王宏 張迎信 孫廉平 孟帥 徐鵬 吳瑋勛 程式華 曹立勇 沈希宏(中國水稻研究所/浙江省超級稻研究重點實驗室/水稻生物學國家重點實驗室，杭州 311401；共同第一作者；通訊聯系人， E-mail: caoliyong@caas.cn，xihongshen@126.com)

控制水稻金黃色穎殼與節(jié)間基因OsCAD2的圖位克隆

王宏#張迎信#孫廉平 孟帥 徐鵬 吳瑋勛 程式華 曹立勇*沈希宏*
(中國水稻研究所/浙江省超級稻研究重點實驗室/水稻生物學國家重點實驗室，杭州 311401；#共同第一作者；*通訊聯系人， E-mail: caoliyong@caas.cn，xihongshen@126.com)

【目的】水稻色素不僅對其自身生長發(fā)育有重要生理作用，而且在水稻育種、農副產品改良等方面運用比較廣泛。對水稻色素相關基因進行表型分析和基因定位，為進一步研究色素代謝途徑及調控機理奠定基礎。【方法】利用EMS誘變粳稻長粒粳(CLJ)，在突變體庫內篩選到一個金黃色穎殼與節(jié)間突變體gh881；在成熟期，測定野生型與gh881的主要農藝性狀；將gh881與野生型及中恢8015雜交，觀察BC1F1及F1植株表型，并對BC1F2及F2表型分離進行卡方檢驗，對gh881進行遺傳分析；利用F2群體和圖位克隆的方法對gh881突變基因進行定位；采用qPCR檢測穎殼顏色相關基因在gh881與野生型不同發(fā)育時期的幼穗、節(jié)間以及劍葉葉鞘的相對表達量?！窘Y果】與野生型相比，突變體的穎殼與節(jié)間均呈金黃色；除單株有效穗數外，gh881突變體的株高、每穗總粒數及實粒數、結實率和千粒重等性狀均極顯著降低。遺傳分析和基因定位結果表明，gh881的突變表型受1對隱性核基因控制，位于第2染色體短臂，并最終將該基因精細定位于標記FH-13和RH-25之間，物理距離約33.2 kb，該區(qū)域中包含4個開放閱讀框(ORFs)?！窘Y論】序列分析結果表明，發(fā)現其中一個編碼肉桂醇脫氫酶(CAD)的基因OsCAD2(Os02g0187800)的 3 563 bp處發(fā)生了1個單堿基突變(G轉換為A)，導致該基因編碼區(qū)的第297位氨基酸由甘氨酸突變?yōu)樘於彼?，由此認為該突變體為OsCAD2基因單堿基突變的新等位基因。qRT-PCR結果表明，突變體的節(jié)間中OsCAD2相對表達量極顯著下調，而在劍葉葉鞘及穗部則基本都是極顯著增加，其他相關基因也發(fā)生顯著變化，證實OsCAD2是木質素代謝中的重要基因，且可能與其他相關基因存在反饋調節(jié)。

水稻；色素；突變體；穎殼；節(jié)間；基因定位

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，為人類提供了超過21%的能量[1]，而植物色素的組成及代謝不僅對水稻生長發(fā)育具有重要意義，而且對水稻農副產品再利用具有重要價值。植物色素是植物體內次級代謝產物之一，其主要成分是類黃酮，而水稻顏色的變化一般認為是類黃酮化合物成分與代謝的影響[2,3]。水稻中，金黃色穎殼與節(jié)間顏色的變化同時受類黃酮化合物和木質素的成分與代謝共同影響[4-8]。這兩類物質合成都是由苯丙氨酸在苯丙氨酸裂解酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)催化形成肉桂酸開始的，肉桂酸經肉桂酸-4-羥基化酶(cinnamate 4-hydroxylase, C4H)催化形成香豆酸。此后，類黃酮化合物和木質素類物質分別以不同的代謝途徑合成并轉化。一方面，香豆酸可進一步形成香豆酰輔酶A，并與丙二酰輔酶A經查耳酮合酶(chalcone synthase, CHS)催化形成查耳酮，一部分查耳酮直接作為黃銅的前體物質，另一部分可經查耳酮異構酶(chalcone isomerase, CHI)催化形成黃烷酮以作為異黃酮的前體物質[9]；另一方面，香豆酸可在一系列關鍵酶的作用下形成木質素前體物質香豆醇(p-coumaryl alcohol)、松柏醇(coniferyl alcohol)和芥子醇(sinapyl alcohol)，進而形成木質素[10]。

與類黃酮化合物與木質素代謝途徑相關且引起水稻穎殼顏色變化的已克隆的基因主要有3個。位于水稻第3染色體上、黃酮類化合物代謝途徑中的一個重要基因查耳酮異構酶(chalcone isomerase，CHI)基因OsCHI，在Dasheng轉座子插入突變體gh1中，OsCHI基因完全不表達，導致gh1穎殼和節(jié)間中總類黃酮物質含量劇增，表現為穎殼與節(jié)間均為金黃色[4]。褐色穎殼抑制因子IBF1編碼一個包含Kelch重復序列結構域F-box蛋白，在類黃酮化合物生物合成過程中，作為抑制劑，能夠抑制褐色素在水稻穎殼溝紋中沉積[5]。肉桂醇脫氫酶(cinnamyl-alcohol dehydrogenase, CAD)基因OsCAD2具有強脫氫酶活性，是參與木質素前體物質松柏醇(coniferyl alcohol)和芥子醇(sinapyl alcohol)的合成所必需的，主要負責水稻莖稈木質素單體生物合成，該基因定位在第2染色體上，在gh2中，由于OsCAD2突變，使得木質素含量和組成變化，從而出現水稻金黃色穎殼與節(jié)間表型[6-8]。此外，通過水稻全基因組預測和圖位克隆的方法，已陸續(xù)報道了gh3[11]、gh5[12]和gh6[13]等金黃色穎殼與節(jié)間突變體，但相關基因尚未克隆。

此外，類黃酮化合物和木質素代謝途徑中的相關基因通過調控這兩種物質的成分與代謝，還可影響水稻正常的生長發(fā)育。水稻4-香豆酸:輔酶A連接酶基因Os4CL3，作為單木質醇類和黃酮類生物合成中苯丙素代謝途徑中的一個關鍵酶，抑制Os4CL3 表達導致植株變矮、木質素含量顯著降低并伴隨水稻育性降低；可能是木質素合成受阻，導致花粉囊發(fā)育異常引起[14]。另一個苯丙氨酸裂解酶基因OsPAL4，處于類黃酮化合物和木質素代謝途徑上游，直接影響水稻的廣譜抗病性，其突變可增加植株對白葉枯病、紋枯病和稻瘟病的敏感性[15]。另外，OsMYB48轉錄因子作為木質素調控途徑中的正調控子，當該基因表達量上升后，能夠一定程度上導致木質素結構基因上調[16]。

水稻穎殼顏色作為谷粒的一個重要性狀之一，不僅可作為最為直觀的形態(tài)學標記[17]，制種上用于色選，而且對該類基因調控類黃酮化合物和木質素合成與代謝過程的分子機理研究具有十分重要的生物學意義。本研究對一個金黃色穎殼與節(jié)間突變體gh881進行了表型鑒定及其目的基因的分離與定位研究，同時利用qPCR對該基因及水稻木質素與黃酮類物質代謝相關基因進行表達分析，以充分認識該基因對穎殼、節(jié)間及劍葉葉鞘發(fā)育的影響，為進一步明確該基因功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

常規(guī)品種粳稻長粒粳經1%甲基磺酸乙脂(EMS)誘變后，在其M2群體中鑒定出穩(wěn)定遺傳的兼有金黃色穎殼與節(jié)間表型的突變體gh881。

1.2 遺傳分析及定位群體的構建

2015年春季于海南陵水收獲突變體種子，當年夏季種植于浙江富陽，以gh881為母本，與野生型和秈稻中恢8015分別雜交；冬季于海南陵水種植BC1F1、F1，觀察BC1F1、F1植株和穗部表型并混合收獲；2016年夏于浙江富陽種植BC2F2、F2群體，于抽穗期觀察植株表型并統(tǒng)計野生型與突變型的分離比例。BC1F1、F1、BC2F2、F2群體用于遺傳分析及基因定位。所有材料的種植管理均參照常規(guī)。

1.3 表型及兩親本間重要農藝行性狀的考查

表型的考查在分離群體BC2F2中進行，在成熟期目測考查穎殼與節(jié)間顏色。于孕穗期，在gh881與野生型植株中，觀察穎殼、節(jié)間及劍葉葉鞘顏色的動態(tài)變化；完熟期，隨機各取10株，主要考查包括千粒重、單株有效穗數、每穗總粒數、每穗實粒數和株高等農藝性狀。利用SAS軟件一般線性模型進行兩者間農藝性狀的差異顯著性檢驗[18]。

1.4 DNA的提取

于抽穗期，取長粒粳、gh881、中恢8015以及F2群體植株中944個隱性單株的葉片，并隨機選取10株顯性植株的適量葉片，采用改良的CTAB法提取全基因組DNA[19]。

1.5 目的基因的精細定位及候選基因分析

基因定位采用傳統(tǒng)的圖位克隆方法。首先，對本實驗室519對SSR公共引物及166對InDel標記檢測gh881與中恢8015之間基因組DNA的多態(tài)性。隨機選取F2群體中10個隱性單株及10個顯性單株的DNA等量混合，形成隱性單株DNA混池和顯性單株DNA混池；并選取出均勻分布在水稻12條染色體的分子標記對隱性單株DNA混池和顯性單株DNA混池進行PCR擴增，在隱性單株DNA混池中檢測出發(fā)生連鎖的分子標記，再利用77個隱性單株驗證這些連鎖標記以確定這些分子標記與突變位點的連鎖關系，初步定位目的基因的候選區(qū)間。在此基礎上，基于網站Gramene(http://www. gramene.org/) 公布的秈稻93-11和粳稻日本晴全基因組序列，對初定位區(qū)間內的序列進行比對，尋找兩者之間的插入/缺失(InDel)位點，利用軟件Primer Premier 5.0設計InDel引物并篩選雙親間具有多態(tài)性的標記(表1)，對目的基因進行精細定位。

基于網站水稻基因組注釋工程數據庫(http://rapdb.dna.affrc.go.jp)預測精細定位區(qū)間內的所有開放閱讀框(open reading frame, ORF)，根據其全長序列，設計測序引物，采用高保真DNA聚合酶KOD-Plus-Neo分別擴增gh881突變體與野生型開放閱讀框的基因組序列，并結合序列比對(MegAlign，DNASTAR-Lasergene 6)結果與測序峰圖(SeqMan，DNASTAR-Lasergene 6)對比，確定突變位點，進一步確定目的基因。

1.6 木質素與類黃酮化合物代謝相關基因表達分析

采用qPCR檢測穎殼顏色相關基因在gh881與野生型不同發(fā)育時期的幼穗、節(jié)間以及劍葉葉鞘的時空表達差異。利用TIANGEN植物組織總RNA提取試劑盒分別提取WT與突變體gh881不同時期幼穗、節(jié)間和劍葉葉鞘的總RNA，采用QIAGEN去基因組DNA試劑盒(RNase-Free DNase Set)去除基因組DNA后，采用實時定量PCR逆轉錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Master Mix，TOYOBO)進行第1鏈cDNA的合成。最后，采用TAKARA SYBR qPCR Mix的反應體系在Roche Light Cycle 480上進行qPCR。內參基因為OsActin1(登錄號為LOC_Os03g08020)。針對黃酮類化合物與木質素生物合成途徑，我們選取其中的幾個關鍵酶基因及一個轉錄因子利用qPCR進行表達分析，檢測目標基因包括：OsMYB48、Os4CL、OsCHI[4]、OsCAD2[6]和OsPAL4[15]。

表1 本研究所用的引物Table 1. Primers used in this study.

2 結果與分析

2.1 突變體gh881表型特征

成熟期，野生型長粒粳的谷粒穎殼為正常的淡黃色，節(jié)間也表現為正常的淺綠色；但突變體gh881的谷粒穎殼與節(jié)間均呈現金黃色(圖1)。在主要農藝性狀方面，除單株有效穗數與野生型沒有顯著差異外，突變體gh881株高、結實率、每穗總粒數、每穗實粒數和千粒重等主要農藝性狀均極顯著降低(表2)，可能由于突變體內穎殼和節(jié)間顏色變化導致其正常的光合作用受到影響，從而影響了正常的生長發(fā)育和產量形成。

2.2 突變體gh881表型發(fā)育進程分析

圖1 突變體gh881的表型分析Fig. 1. Phenotype analysis of mutant gh881.

表2 野生型與gh881的主要農藝性狀比較(平均值±標準差, n=10)Table 2. Comparison of main agronomic traits between gh881 and its wild type(WT)(Mean±SD, n=10).

圖2 gh881與野生型(WT)各個時期穗部、節(jié)間以及劍葉葉鞘顏色的變化與對比Fig. 2. Panicle, internode and flag leaf sheath color in various developmental periods of gh881 and its wild type(WT).

參照程式華等[20]水稻稻穗分化發(fā)育各期形態(tài)特征的鑒別方法，分別觀察野生型和gh881突變體抽穗前15 d(S1)、抽穗前7 d(S2)、抽穗前3 d左右(S3)以及始穗期(S4)和開花當日(S5)五個時期的小穗、節(jié)間以及劍葉葉鞘的顏色變化情況(圖2)。結果發(fā)現，野生型穗部顏色變化正常，從S1到S5期，由白色逐漸轉變?yōu)檎５那嗑G色(圖2-A)，而在gh881中，S1時期的穗部顏色與野生型并無明顯差異，均為乳白色(圖2-A)；自S2時期開始，突變體的穗部顏色開始轉變?yōu)辄S色，而這個差異首先在芒上開始出現(圖2-A，圖2-B-Ⅰ、Ⅱ，顏色變化黑色箭頭所示)；至S3時期，在野生型穎殼顏色由白轉綠的過程中(圖2-A-S3，圖2-B-Ⅴ，Ⅵ)，突變體gh881的穎殼則表現為一種黃綠中間色(圖2-B-Ⅲ、Ⅳ)；此過程一直延續(xù)至始穗期，gh881穗部(包括穎殼、芒以及枝梗)基本都變?yōu)榻瘘S色(圖2-A)，僅穗底部的部分小穗仍在進行由白轉黃的轉變(圖2-B-Ⅶ、Ⅷ)；至開花當日，穗部基本全部抽出，突變體的穗部顏色全部都轉換為金黃色(圖2-A)，此后整個穎殼都表現為更明顯的金黃色。

表3 gh881位點的遺傳分析Table 3. Segregation of gh881 locus.

在此轉變過程中，野生型劍葉葉鞘顏色變化一直處于由基部的白色轉為淺綠色、再向青綠色轉變(圖2-C)；但突變體gh881的劍葉葉鞘在S1到S3等3個時期則是由基部的白色轉為淡黃色、并逐步轉變?yōu)榻瘘S色(圖2-C)，而在始穗期和開花期又逐漸變?yōu)榈S色(圖2-C)。而整個過程中，野生型的節(jié)間都呈現為淺綠色，gh881節(jié)間則為金黃色(圖2-D)。

2.3 金黃色穎殼與節(jié)間基因的遺傳分析和圖位克隆

針對以上表型，分別觀察BC1F1、F1、植株和BC2F2和F2分離群體內穎殼和節(jié)間的表型并統(tǒng)計其分離比，發(fā)現BC1F1、F1植株的穎殼顏色和節(jié)間以及劍葉葉鞘顏色均與野生型相同，而在gh881分別與野生型和中恢8015雜交所得的BC2F2和F2群體中各觀察1000個單株，野生型和突變型的分離比例經卡方檢驗結果顯示(表3)，該突變表型符合3∶1分離比，表明該金黃色穎殼與節(jié)間表型受1對隱性核基因控制。

對實驗室內519對SSR引物[21]與166對InDel引物[22]進行gh881與中恢8015之間的多態(tài)性篩選，共獲得160對均勻分布在水稻12條染色體且在雙親間具有多態(tài)性的分子標記，利用這些標記對的突變型DNA混池和野生型DNA混池進行連鎖，發(fā)現兩池間在第2染色體短臂的分子標記RM4355和RM12729間發(fā)生了偏分離，緊接著利用77個單株對這兩個標記進行連鎖驗證并確定了該初定位區(qū)間，遺傳距離約9.9 cM。進一步在此區(qū)間內開發(fā)了9對多態(tài)性InDel分子標記(表1)，利用944個隱性單株，最終將GH881位點鎖定在FH-13和RH-25之間，物理距離約33.2 kb(圖3-A)。

2.4 候選基因分析

基于水稻基因組注釋工程數據庫(http://rapdb.dna.affrc.go.jp)所公布的日本晴(Nipponbare)全基因組序列，對上述鎖定的33.2 kb區(qū)間內所預測的的4個開放閱讀框(ORFs)進行序列分析(圖3-A)，對這四個ORF設計測序引物進行PCR擴增其基因全長序列，經測序比對發(fā)現，其中第3個ORF(Os02g0187800)編碼一個肉桂醇脫氫酶(cinnamyl-alcohol dehydrogenase)，是合成木質素前體物質必不可少的，該基因突變可導致水稻金黃色穎殼與節(jié)間表型[6]；該基因包含4個外顯子和3個內含子，編碼363個氨基酸；gh881突變體在其第4外顯子的第3 563位堿基處發(fā)生了一個單堿基的轉換(G→A)(圖3-B、C)，從而導致其第297位氨基酸由原來的甘氨酸(Gly)突變?yōu)樘於彼?Asp)(圖3-C)。因此，推測gh881的突變表型是由OsCAD2基因(Os02g0187800)單堿基突變所致。

2.5 木質素和類黃酮化合物代謝相關基因的表達分析

通過qPCR 檢測野生型和突變體中木質素和類黃酮化合物代謝相關基因的表達。與野生型相比，突變體中包括OsCAD2在內的5個基因在S1時期的幼穗中的表達量均顯著上調(圖4-A)；S2和S3時期，除OsMYB48表現為顯著下調外，其他基因均顯著上調，尤其OsPAL4的表達量上調極為顯著，分別高達9.4倍和3.6倍(圖4-B、C)；至S4時期，OsPAL4的表達量仍呈現較高的上調模式，OsMYB48則表現為顯著下調，而其他基因沒有顯著差異(圖4-D)。在突變體的節(jié)間中則呈現不同的表達模式，OsCHI的表達顯著上調、OsMYB48 無顯著差異外，其他基因均顯著下調(圖4-E)；在其劍葉葉鞘中5個基因均呈極顯著上調模式(圖4-F)?？梢姡蛔凅w中OsCAD2基因的隱性突變會引起其植株體內木質素與類黃酮化合物代謝相關基因在不同發(fā)育時期幼穗和組織中表達模式的改變，而且此效應在劍葉葉鞘中最為顯著。

圖3 gh881突變基因的圖位克隆Fig. 3. Map-based cloning of the gh881 mutant gene.

3 討論

本研究針對一個由長粒粳化學突變而來的金黃色穎殼與節(jié)間突變體gh881，對其開展表型分析和突變位點的基因定位研究。結果表明，該表型受1對隱性核基因控制，位于第2染色體短臂的一個肉桂醇脫氫酶基因OsCAD2的第4外顯子內發(fā)生了一個單堿基的轉換(G→A)，此結果符合EMS化學誘變常出現(G→A或C→T)[23]的誘變結果；該單堿基突變導致其第297個氨基酸由甘氨酸轉變?yōu)樘於彼酇sp。而甘氨酸是非極性脂肪族類氨基酸，疏水性強，天冬氨酸則是極性R基帶負電荷的氨基酸，親水性強，還易形成氫鍵，由于兩種不同性質的氨基酸之間的變化，可能導致CAD蛋白空間三維構象變化及其底物結合位點的變化，從而使得其蛋白功能顯著下調。因此，我們認為OsCAD2單堿基的轉換突變是導致gh881金黃色穎殼與節(jié)間以及劍葉葉鞘表型的原因。

水稻金黃色穎殼和節(jié)間突變體gh2是由于OsCAD2基因編碼的蛋白序列內第185位甘氨酸突變?yōu)樘於彼幔渌谕蛔兾稽c僅包含2個結構域[聚酮化合物合酶和烯酰還原酶結構域和NAD(P)-結合域][24-27]，導致其CAD酶活性降低、且檢測不到SAD活性，使得對-羥基苯基木質素、愈創(chuàng)木基木質素和紫丁香木基木質素幾乎均顯著減少，出現金黃色穎殼和節(jié)間，但是并不影響突變體的正常生長發(fā)育[6]。而本研究中的突變體gh881的隱性突變導致其第297位氨基酸同樣由甘氨酸突變?yōu)樘於彼?，但該位點存在于多個結構域中，不僅包括聚酮化合物合酶和烯酰還原酶結構域，還包括NAD(P)-結合域和C-末端醇脫氫酶結構域[24-27]。因此，其效應比gh2中的突變更強，這也是本研究中的gh881突變體不僅表現為穎殼、節(jié)間和劍葉葉鞘的金黃色，其結實率、千粒重等產量性狀也受到了嚴重影響，可見OsCAD2基因不同位點的突變不僅會引起水稻植株組織器官轉為金黃色，還會影響其正常的生長發(fā)育(表2)。

圖4 qPCR檢測野生與gh881中相關基因的表達Fig. 4. Expression analysis of genes associated with golden hull and lignin metabolic pathway by qPCR in WT and the gh881 mutant.

結合qPCR分析，我們觀察了gh881穗部發(fā)育4個時期、節(jié)間及劍葉葉鞘顏色的變化。首先，所檢測的木質素及類黃酮化合物相關基因在穗部、節(jié)間及劍葉葉鞘均有表達，且集中在幼穗發(fā)育早期，而其表達量在突變體內的更早時期就出現了上調，說明木質素的積累可能先于gh881穗部表型的變化，這與前人研究結果一致[8]。其次，在幼穗發(fā)育的早期(S1)這些基因的上調表達量差異最為顯著、S2及S3表達量差異逐漸縮??；至抽穗期(S4)，除OsPAL4外，其他基因的表達量與野生型基本無差異，gh881穗部的金黃色表型在S4時期基本穩(wěn)定也與此趨勢基本一致。另外，由于gh881中基因OsCAD2突變，該基因在節(jié)間與劍葉葉鞘表達量分別是顯著下調和極顯著上調，且導致木質素和類黃酮化合物代謝途徑中相關基因表現為同樣的趨勢，其中，在劍葉葉鞘中影響效應最為顯著，可見該基因突變能夠影響節(jié)間與劍葉葉鞘木質素和類黃酮物質的代謝。突變體中OsCAD2基因突變會引起其植株體內木質素合成基因與類黃酮化合物代謝相關基因表達模式的改變(OsPAL4始終極顯著變化以及轉錄因子OsMYB48表達量變化等)，進一步證明OsCAD2在水稻植物色素相關物質尤其是木質素類物質合成與代謝中具有重要作用，且可能反饋調節(jié)其他相關基因表達。

木質素是水稻次級代謝產物之一，其含量不僅影響水稻對旱澇、細菌或病毒等生物與非生物脅迫的抗性[28-30]，還影響其農副產品屬性，如其秸稈可以作為飼料、造紙和生物燃料的制備等[31,32]。本研究針對突變體gh881的表型分析和OsCAD2基因的定位，為進一步研究其參與木質素代謝及調控機理奠定了堅實基礎；也為進一步結合分子標記輔助選擇技術選育適當木質素含量的水稻新品種以增強水稻新品種的抗逆性、改善水稻農副產品屬性，提供了優(yōu)異的種質資源。

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Map-Based Cloning of OsCAD2 Regulating Golden Hull and Internode in Rice

WANG Hong#, ZHANG Yingxin#, SUN Lianping, MENG Shuai, XU Peng, WU Weixun, CHENG Shihua, CAO Liyong*, SHEN Xihong*
(China National Rice Research Institute/State Key Laboratory of Rice Biology/Key Laboratory for Zhejiang Super Rice Research, Hangzhou 311401, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: caolycgf@mail.hz.zj.cn, xihongshen@126.com)

【Objective】Rice pigments not only have important physiological effects on their own development, but also have been widely used in rice breeding, by-product improvement, and so on. Phenotypic analysis and gene mapping of pigment-related genes could lay the foundation for the further study of rice pigments metabolism and regulation mechanism.【Method】A golden hull and internode rice mutant, gh881, was isolated from an elite japonica cultivar Changlijing (CLJ) using ethyl methane sulphonate(EMS) mutagenesis strategy；the main agricultural traits of gh881 and its wild type(WT) were measured at mature stage; we crossed gh881 with WT and ZH8015, respectively, followed by observation of F1and BC1F1plants phenotype, and we made genetic analysis using Chi-square test in BC1F2population and gene mapping using map-based cloning in F2population; the related-genes expression of young panicles, internodes and flag leaf sheaths of gh881 and WT at various stages were studied by qPCR. 【Result】Compared with wild type, gh881 exhibited golden hull and internode at the mature stage. Except for no significant difference in the number of panicles per plant, there were significant reduction in plant height, the seed-setting rate, the number of spikelets per panicle, the number of grains per panicle and 1000-grain weight between WT and gh881. Genetic analysis and gene fine-mapping results suggested that gh881 was controlled by a single recessive gene and the mutant gene was mapped to a region of 33.2 kb in which four open reading flames (ORFs) existed on the short arm of chromosome 2 between markers FH-13 and RH-25. 【Conclusion】Sequencing analysis revealed that a single base mutation (G to A) occurred at the site 3563 bp of OsCAD2 (Os02g0187800) encoding a Cinnamyl-Alcohol Dehydrogenase (CAD), which led to a G297D mutation (codon GGC to GAC). This implied that gh881 might carry a novel allele of OsCAD2. The quantitative real-time PCR analysis showed that the relative expression level of OsCAD2 decreased significantly in the internode, while it almost increased significantly in the flag leaf sheath and panicle, and the related-genes also almost changed significantly. These results demonstrated that OsCAD2 is an important gene involved in lignin metabolic pathway, and may regulate other related-genes expression feedback.

rice; pigment; mutant; hull; internode; gene mapping

Q343.5；S511.032

A

1001-7216(2017)05-0465-10

2016-12-23； 修改稿收到日期：2017-02-08。

國家863計劃資助項目(2014AA10A603)；浙江省糧食新品種選育重大科技專項(2016C02050-1)；中國農業(yè)科學院基本科研業(yè)務費專項(Y2016PT34)；國家公益性農業(yè)科技研究專項(201403002)；中國農業(yè)科學院創(chuàng)新工程資助項目(CAAS-ASTIP-2013-CNRRI)。