袁保紅，黃 萍，鄧鑫夢，王柯英，戴良成，尹 輝

( 1. 廣東藥科大學基礎學院，廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006; 2. 廣東工業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院，廣東 廣州 510006; 3. 廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣東 廣州 510080)

黃芪甲苷在盲腸末端結扎穿孔誘導膿毒癥小鼠中的保護作用研究

袁保紅1，黃 萍1，鄧鑫夢1，王柯英2，戴良成3，尹 輝1

( 1. 廣東藥科大學基礎學院，廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006; 2. 廣東工業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院，廣東 廣州 510006; 3. 廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣東 廣州 510080)

黃芪甲苷；膿毒血癥；中性粒細胞；CLP；CXCR2；免疫調(diào)節(jié)

膿毒癥是機體對病原體感染的免疫應答紊亂而導致危及生命的多器官功能障礙[1]。若感染未能有效控制，可發(fā)展為膿毒癥休克和多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[2]。膿毒癥的發(fā)病機制涉及到復雜的全身系統(tǒng)性炎癥反應及宿主對不同感染病原體及其毒素的異常反應等多個方面[3-5]。中性粒細胞作為固有免疫重要成員，在機體抗病原體感染中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)已知，在嚴重膿毒癥患者中,中性粒細胞向感染部位趨化功能降低，導致不能及時控制感染的惡化。

黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ, AS-Ⅳ)作為中藥黃芪的主要活性成分，具有多種藥理作用，如抗糖尿病、心血管疾病、糖尿病腎病等[6]。AS-Ⅳ參與抗菌作用逐漸得以認識，但其具體的作用機制尚未清楚。本文通過建立盲腸末端結扎穿孔(cecal ligation and puncture, CLP)誘導膿毒癥小鼠模型，探討AS-Ⅳ在重癥細菌感染中的免疫保護作用，為研究其免疫調(diào)節(jié)機制及中藥靶向藥物研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級C57BL/6近交系小鼠，♂，體質(zhì)量(20±2)g，6～8周齡，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2008-0002。所有動物實驗均嚴格遵守廣東藥科大學動物倫理保護指導進行。

1.1.2藥物與試劑 AS-Ⅳ分析標準品(純度≥98%，阿拉丁公司)；Percoll(美國Sigma)；anti-CXCR2-Alexa Fluor 647、PE anti-mouse CD11b、FITC anti-mouse Ly-6G(美國Biolegend)；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco)。

1.1.3儀器 臺式高速冷凍離心機 (型號：5810R，德國Eppendorf)；細胞培養(yǎng)箱(型號：3110，美國Thermo)；流式細胞儀FACS CALIBUR(美國BD)。

1.2方法

1.2.1CLP誘導膿毒癥模型的建立與給藥 ♂ SPF級C57BL/6小鼠隨機分為3組：Sham組、CLP組、CLP+AS-Ⅳ組，每組均為10只。造模術前2 d，灌胃給予AS-Ⅳ(10 mg·kg-1)，對照組給予等劑量生理鹽水。按照Miyaji等[7]方法建立CLP模型。Sham組小鼠，除盲腸不結扎和穿刺外，其余操作與手術組相同。術后密切觀察小鼠狀態(tài)，記錄小鼠存活情況。

1.2.2臟器組織HE染色 無菌操作，摘取小鼠肺、肝臟、腎臟，多聚甲醛固定后，石蠟切片，進行HE染色[8]。

1.2.3血液、腹腔液和臟器細菌負荷量的測定 CLP組和CLP+AS-Ⅳ組小鼠眼眶取血，收集血液樣品，用生理鹽水稀釋后，在血平板上涂布；將2 mL無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)注入腹腔，收集腹腔灌洗液，倍比稀釋后在血平板上涂布；摘取小鼠肺、肝、腎臟勻漿，倍比稀釋后，在血平板上涂布。37℃孵育24 h后，計數(shù)菌落，并以每毫升(CFU·mL-1)的菌落形成單位表達。

1.2.4流式細胞術檢測中性粒細胞表面趨化因子受體CXCR2(CXC chemokine receptor 2,CXCR2)表達 取100 μL小鼠外周血，加入anti-CXCR2、anti-CD11b、anti-mouse Ly-6G抗體，避光孵育30 min；裂解紅細胞，staining buffer洗滌后，加400 μL staining buffer重懸中性粒細胞，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，流式細胞儀檢測中性粒細胞表面CXCR2表達。

1.2.5中性粒細胞的分離純化 參照文獻[9]，采用Percoll密度梯度離心分離小鼠外周血和腹腔灌洗液的中性粒細胞。制備78%、69%和52% Percoll密度梯度，外周血加至Percoll液面，1 200×g離心30 min；在69%～78%界面部分收集中性粒細胞。1.2.6中性粒細胞趨化功能 中性粒細胞分為3組：PBS對照組、LPS組、LPS+AS-Ⅳ組，每組含5×105個細胞。AS-Ⅳ(30 mg·L-1)預處理1 h后，加入LPS(1 mg·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)1 h；隨后將中性粒細胞轉(zhuǎn)移至Transwell小室，下室加入含30 μg·L-1巨噬細胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2，MIP2)的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 h；Transwell趨化膜經(jīng)多聚甲醛固定，結晶紫染色后，顯微鏡觀察遷移的中性粒細胞數(shù)目。

1.2.7中性粒細胞體外殺傷功能 AS-Ⅳ(30 mg·L-1)加至1×106中性粒細胞懸液，預孵育1 h；E.coli濃度調(diào)整為2.5×1010CFU·L-1，加10% FBS孵育30 min；按細胞 ∶細菌=10 ∶1比例進行混合培養(yǎng)，37℃孵育2 h；倍比稀釋，涂布LB平板，37℃過夜培養(yǎng)，進行細菌總數(shù)測定。

2 結果

2.1AS-Ⅳ對膿毒癥小鼠存活率的影響假手術組小鼠飲食活動正常；CLP小鼠出現(xiàn)活動減少，精神萎靡，肛周有糞便黏連等系列癥狀，而AS-Ⅳ組小鼠從飲食、精神狀態(tài)等方面均明顯改善。如Fig 1所示，經(jīng)AS-Ⅳ治療的膿毒血癥小鼠存活率較對照組小鼠明顯上升，70 h后對照組存活率僅為30%，而AS-Ⅳ組小鼠仍有60%存活。

Fig 1 Survival curve of mice after CLP (n=10)

*P<0.05vsCLP group

2.2組織器官病理學變化CLP小鼠24 h后取肝、肺、腎進行組織病理學檢測。CLP小鼠各器官有不同程度的損傷，其中肺組織的病理損傷最為明顯。光鏡下觀察Sham組肺組織結構完整、肺泡腔清晰且肺泡壁無充血，肺間質(zhì)較少炎細胞浸潤；CLP組肺泡壁彌漫性增厚合并部分肺泡壁破壞，較多炎細胞浸潤、部分肺泡出血和結構破壞；CLP+AS-Ⅳ組病理改變較CLP組明顯減輕(Fig 2)。

Fig 2 Changes of pulmonary pathology in mice after CLPA: Sham group; B: CLP group; C: CLP+ AS-Ⅳ group

2.3AS-Ⅳ對膿毒癥小鼠血液、腹腔液和臟器細菌負荷量的影響盲腸結扎穿孔后，腸道內(nèi)的細菌流出，造成腹腔感染，且細菌入血造成全身感染。在感染后6、24 h，經(jīng)AS-Ⅳ預處理的小鼠腹腔液和血液中細菌數(shù)量明顯減少。同時，在感染24 h后，AS-Ⅳ預處理的小鼠肝、肺、腎等臟器中細菌數(shù)量也明顯降低，差異有顯著性(P<0.05)，見Fig 3。

Fig 3 Bacterial loads in blood, peritoneal fluid andorganelle after CLP in septic mice(±s, n=5)

Bacterial loads in blood (A) and peritoneal fluid (B) at 6 and 24 h after CLP; C: Bacterial loads in different organs at 24 h after CLP.*P<0.05vsPBS-treated group.

2.4AS-Ⅳ對膿毒癥小鼠中性粒細胞數(shù)目及血液中性粒細胞趨化功能的影響相比于CLP組，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腹腔灌洗液中的中性粒細胞(CD11b+Ly6Ghi)的數(shù)量明顯升高(P<0.05，F(xiàn)ig 4A)。Sham組小鼠中性粒細胞趨化因子受體CXCR2表達為67.54%，CLP組小鼠為14.10%，而AS-Ⅳ處理后，CXCR2表達為39.53%。結果顯示，CLP組小鼠中性粒細胞趨化因子受體CXCR2表達明顯降低，而AS-Ⅳ預處理后可抑制CXCR2表達下調(diào)(Fig 4B)。

Fig 4 Number of CD11b+Ly6Ghi neutrophils andCXCR2 expression in peritoneal fluid

A: The number of CD11b+Ly6Ghineutrophils at 6 and 24 h after CLP; B: CXCR2 expression on the cell surface of neutrophils.*P<0.05vsCLP group

2.5AS-Ⅳ對中性粒細胞趨化功能的影響Fig 5體外實驗顯示，在靜息狀態(tài)中性粒細胞表面趨化因子受體CXCR2呈高水平表達。在LPS刺激時，中性粒細胞表面CXCR2表達降低，AS-Ⅳ處理后阻止LPS介導的中性粒細胞表面CXCR2下調(diào)。

2.6AS-Ⅳ對中性粒細胞殺傷功能的影響如Fig 6所示，中性粒細胞經(jīng)AS-Ⅳ預處理，隨后加入E.coli孵育2 h后，中性粒細胞對E.coli的殺菌作用明顯增強(P<0.05)。

3 結論

膿毒癥病因機制復雜，可由任何部位的感染引起，其綜合征是機體免疫應答失調(diào)引起，包括早期不受控制的全身性炎癥和晚期免疫抑制狀態(tài)延長[10]。膿毒血癥誘導的免疫功能障礙主要特征為抗炎/促炎因子失衡、巨噬細胞提呈抗原功能受損、淋巴細胞快速凋亡及中性粒細胞向感染部位趨化能力降低，導致不能及時控制感染的惡化[11]。中性粒細胞在外周血液中含量最為豐富，在固有免疫中起重要作用。中性粒細胞在激活后，通過吞噬、殺傷病原微生物并釋放可溶性介質(zhì)，誘導單核細胞進一步募集到炎癥部位發(fā)揮作用。中性粒細胞數(shù)量受到嚴密調(diào)控，趨化因子及其受體在中性粒細胞釋放與骨髓滯留平衡中發(fā)揮關鍵性調(diào)節(jié)作用。中性粒細胞表面主要趨化因子受體有CXCR2和CXCR4，當骨髓內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的CXCL1、CXCL2與相應受體CXCR2結合，中性粒細胞從骨髓進入血液循環(huán)。中性粒細胞到達感染部位后，識別病原微生物并將其攝入胞內(nèi)，通過脫顆粒和“呼吸爆發(fā)”等方式殺滅病原體[12-13]。

Fig 5 Effects of AS-Ⅳ on neutrophil chemotaxis(n=5)

Neutrophil surface CXCR2 expression (A) and chemotaxis to CXCL2 (B) were determined.*P<0.05vsLPS group

Fig 6 Effects of AS-Ⅳ on bactericidal ability of neutrophils(n=4)

*P<0.05vsPBS-treated group

臨床和動物研究結果表明AS-Ⅳ黃芪甲苷能上調(diào)LPS致急性肺損傷(acute lung injury，ALI)大鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中中性粒細胞數(shù)，并增強水通道蛋白(aquaporins 5,AQP5)蛋白的表達，對肺部感染有保護作用[14]。在急性大腸桿菌腹腔感染小鼠模型中，我們首次證實AS-Ⅳ預處理可增加體內(nèi)細菌清除率，提高小鼠存活率[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，AS-Ⅳ明顯延長膿毒癥小鼠存活時間，其抗菌作用與阻止細菌感染所致中性粒細胞表面CXCR2表達下調(diào)，從而增加中性粒細胞趨化能力相關。AS-Ⅳ處理后，CLP小鼠外周血、腹腔液及臟器中細菌負荷量均明顯減少，與上調(diào)中性粒細胞吞噬殺菌能力相關，可潛在解釋AS-Ⅳ在膿毒癥小鼠中的免疫保護作用，但其具體殺菌機制還有待進一步研究。

(致謝：本實驗于廣東藥科大學廣東省生物活性藥物研究重點實驗室完成，感謝所有老師和同學的幫助和支持！)

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StudyonprotectiveeffectofastragalosideⅣinsepticmice

YUAN Bao-hong1, HUANG Ping1, DENG Xin-meng1, WANG Ke-ying2, DAI Liang-cheng3, YIN Hui1

(1.GuangdongProvinceKeyLabofPharmaceuticalBioactiveSubstances,SchoolofBasicCourses,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering,GuangdongUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China; 3.IntensiveCareUnit,theFirstAffiliatedHospitalofGuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510080,China)

AimTo study the effect of astragaloside (AS-Ⅳ) in CLP-induced septic mice.MethodsC57BL/6 mice were randomly divided into the sham group, CLP group and CLP+ AS-Ⅳ group. Two days before operation, AS-Ⅳ (10 mg·kg-1) solution was intragastrically administered into CLP +AS-Ⅳ group, and the other groups were treated with normal saline. A sepsis model was established by cecal ligation and puncture (CLP). Blood, peritoneal fluid and tissue organs were collected at 6 h and 24 h. Neutrophils of blood were purified by Percoll density gradient. Transwell was used to detect the chemotaxis function of neutrophils. The killing activity of neutrophils was detected by coculture withE.coli.ResultsThe survival rate of AS-Ⅳ-pretreated septic mice significantly increased. The number of neutrophils in peritoneal fluid was enhanced markedly. The number of bacteria in the peritoneal fluid, blood and tissue organs such as liver, lung and kidney significantly decreased after AS-Ⅳ pretreatment. The chemotaxis and killing activity of neutrophils increased significantly in AS-Ⅳ-treated mice (P<0.05).ConclusionAstragaloside displays an immunoprotective effect in CLP-induced septic mice, which is related to the upregulation of CXCR2 expression on neutrophils and the increase of neutrophil antibacterial activity.

astragaloside; sepsis; neutrophils; CLP; CXCR2; immunoregulation

：目的研究黃芪甲苷(astragaloside，AS-Ⅳ)在盲腸末端結扎穿孔(cecal ligation and puncture, CLP)誘導膿毒癥小鼠中的免疫保護作用。方法將C57BL/6小鼠隨機分成假手術組、CLP組、CLP+AS-Ⅳ組。造模術前2 d，CLP+AS-Ⅳ組灌胃給予AS-Ⅳ(10 mg·kg-1)，對照組給予等量生理鹽水。建立小鼠CLP誘導的膿毒血癥模型，在6、24 h分別取血液、腹腔液和組織器官進行細菌總數(shù)測定；采用Percoll密度梯度分離純化外周血中性粒細胞，用Transwell法檢測小鼠中性粒細胞的趨化功能；與E.coli混合培養(yǎng)檢測中性粒細胞的殺菌功能。結果AS-Ⅳ預處理的膿毒癥小鼠存活率明顯上升，腹腔液中性粒細胞數(shù)目明顯增加；AS-Ⅳ處理后小鼠腹腔液、血液及肝、肺、腎等臟器中細菌負荷量明顯降低；AS-Ⅳ預處理的中性粒細胞趨化和殺菌功能增強。結論黃芪甲苷對CLP誘導膿毒癥小鼠具有免疫保護作用，其機制與上調(diào)中性粒細胞趨化因子受體CXCR2表達，增加中性粒細胞抗菌功能相關。

時間：2017-9-5 9:26 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.048.html

2017-04-20,

2017-07-25

廣東省醫(yī)學科學技術研究基金(No A2016226)；廣東省自然科學基金資助項目(No 2014A030313581，2015A030313581)

袁保紅(1971-)，男，碩士，講師，研究方向：炎癥、感染和免疫學，E-mail：yuanbaohong@gdpu.edu.cn； 尹 輝( 1975-)，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向：炎癥相關免疫學，通訊作者，E-mail：huiyin0103@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.024

A

：1001-1978(2017)10-1452-05

R-332；R284.1；R329.24；R392.11；R631.101；R631.201；R978