吳 可，趙文麗，李月影，邱長(zhǎng)雨，施海靜，張?jiān)伱?/p>

(徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院，江蘇 徐州 221004)

Nrf2-ARE信號(hào)通路在左乙拉西坦抗癲癇中的作用

吳 可，趙文麗，李月影，邱長(zhǎng)雨，施海靜，張?jiān)伱?/p>

(徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院，江蘇 徐州 221004)

目的探討Nrf2-ARE信號(hào)通路在左乙拉西坦抗癲癇中的作用，以及應(yīng)用左乙拉西坦對(duì)認(rèn)知功能的影響。方法成年♂ SD大鼠36只，250～300 g，隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照(control)組、戊四唑(1,5-pentamethylene-1H-tetrazole，PTZ)癲癇模型組、左乙拉西坦(levetiracetam，LEV)對(duì)照組以及左乙拉西坦治療組，每組9只。以Morris水迷宮測(cè)試大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力；用免疫印跡法測(cè)定海馬組織中Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達(dá)量。結(jié)果與癲癇模型組相比，給予左乙拉西坦治療的癲癇大鼠在Morris水迷宮測(cè)試中潛伏期明顯縮短(P<0.05)，海馬Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)均明顯增高(P<0.01)。結(jié)論左乙拉西坦能夠改善癲癇大鼠的認(rèn)知功能，其機(jī)制可能通過(guò)Nrf2-ARE通路，使HO-1、NQO1蛋白表達(dá)增多，起到抗癲癇的作用。

癲癇；Nrf2；ARE；信號(hào)通路；左乙拉西坦；認(rèn)知功能

癲癇是由腦組織局部病灶的神經(jīng)元異常高頻放電，并向周圍擴(kuò)散，導(dǎo)致大腦功能短暫失調(diào)綜合征。癲癇主要臨床表現(xiàn)為突然發(fā)作，出現(xiàn)短暫運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、意識(shí)和精神異常，并反復(fù)發(fā)作，發(fā)作時(shí)常伴有異常腦電圖。反復(fù)癲癇發(fā)作的患者常伴有認(rèn)知功能障礙。癲癇的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，迄今尚未完全闡明。氧化應(yīng)激損傷、谷氨酸興奮性毒性、鈣超載、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生等多種因素都能誘導(dǎo)神經(jīng)元異常放電，觸發(fā)癲癇。其中，氧化應(yīng)激在癲癇發(fā)病中起著重要的作用，可影響腦組織神經(jīng)元的功能，誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元的凋亡[1]，且癲癇的持續(xù)時(shí)間與氧化損傷呈正相關(guān)。有研究表明，部分抗癲癇藥物可以通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激系統(tǒng)改善癲癇患者的癥狀。

Nrf2/ARE通路是機(jī)體抵抗內(nèi)、外界氧化和化學(xué)等刺激的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2]，其核心分子包括核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element, ARE)和胞質(zhì)蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白 1(Kelch ECH associating protein 1,Keap1)。核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2屬于CNC亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族(cap-‘n’-collar subfamily of basic leucine-zipper, CNC-Bzip)，Nrf2活化還能抑制炎癥介質(zhì)的生成[3]。Keap是與Nrf2的直接結(jié)合蛋白[4]。Keap1含有5個(gè)主要結(jié)構(gòu)域，分別是氨基末端NTR、BTB、富半胱氨酸插入域IVR、雙甘氨酸重復(fù)域DGR以及羧基端CTR。其中，IVR和BTB容易進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，是調(diào)控Nrf2所必需的結(jié)構(gòu)。DGR的6個(gè)Kelch功能域形成β折疊結(jié)構(gòu)，與Nrf2的Neh2端序列結(jié)合[5]。Keap1在體內(nèi)抑制Nrf2的活性，允許Nrf2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核并增強(qiáng)ARE的反應(yīng)。ARE是一個(gè)特異的DNA 啟動(dòng)子結(jié)合序列，能被多種氧化性和親電性化合物激活，從而啟動(dòng)Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表達(dá)。

左乙拉西坦(levetiracetam, LEV)作為新型廣譜的抗癲癇藥已廣泛應(yīng)用。有研究表明，突觸囊泡蛋白SV2A是抗癲癇藥左乙拉西坦的結(jié)合位點(diǎn)[6]，其作用機(jī)制為阻斷突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的有效釋放[7]，但其確切機(jī)制并未完全明確。左乙拉西坦可以扭轉(zhuǎn)鋅等負(fù)變構(gòu)調(diào)節(jié)劑對(duì)γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和甘氨酸門(mén)控電流的抑制作用，可以抑制三磷酸肌醇受體 (inositol triphosphate receptor,IP3R)和蘭尼堿受體(ryanodine receptor, RyR)介導(dǎo)的鈣離子釋放[8]，還可以減少鉀電流，這些都與其抗癲癇作用相關(guān)。左乙拉西坦在癲癇等疾病中還有神經(jīng)保護(hù)作用，且能改善顱腦損傷后的認(rèn)知[9]。

本實(shí)驗(yàn)旨在探討左乙拉西坦抗癲癇的可能機(jī)制，明確Nrf2-ARE信號(hào)通路在左乙拉西坦抗癲癇中的作用。有研究表明，抗癲癇藥苯巴比妥鈉對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能有損害[10]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)水迷宮模型探討左乙拉西坦對(duì)認(rèn)知功能的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年SD大鼠36只，♂，體質(zhì)量250～300 g，由山東濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(魯)20140007。大鼠置于晝夜(12 h/12 h)節(jié)律光照條件下，室溫(23±1)℃，自由飲水和攝食，所有大鼠實(shí)驗(yàn)前靜養(yǎng)1周。

1.2實(shí)驗(yàn)分組隨機(jī)將大鼠分為4組，每組9只。生理鹽水對(duì)照(Control)組：0.9% 生理鹽水(normalsaline, NS)+0.9% NS；戊四唑(pentylenetetrazole, PTZ)癲癇模型組：0.9% NS+戊四唑；左乙拉西坦(LEV)對(duì)照組：LEV(20 g·L-1)+0.9% NS；左乙拉西坦(LEV)治療組：LEV(20 g·L-1)+戊四唑。大鼠首先用8號(hào)灌胃針進(jìn)行灌胃，灌胃物質(zhì)為分組中的前一試劑，劑量均為10 mL·kg-1。灌胃30 min后，以分組中的后一試劑進(jìn)行腹腔注射，大約于每天上午8 ∶00～10 ∶00進(jìn)行，劑量均為2 mL·kg-1。以上各組動(dòng)物平均體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.3儀器與試劑Morris水迷宮購(gòu)自上海軟隆科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。左乙拉西坦片購(gòu)自優(yōu)時(shí)比制藥有限公司；戊四唑購(gòu)自Aladdin公司；抗Nrf2 (Lot:GR249953-6)、抗HO-1 (Lot:GR96795-23)、抗NQO1抗體 (Lot:GR195043-8)，均購(gòu)自Abcam艾美捷科技有限公司。

1.4大鼠癲癇模型制備大鼠于每天上午8 ∶00～10 ∶00腹腔注射濃度為15 g·L-1的戊四唑溶液，連續(xù)28 d。模型成功與否以其發(fā)作時(shí)的行為變化為主要依據(jù)，按Racine分級(jí)，0級(jí)：無(wú)任何反應(yīng)；1級(jí)：面部陣攣，包括眨眼、動(dòng)須、節(jié)奏性咀嚼等；2級(jí)：1級(jí)加節(jié)律性點(diǎn)頭；3級(jí)：2級(jí)加前肢陣攣；4級(jí)：3級(jí)加后肢站立；5級(jí)：4級(jí)加摔倒。達(dá)到4～5級(jí)的大鼠選用，未達(dá)到4級(jí)的淘汰[11]。

1.5Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮為直徑125 cm、高50 cm的圓形水池，水深30 cm，水溫保持(26.0±1.0)℃。池壁上有象征4個(gè)象限的不同標(biāo)志，在一個(gè)象限的正中離池壁33 cm處放一個(gè)直徑9 cm、高28 cm的黑色平臺(tái)，平臺(tái)頂?shù)陀谒?5 cm。訓(xùn)練期間迷宮外參照物保持不變。Morris水迷宮測(cè)試大鼠對(duì)水迷宮的學(xué)習(xí)和記憶能力。定位航行實(shí)驗(yàn)：將水池等分為4個(gè)象限，目標(biāo)象限的中央放置一隱匿平臺(tái)，定位航行實(shí)驗(yàn)共歷經(jīng)5 d。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前l(fā) d，讓大鼠放入水池(不含平臺(tái))自由游泳2 min，d 2開(kāi)始每天分上、下午兩個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段訓(xùn)練4次。每個(gè)時(shí)間段分別從池壁2個(gè)起點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水池，記錄每次找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期，escape latency)和游泳路徑。如大鼠在60 s內(nèi)找不到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺(tái)，潛伏期記為 60 s，每次間隔 4 min 讓大鼠休息，再行下次實(shí)驗(yàn)[12]。

1.6Western blot 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，后斷頭，取雙側(cè)海馬。將取出的海馬放入預(yù)冷的裂解液中，在冰上使用電動(dòng)勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，每個(gè)樣本勻漿4次，每次10 s，間隔10 s冷卻，充分裂解后離心。BCA法對(duì)裂解后的蛋白濃度進(jìn)行定量，隨后加入5×上樣緩沖液(總體積1/4)，放入沸水中煮沸15 min促進(jìn)蛋白變性。配制10%或者12%的膠進(jìn)行恒壓電泳，電壓設(shè)置為：濃縮膠70 V， 35 min；分離膠110 V， 90～120 min。電泳結(jié)束后，采用PVDF膜冰上進(jìn)行恒壓轉(zhuǎn)膜，100 V， 75 min。轉(zhuǎn)膜后，3% BSA封閉2 h，加入抗Nrf2、HO-1、NQO1 (1 ∶250)、GAPDH(1 ∶2 000)一抗孵育，4℃過(guò)夜。Washing buffer，搖床5 min×3次，加入堿性磷酸酶羊抗兔或羊抗小鼠二抗(1 ∶2 000，Abcam公司，英國(guó))，室溫孵育2 h。二抗孵育后，Washing buffer，搖床5min×3次，顯色，采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

2.1左乙拉西坦對(duì)癲癇大鼠認(rèn)知功能的影響在Morris水迷宮測(cè)試中，各組大鼠給藥后d 1的逃避潛伏期無(wú)明顯差別，d 2、3、4、5的潛伏期均開(kāi)始縮短(Fig 1A)。PTZ模型組總潛伏期相對(duì)于正常對(duì)照組明顯提高(P<0.01，F(xiàn)ig 1B)，表明大鼠癲癇模型制備成功；而LEV治療組可以明顯逆轉(zhuǎn)此改變，降低大鼠逃避潛伏期(P<0.05，F(xiàn)ig 1B)，表明應(yīng)用左乙拉西坦可以改善癲癇大鼠的認(rèn)知功能。

2.2Nrf2在左乙拉西坦抗癲癇中的表達(dá)變化Fig 2結(jié)果顯示，與control相比，PTZ致癲癇模型組海馬的Nrf2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，說(shuō)明在此模型中Nrf2介導(dǎo)的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減弱；而給予左乙拉西坦治療后，與control組、PTZ模型組相比，海馬Nrf2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)，表明左乙拉西坦可能通過(guò)加強(qiáng)Nrf2通路的表達(dá)起到抗癲癇的作用。2.3HO-1在左乙拉西坦抗癲癇中的作用Fig 3結(jié)果顯示，與control組相比，PTZ致癲癇模型組海馬的HO-1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；給予左乙拉西坦治療后，與control組、PTZ模型組相比，海馬HO-1蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步明顯增高(P<0.01)，表明左乙拉西坦治療后進(jìn)一步升高的HO-1可能參與了抗癲癇作用。

Fig 1 The escape latency of S-D rats in training test

A: The change tendency of escape latency in rats during 5 days; B: Changes of total escape latency of rats in 5 days.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsPTZ group

Fig 2 Expressions of hippocampus Nrf2 in rats

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsPTZ group

Fig 3 Expressions of hippocampus HO-1 in rats

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsPTZ group

2.4NQO1在左乙拉西坦抗癲癇中的作用Fig 4結(jié)果顯示，與control組相比，PTZ致癲癇模型組海馬水平的NQO1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；給予左乙拉西坦治療后，與control組、PTZ模型組相比，海馬NQO1蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步明顯增高(P<0.01)，表明左乙拉西坦治療后進(jìn)一步升高的 NQO1可能參與了抗癲癇作用。

Fig 4 Expressions of hippocampus NQO1 in rats

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsPTZ group

3 討論

作為神經(jīng)科僅次于頭疼的第二大常見(jiàn)病，癲癇的預(yù)防和治療已成為醫(yī)學(xué)界的焦點(diǎn)問(wèn)題，癲癇對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶損害機(jī)制并未明了。既往的研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)癲癇發(fā)作可以導(dǎo)致海馬結(jié)構(gòu)發(fā)生病理變化，包括海馬神經(jīng)元的變性壞死、突觸間隙異常增寬及突觸后膜的密度改變、海馬異常苔蘚樣發(fā)芽以及由此導(dǎo)致的突觸聯(lián)系異常，與學(xué)習(xí)記憶聯(lián)系緊密的N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA)受體表達(dá)分布異常、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常等。

Nrf2/ARE通路是機(jī)體抵抗內(nèi)外界氧化和化學(xué)等刺激的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，生理狀態(tài)下，Nrf2與Keap1相偶聯(lián)，且Keap1與胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白結(jié)合而被錨定在胞質(zhì)。Keap1還會(huì)促進(jìn)Nrf2被泛素蛋白酶迅速降解保持低活性。而當(dāng)Keap1構(gòu)象變化，通過(guò)直接磷酸化或減少降解，競(jìng)爭(zhēng)性抑制等方式均可激動(dòng)Nrf2。Nrf2與Keap1解離，半衰期延長(zhǎng)，以穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。與小Maf蛋白結(jié)合形成異二聚體，然后識(shí)別ARE上DNA序列(GCTGAGTCA)，并與之結(jié)合形成復(fù)合物，誘導(dǎo)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因的表達(dá)。包括血紅素氧化酶(hemeoxygenase-1，HO-1)、醌氧化還原酶[quinone oxidoreductase，NAD(P)H]以及其它參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的基因[13]。HO-1和NADH是該通路編碼的重要的抗氧化酶。HO-1、 NADH含量升高，提高了細(xì)胞的氧化應(yīng)激及修復(fù)功能。由此可見(jiàn)，真正發(fā)揮作用的Nrf2是在入核以后，但胞核的Nrf2表達(dá)過(guò)少，而以往有文獻(xiàn)指出，總Nrf2也可以間接反映各組間Nrf2表達(dá)變化的差別[14]。所以，我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中以總Nrf2作為各組間比較的對(duì)象，間接反映各組間Nrf2表達(dá)的不同。

在癲癇發(fā)作時(shí)，可以誘導(dǎo)海馬組織中Nrf和其編碼的基因產(chǎn)物HO-1和NQO1在蛋白和基因水平表達(dá)明顯增強(qiáng)。LEV作為新型廣譜的抗癲癇藥已廣泛應(yīng)用，但其抗癲癇機(jī)制并未完全明確。有研究表明，LEV對(duì)癲癇患者氧化應(yīng)激系統(tǒng)有作用，但未探明到底通過(guò)何種途徑影響。上述已知機(jī)體可通過(guò)上調(diào)Nrf2，提高抗氧化水平和降低氧化產(chǎn)物水平，同時(shí)，Nrf2-ARE通路對(duì)認(rèn)知功能的影響，提示LEV是否可以通過(guò)此通路起到抗癲癇作用，從而對(duì)癲癇患者認(rèn)知障礙有改善作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，給予LEV的癲癇大鼠潛伏期明顯縮短，海馬Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)明顯增高，提示LEV可能通過(guò)上調(diào)Nrf2，提高抗氧化水平和降低氧化產(chǎn)物水平。針對(duì)在Western blot結(jié)果中，在模型組中，Nrf2的表達(dá)是減少的，而其下游蛋白HO-1和NQO-1的表達(dá)是增多的結(jié)果，有研究表明HO-1基因的表達(dá)受多條通路的調(diào)控，其調(diào)控位點(diǎn)包括ABi序列、HSE區(qū)域、USF位點(diǎn)、NF-κB位點(diǎn)、E-box部位、STAP3/AP識(shí)別位點(diǎn)、Nrf2結(jié)構(gòu)、UTR結(jié)構(gòu)等多個(gè)方面[15]，調(diào)控HO-1基因表達(dá)的上游通路較多，所以我們暫且保留本實(shí)驗(yàn)條件下的結(jié)果，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將繼續(xù)探討。

針對(duì)癲癇患者常伴有認(rèn)知功能障礙，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的Morris 水迷宮是神經(jīng)生物學(xué)研究動(dòng)物空間學(xué)習(xí)、記憶功能常用的行為學(xué)檢測(cè)方法，能夠較準(zhǔn)確地反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以視覺(jué)為基礎(chǔ)的空間學(xué)習(xí)、記憶、定向及定位能力的變化。與對(duì)照組相比，模型組潛伏期明顯延長(zhǎng)，與模型組相比，治療組潛伏期明顯縮短，表明LEV對(duì)癲癇大鼠的認(rèn)知功能也有一定的改善作用。且本實(shí)驗(yàn)采用的PTZ點(diǎn)燃癲癇模型，有組織學(xué)分析揭示該模型引起的海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元丟失和齒狀回苔蘚纖維發(fā)芽與人類癲癇極其相似。同時(shí)，也有研究表明該模型大鼠海馬p38蛋白表達(dá)減少，而p38作為突觸前終末特異性標(biāo)記物, 用來(lái)檢測(cè)突觸的密度和分布, 是神經(jīng)元功能狀態(tài)的標(biāo)示物之一，這說(shuō)明PTZ 點(diǎn)燃癲癇可能引起海馬突觸前膜突觸囊泡數(shù)量減少及功能受損、突觸活動(dòng)減弱、神經(jīng)遞質(zhì)合成與釋放減少等一系列變化,從而導(dǎo)致了認(rèn)知功能障礙[16]。這為癲癇后認(rèn)知功能障礙機(jī)制的探討提供了有力證據(jù)。但癲癇后認(rèn)知功能障礙機(jī)制復(fù)雜,還需要進(jìn)一步的探索和研究。

綜上所述，左乙拉西坦能改善癲癇大鼠的認(rèn)知功能，左乙拉西坦可能通過(guò)Nrf2-ARE通路使HO-1、NQO1蛋白含量表達(dá)增多，起到抗癲癇的作用。

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EffectsofNrf2-AREsignalpathonlevrtiracetamanti-epilepticandlevrtiracetamonlearningandmemorizingability

WU Ke, ZHAO Wen-li, LI Yue-ying, QIU Chang-yu, SHI Hai-jing, ZHANG Yong-mei

(SchoolofAnesthesiology,XuzhouMedicalUniverity,XuzhouJiangsu221004,China)

AimTo explore the effects of Nrf2-ARE signal path on levrtiracetam anti-epileptic and levrtiracetam on learning and memorizing ability.MethodsThirty-six SD rats were divided into normal saline group, levrtiracetam group, model group and treatment group. Each group recruited nine rats. Tests of Morries water maze were given to the rats to evaluate their learning and memorizing ability. The protein expression of nuclear factor (erythroid-derived2)-like2 (Nrf2), heme oxygenase 1(HO-1) and NAD(P)H quinone oxidoreductase(NQO1) were examined by Western blot.ResultsCompared with model group, levrtiracetam could shorten the plateau period in epileptic rats (P<0.05), and increase the expression of Nrf2 protein, HO-1 protein and NQO1 protein in hippocampus(P<0.05).ConclusionsLevrtiracetam could improve the learning and memorizing ability in epileptic rats. Levrtiracetam may increase the expression of HO-1 protein and NQO1 protein through the Nrf2-ARE pathway and play a part in antiepileptic effects.

epilepsia; Nrf2; ARE; signal path; levrtiracetam; learning and memorizing ability

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.026

A

：1001-1978(2017)10-1462-05

R-332；R322.81；R338.64；R742.1；R971.6

時(shí)間：2017-9-5 9:26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.052.html

2017-04-20,

2017-07-24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81171041)；江蘇省高校自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No 13KJA320001)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No BK20161171)；江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(No 201610313039Y)；江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項(xiàng)目(No PPZY2015A066)

吳 可(1995-)，男，研究方向：疼痛信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)控，E-mail:742296844@qq.com； 張?jiān)伱?1970-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：疼痛信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)控，通訊作者，E-mail: zhangym700@xzhmu.com.cn