以更高同源聚合體形式存在。這與其他有關(guān)小熱休克蛋白寡聚體特性的報(bào)道一致[6,7,15]，表明異源表達(dá)的重組OsSHSP17.6蛋白具有自發(fā)的同源聚合特性。但是從本研究結(jié)果來看，異源表達(dá)的重組OsSHSP17.6蛋白主要形成同源二聚體(圖4-D)；根據(jù)三維結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)的同源十二聚體卻未檢測(cè)到。有研究表明小熱休克N-和C-端的氨基酸組成及其構(gòu)型在小熱休克分子聚合物形成過程中發(fā)揮重要功能[6,11,16-20]；前面的三維結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)表明OsSHSP17.6的N-和C-端可能在十二聚體中起重要作用，推測(cè)該重組蛋白N-端融合的Tag可能影響OsSHSP17.6的正確折疊，從而阻礙了十二聚體的形成，但確切的機(jī)制仍有待進(jìn)一步鑒定。

圖4 PAGE和Western blot分析純化的重組OsSHSP17.6蛋白Fig. 4. Assays of purified recombinant OsSHSP17.6 proteins by PAGE and Western blot.

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Heterologous Expression and Oligomeric Identification of a Small Heat Shock Protein (SHSP) from Oryza sativa

CAI Nianjun1,2, GUO Liuming1,2, LI Jing2, XIANG Congying1,2, YANG Jian2, CHEN Jianping2,*, ZHANG Hengmu2,*
(1College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China;2State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control, Key Laboratory of Biotechnology in Plant Protection of MOA and Zhejiang Province, Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;*Corresponding author, E-mail: zhhengmu@tsinghua.org.cn)

【Objective】In our previous study, a small heat shock protein gene OsSHSP17.6 was cloned from Oryza sativa and its expression was shown to be significantly up-regulated by heat shock or viral infection, suggesting that the OsSHSP17.6 could play an important role in both biotic and abiotic stress responses. In this study, our objective is to further identify the characteristics of OsSHSP17.6. 【Method】 The OsSHSP17.6 gene was sub-cloned into the plasmid pET-32a, a prokaryotic expression vector, and transformed into Escherichia coli BL21(DE3)pLysS for inducible expression. Then the recombinant protein was purified with affinity chromatography and used for native PAGE and Western-blotting assays.【Result】Its heterologous expression appeared to alleviate the poisonous effect of IPTG on the host E. coli. Native PAGE and Western-blotting assays showed that the purified recombinant OsSHSP17.6 could form homological dimers and oligomer in vitro. 【Conclusion】 Taken together, these findings supported the hypothesis that the protein should be functional molecular chaperone in vivo and indicated that OsSHPS17.6 could be involved in the stress response by its homological oligomerization, which could contribute to the functional identification of OsSHSP17.6.

small heat shock protein (SHSP); heterologous expression; oligomerization

Q755; S511.032

A

1001-7216(2017)05-0483-06

2017-01-18；修改稿收到日期: 2017-02-21。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31601603)；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LQ14C140003)。